Name: Meso-escala Particle Image Velocimetry estudos de Neurovascular flui em Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprenda a fabricar fantomas neurovasculares transparentes e caracterizar fluxos usando PIV em escala meso. Este método acessível utiliza equipamentos comuns de laboratório para avançar pesquisas em hemodinâmica e interações com dispositivos vasculares.

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Os autores reconhecem suporte parcial para este projeto fornecido por uma concessão de semente colaborativo do escritório de pesquisa e desenvolvimento económico em UC Riverside.

1. fabricação do molde Sacrificial ABS-baseado
<ol><li>Desenha um modelo inverso do fantasma tecido desejado utilizando software CAD.</li>
	<li>Imprima o modelo usando uma impressora 3-d com ABS como o material de construção.</li>
</ol>2. com base em PDMS Vascular fabricação de fantasma
<ol><li>
Mistura
	<ol>
<li>Misture a base prepolymer PDMS e agente de cura em uma proporção de 10:1 (por peso); uma mistura de 66G fornece material suficiente para a fabricação de fantasmas com volumes de até 50 cm3.</li>
		<li>Coloque a mistura num exsicador de vácuo para 60 min para desgaseificar e minimizar o aprisionamento de bolha. Use pressurização/despressurização cíclica para facilitar a ruptura da bolha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fundição
	<ol>
<li>Monte o molde impresso do ABS em um slide de vidro usando moldagem putty para selar a interface.</li>
		<li>Com cuidado, despeje a mistura PDMS no molde enquanto tenta minimizar uma armadilha de bolha. Bolhas persistentes podem ser rompidas manualmente usando uma agulha.</li>
		<li>Cure o fantasma de molde à temperatura ambiente (25 ° C) pelo menos 24 h. Nota: Em temperaturas mais altas, esse processo pode ser acelerado22.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Desmoldagem
	<ol>
<li>Dissolver o ABS por submergir o fantasma em acetona e sonicating pelo menos 15 min, usando poderes até 70 w. Atenção: A acetona tem uma alta pressão de vapor à temperatura ambiente e um baixo ponto de fulgor. Por conseguinte, sempre trabalha sob uma coifa e longe de possíveis fontes de ignição. Use equipamento de proteção pessoal adequado (por exemplo, óculos de proteção ou cara de escudo, jaleco, luvas resistentes a acetona).</li>
		<li>Enxague cuidadosamente o fantasma com álcool isopropílico e, em seguida, DI água para remover os resíduos de solventes. Nota: PDMS incha após exposição à acetona; no entanto, o inchaço diminui uma vez que o fantasma é lavado e secado suficientemente23.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Confirmação de fidelidade fantasma usando microscopia ótica
	<ol>
<li>Usando um microscópio óptico com uma câmera anexada e software de captura de imagem, capture uma imagem de um recurso crítico dentro o fantasma com uma ampliação que maximiza o recurso dentro do campo de visão.</li>
		<li>Capture uma imagem de uma retícula de calibração adequados a mesma ampliação.</li>
		<li>Carrega as duas imagens no ImageJ arrastando-os para a barra de ferramentas.</li>
		<li>Clique sobre a imagem do retículo de calibração para torná-la ativa e, em seguida, selecione a ferramenta de linha . Usando o mouse, desenhe uma linha ao longo de uma característica de uma distância conhecida e selecione análise > definir escala de no menu ImageJ. Nota: Na janela Definir escala , o campo identificado como a distância em pixels deve ser preenchido com o comprimento da linha desenhada em unidades de pixels.</li>
		<li>Digite o comprimento do recurso no campo rotulado Distância conhecidae sua unidade no campo rotulado Unidade de comprimento. Marque a caixa rotulada Global para aplicar este fator de calibração para todas as imagens abertas.</li>
		<li>Tornar a imagem do fantasma recurso crítico ativo e usar a ferramenta linha para desenhar uma linha ao longo de uma característica de interesse. No menu do ImageJ, selecione Analyze > medida (ou pressione Ctrl + M) para medir o comprimento da linha.</li>
		<li>Compare o valor esperado contra o valor na coluna marcada comprimento na janela de resultados para confirmar a fidelidade fantasma.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. zombar de formulação de solução de sangue
<ol><li>Misture DI água e glicerol na proporção de 60: 40 (em volume). Nota: Um volume de 100 mL é suficiente para o sistema circulatório em vitro descrito neste documento.</li>
	<li>Adicione 1 mL de solução de grânulo fluorescente de poliestireno de w/v 2.5% (ou seja, partículas de rastreamento) para a solução de sangue falso.</li>
	<li>Homogeneizar a mistura em uma placa de agitação magnética a 400 rpm por 10 minutos.</li>
</ol>4. in Vitro confi guração do sistema circulatório
<ol><li>
Bomba de set-up
	<ol>
<li>Use uma ferramenta de stripper de fio para cortar o plug DC-fim da fonte de alimentação adaptador AC-DC.</li>
		<li>Descascar o revestimento do poder e fios de terra e conectá-los para o terminal de entrada do regulador de tensão de modulação (PWM) de largura de pulso.</li>
		<li>Ligue os fios de alimentação e terreno do motor da C.C. da bomba para o terminal de saída do regulador de tensão PWM. Nota: O display de sete segmentos do PWM saídas duty cycle (0% - 100%) usado para obter uma tensão variável no motor DC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bomba de calibração
	<ol>
<li>Prepare 200 mL de solução de simulação de sangue (ver secção 3).</li>
		<li>Colocar tubo de aspiração da bomba para o béquer segurando a solução de sangue falso.</li>
		<li>Coloque o tubo de saída da bomba para um copo vazio.</li>
		<li>Selecione um ponto de ajuste do ciclo de dever desejado (0% - 100%). Carregue no botão e iniciar um timer.</li>
		<li>Para o timer uma vez que a bomba tenha transferido todo o volume de solução de sangue falso. Use este tempo para calcular a vazão volumétrica.</li>
		<li>Repita as etapas 4.2.1 - 4.2.5 pelo menos cinco diferentes dever ciclo conjunto pontos estabelecer uma curva de regressão de mínimos quadrados. Nota: É recomendado um mínimo de três pontos replicar por dever ciclo ponto de ajuste. Esta relação pode ser usada para correlacionar a taxa de fluxo desejada para o ciclo de dever PWM necessária.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. vídeo Collection
<ol><li>
Calibração de imagem
	<ol>
<li>Determine a relação de calibração para a geração de imagens de vídeo (ver secção 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Instalação de aparelhos
	<ol>
<li>Coloque o fantasma PDMS no palco do microscópio de fluorescência.</li>
		<li>Conectar o fantasma para a bomba de engrenagem e apresentar a solução de sangue falso. Nota: Opcionalmente, umectantes prefill o modelo com etanol para facilitar completo; em seguida, lave e preenchê-lo com a solução de sangue falso. Isto pode ser particularmente benéfico para os modelos com pequenas embarcações e/ou características de cegas.</li>
		<li>Defina o controlador do motor da bomba para a vazão desejada, com base na curva de calibração da bomba.</li>
		<li>Opere a bomba por 15 min antes do experimento para garantir condições de estado estacionário.</li>
		<li>Ligue a lâmpada externa para iluminar o campo de visão. Selecione um filtro apropriado com base no comprimento de onda de excitação dos grânulos fluorescentes.</li>
		<li>Ajuste o plano focal imagem do midplane de navio. Nota: Isto pode ser conseguido usando-se uma distância focal que maximiza a seção transversal de navio imagem (por exemplo, quando usando fantasmas com vaso circular seções transversais); e/ou indexação de um recurso fantasma projetado para facilitar a identificação do avião meio do navio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gravação de vídeo
	<ol>
<li>Selecione os parâmetros de gravação de vídeo para otimizar a relação sinal-ruído (SNR). Parâmetros-chave incluem o tempo de exposição, taxa de quadros e ganham. Nota: No presente protocolo, usamos uma taxa de quadros de 2.000 fps e um ganho de 1.0. No entanto, esses parâmetros podem variar com base no aplicativo (consulte a seção de discussão para mais detalhes).</li>
		<li>Recolher o vídeo e salve-o no formato AVI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Limpar fantasma
	<ol>
<li>Se o grânulo-colagem é observado após um experimento, proceda à sonicação do fantasma em uma solução aquosa de detergente usando poderes até 70 w.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. processamento e análise de dados de imagem
<ol><li>
Pré-processamento da imagem
	<ol>
<li>Arraste o arquivo AVI salvo para a janela do ImageJ para importá-lo. Marque a caixa marcada converter para escala de cinza.</li>
		<li>No menu do ImageJ , selecione Analyze > gerar histograma (ou pressione Ctrl + H) para gerar um histograma das intensidades de pixel da imagem. Tome nota da média e desvio-padrão para a imagem não processado. Nota: Em altas taxas de quadros, não é incomum para a distribuição a ser desviado pesadamente em direção a zero (ou seja, sem sinal).</li>
		<li>No menu do ImageJ , selecione imagem > ajustar > brilho e contraste (ou pressione Shift + Ctrl + H) para aplicar um filtro de brilho/contraste.</li>
		<li>No menu de brilho e contraste , pressione o botão Set para definir os limites da imagem. Defina o valor mínimo a ser o valor médio mais um desvio padrão e o valor máximo a ser a intensidade máxima da imagem (ambos baseados em estatísticas obtidas na etapa 6.1.2). Nota: Isto normalmente elimina todos, mas o top 10% das intensidades pixel. O número de desvios padrão pode variar dependendo da distribuição desejada das intensidades pixel. Um script de macro personalizado para executar a intensidade de operação de nivelamento é fornecido nos Materiais suplementares.</li>
		<li>No menu do ImageJ , selecione processo > ruído > Despeckle para reduzir o número de pixels saturados. Nota: Esta operação é exigiu o aumento potencial de saturação de pixel que surge durante a otimização do brilho e contraste, que pode produzir vetores espúrios durante posterior correlação cruzada.</li>
		<li>No menu do ImageJ , selecione processo > Filtros > Gaussian Blur com um raio de 1,5 para reduzir os artefatos decorrentes a remoção ocasional de pixels iluminadas em um 3x3 bairro pela obliquidade operação prévia.</li>
		<li>Clique na ferramenta polígono e, em seguida, clique na imagem para delinear a região de interesse (ROI).</li>
		<li>No menu do ImageJ , selecione Editar > clara fora remover o ruído do sensor em locais onde não há sinal é esperado (por exemplo, áreas além do limite da parede vaso), que pode diminuir o SNR global.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cálculo de PIV Nota: Esta parte do protocolo emprega um PIV de terceiros plug-in para ImageJ, que depende de gaussianas pico-encaixe para permitir uma estimativa de deslocamento com precisão subpixel.<ol>
<li>No menu do ImageJ , selecione Plugins > Macros > executar... e navegue até a macro salva código complementar 2. ijjm a correlação cruzada pares de imagem sucessivas. Nota: A macro procede da seguinte maneira. 1) uma correlação cruzada do campo intensidade dentro de imagens consecutivas primeiro é executada para determinar o deslocamento local de partículas traçador influienciada pela advecção (i.e., a primeira imagem par consiste as imagens primeiras e o segunda, o segundo par de imagem consiste a segunda e terceiros imagens, etc.). 2) uma avaliação de multipass duas etapas é então realizada com tamanhos de janela interrogatório inicial e final de 256 x 256 pixels e 128 x 128 pixels, respectivamente. Finalmente, 3) a macro executa uma média temporal para reduzir ainda mais a aparência de vetores espúrios.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Teste de mediana normalizado (NMT)
	<ol>
<li>No menu do ImageJ , selecione Plugins > Macros > executar... e navegue até a macro salva código complementar 3. ijjm para validar a velocidade campos através do teste normalizado mediano. Nota: A macro procede da seguinte maneira. 1) cada vetor em um campo vetorial instantânea primeiro é comparado com seus vizinhos mais próximos oito para calcular o valor mediano. 2) a matriz de erros residuais é então calculada como a diferença entre cada vetor vizinha e a mediana calculada. 3) a diferença entre o vetor sob investigação e o valor mediano de vetor vizinhas então é normalizada pelos resíduos ao longo da rodovia. 4) isto é então comparado com um valor de limiar (normalmente, 0,2 pixels), que pode ser variado com base no conhecimento um priori de ruído durante a aquisição de imagem. Finalmente, 5) uma média temporal de todos os campos do vetor instantânea validado é executada para produzir um campo composto, como isto foi mostrado para aumentar o vetor campo qualidade24.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Os autores não têm nada a declarar.

O protocolo descrito aqui contornos de um método simplificado para a realização de estudos PIV para visualizar neurovascular flui em dimensões fisiologicamente relevantes e de condições de fluxo em vitro. Ao fazê-lo, serve para complementar protocolos relatados por outras pessoas que também têm focado simplificando a quantificação de campos vetoriais, mas dentro de contextos muito diferentes que exigem que a consideração de muito maior comprimento escalas de25 ou menor fluxo taxas de<sup ...

PIV é amplamente utilizado na mecânica de fluidos experimental para a visualização fluxo e investigações quantitativas de movimentos fluidos que variam em escala de comprimento de atmosférico a fluxos microcirculatory1,2,3. Enquanto os detalhes de sua implementação podem variar tão amplamente como suas aplicações, um aspecto comum a quase todos os estudos PIV é o uso da imagem de vídeo de partículas de traçador semeado dentro do fluido de trabalho, seguido por uma análise por pares de quadros de imagens consecutivas para extrair as características de fluxo desejada. Normalmente, isso é realizado pela primeira subdividindo cada quadro de imagem em regiões menores denominadas janelas de interrogatório. Como consequência as posições aleatórias das partículas dispersas, cada janela de interrogatório contém uma única distribuição de intensidades de pixel. Se a taxa de aquisição de dados e tamanho de janela é escolhida apropriadamente, correlação cruzada do sinal de intensidade em cada janela pode ser usada para estimar o deslocamento médio dentro dessa região. Finalmente, dado que a ampliação e a taxa de quadros são conhecidos parâmetros experimentais, um campo vetorial de velocidade instantânea pode ser facilmente calculado.
Uma grande vantagem do PIV sobre técnicas de medição de ponto único é a sua capacidade para mapear campos vetoriais em um domínio de duas ou três dimensões. Aplicações de hemodinâmicas, em particular, se beneficiaram com esse recurso, uma vez que permite uma investigação minuciosa dos fluxos locais, que são conhecidas por desempenhar um papel significativo na doença vascular ou remodelação (por exemplo, aterosclerose, angiogênese) 4 , 5 , 6. isto também foi verdade para a avaliação dos fluxos neurovascular, e suas interações com dispositivos endovasculares (por exemplo, desviadores de fluxo, stents, bobinas de intrasaccular), desde os comprimento-escalas relevantes em tais aplicações podem muitas vezes abrangem uma ou mais ordens de grandeza (por exemplo, do micrômetro em milímetro) e geometria do dispositivo e colocação pode significativamente impactar o local mecânica dos fluidos7.
A maioria dos grupos de estudos baseados em PIV hemodinâmica têm invocado experimentais set-ups que intimamente imitam algumas das primeiras investigações de stent influência no fluxo vascular7,8. Normalmente, estes incluem um) pulsado lasers e câmeras de alta velocidade, para capturar os fluxos de alta velocidade; b) sincronizadores, para evitar serrilhado entre a frequência de pulso do laser e a taxa de quadros de aquisição de câmera; c) óptica cilíndrica, para formar uma folha de luz e, assim, minimizar a fluorescência de fundo de partículas marcador acima e abaixo do plano do interrogatório; d) no caso de sistemas comerciais de turn-key, pacotes de software proprietário, para realizar as análises de correlação cruzada. No entanto, embora alguns aplicativos exigem o desempenho e/ou versatilidade oferecidas coletivamente por estes componentes, muitos outros não o faz. Além disso, o alto custo do tecido comercialmente origem fantasmas que recapitular desejadas estruturas vasculares também podem provar limitantes para muitos estudos em vitro , particularmente para fantasmas com apresenta essa ponte o regime de mesoescala (> 500 USD / fantasma). Neste documento, nós relatamos o desenvolvimento de um protocolo simplificado pela execução PIV para a visualização em vitro de fluxos neurovascular, que normalmente estão ambos espacialmente e temporalmente dentro do regime de mesoescala (i.e., escalas de comprimento variando de submillimeter milímetros, e velocidades de até dezenas de milímetros/segundo). O protocolo visa alavancar recursos já à disposição de muitos pesquisadores de bioengenharia, diminuindo assim a barreira de entrada para nonexperts.
O primeiro elemento do presente protocolo envolve o uso de uma técnica de fundição de investimento para permitir a fabricação in-house de transparente, polidimetilsiloxano (PDMS)-com base em espectros de tecido de 3-D-impresso moldes sacrificiais. Aproveitando a crescente disponibilidade de impressoras 3-d nos últimos anos, particularmente aqueles em compartilhado/multi-usuário instalações (por exemplo, instalações institucionais ou makerspaces pública), esta metodologia corta custos significativamente (p. ex., < 100 USD/fantasma no caso apresentado aqui), permitindo uma rápida reviravolta para a fabricação de uma ampla variedade de projetos e geometrias. No protocolo atual, um depoimento fundido, sistema de modelagem é usado com acrilonitrila-butadieno-estireno (ABS) como o material de construção, e a parte impressa serve como um sacrifício molde para a fundição de fantasma subsequente. Nossa experiência tem mostrado que ABS é well-suited para tal uso, já que é solúvel em solventes comuns (por exemplo, acetona), e tem suficiente força e rigidez para manter a integridade do molde após a remoção do suporte material (por exemplo, para Evite a deformação ou fratura das características do molde diminutivo). No actual protocolo, integridade de molde é mais assegurada usando sólidos modelos impressos, embora isso vem à custa do tempo de dissolução de aumento. O uso de modelos ocos pode também ser possível em alguns casos, para melhorar o acesso de solvente e assim, reduzir o tempo de dissolução. No entanto, cuidadosa consideração deve ser dada ao efeito isto pode ter na integridade do molde. Finalmente, enquanto os phantoms fabricados neste documento são baseados em representações idealizadas de estruturas neurovasculares geradas usando um pacote de software de desenho assistido por computador (CAD) comum, o protocolo deverá ser favorável para a fabricação de mais complexo , geometrias específicas do paciente também (por exemplo, através do uso de arquivos de modelo gerado pela conversão de dados clínicos de imagem para o. Formato de arquivo STL usado pela maioria das impressoras 3-d). Para mais informações sobre o processo de fabricação fantasma são fornecidas na secção 2 do protocolo.
O segundo elemento do protocolo envolve o uso de um plug-in para ImageJ realizar as análises de correlação cruzada9abr-fonte. Este é acoplado com a implementação de um regime de limiarização estatística simples (ou seja, intensidade tampando)10 para melhorar o sinal de imagem antes da correlação cruzada, bem como um esquema de validação postcorrelation vector, o normalizado teste de mediana (NMT), para eliminar vetores espúrios, através de uma comparação de cada um de seus mais próximos vizinhos11. Coletivamente, isso permite que a imagem para ser realizado usando equipamentos comumente encontrado em muitos laboratórios de bioengenharia, eliminando assim a necessidade de aquisição de muitos dos componentes dos sistemas típicos de PIV (por exemplo, laser pulsado, caros sincronizador, óptica cilíndrica e software proprietário). Para mais informações sobre a coleção de vídeos, processamento de imagem e análise de dados são fornecidas nas seções 5 e 6 do protocolo.
A Figura 1 ilustra a afinação PIV, usada no presente protocolo, que depende de um microscópio de fluorescência, equipado com uma câmera de alta velocidade de imagem, bem como externo, fonte de luz branca contínua (ou seja, lâmpada de iodetos metálicos) para iluminação volumétrica através da objectiva. Uma bomba de engrenagem de velocidade variável é usada para impor o fluxo de recirculação de solução transparente sangue simulado através dos phantoms de tecido neurovascular. A solução é composta de uma mistura de 60: 40 de deionizada (DI) água e glicerol, que é um substituto comum para o sangue na hemodinâmica estuda12,13,14, devido a um) sua densidade e viscosidade (ou seja, semelhantes 1.080 kg/m3 e 3,5 cP vs 1.050 kg/m3 e 3-5 cP para o sangue)15,,16; b) sua transparência na faixa visível; c) o seu índice de refração similar como PDMS (1.38 vs 1,42 para PDMS)17,18,19,20, que minimiza a distorção óptica; d) a facilidade com que comportamento não-newtonianos pode ser introduzido, se necessário, através da adição de xanthane21. Finalmente, esferas de poliestireno fluorescentes são usadas como partículas traçador (10,3 µm de diâmetro; 480 nm/501 nm excitação/emissão). Enquanto neutra flutuantes grânulos são desejados, sourcing partículas traçador com óptimas propriedades mecânicas fluidas (por exemplo, densidade, tamanho, composição) e o comprimento de onda de emissão pode constituir um desafio. Por exemplo, os grânulos usados aqui são ligeiramente menos densos que a solução de glicerol (1.050 kg/m3 vs 1.080 kg/m3). No entanto, os efeitos hidrodinâmicos, dos mesmos, são negligenciáveis, dado que a duração de um experimento típico é muito menor do que a escala de tempo associada com efeitos de flutuabilidade (i.e., 5 min e 20 min, respectivamente). Mais detalhes sobre o sangue simulado solução formulação e in vitro sistema circulatório set-up são fornecidos nas seções 3 e 4 do protocolo.

<table><tbody><tr><td>Software CAD Solidworks 2015</td><td>Dassault Systems</td><td>N/A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit Dow Corning Sylgard 184 Adesivo</td><td>Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KIT 3.9KG</td><td>Kit PDMS</td></tr><tr><td>Impressora 3D</td><td>Stratasys Dimension Elite</td><td>Stratasys</td><td>9180-00105</td></tr><tr><td>P430 Modelo Material Cartucho</td> Material de construção ABS <td>Stratasys</td><td>340-21202</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>P400 SR Material de Suporte Solúvel Cartucho</td><td>Stratasys</td><td>340-30200</td><td>Material de Suporte</td></tr><tr><td>CleanStation DT3</td><td>PM3 Technologies</td><td>00-00300R</td><td>Base bath</td></tr><tr><td>Lindberg Blue M LGO Box Furnace&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>LB305745M</td><td>Forno</td></tr><tr><td>21G BD PrecisionGlide Agulha</td><td>Betcon Dickenson</td><td>BD 305167</td><td>Segmento de molde perfurador ramificado</td></tr><tr><td>Dessecador (Vácuo)</td> <td>Polylab</td><td>55205</td><td>Dessecador</td></tr><tr><td>Branson 1800 Utrasonic Limpeza</td><td>Branson</td><td>CPX-952-116R</td><td>Sonicador</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Chemical</td><td>A9494</td><td>Acetona</td></tr><tr><td>Álcool Isopropol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A4514</td><td>Álcool Isopropol</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Chemical</td><td>GW33500</td><td>Glicerol</td></tr><tr><td>10um Poliestireno Amarelo-Verde Partículas Fluorescentes</td><td>Magsphere</td><td>PSF-010UM</td><td>Contas fluorescentes</td></tr><tr><td>Phantom Miro&nbsp;</td><td>Vision Research</td><td>Miro M310</td><td>Microbomba de câmera de alta velocidade</td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>81101</td><td>Bomba de recirculação</td></tr><tr><td>Leica DM2000</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM2000</td><td>Microscópio fluorescente</td></tr><tr><td>Leica 10X Objetiva</td><td>Leica Microsystems</td><td>506259</td><td>Objetiva para perfurador</td></tr><tr><td>Objetiva Leica 2.5X Objetiva</td><td>Leica Microsystems</td><td>11506083</td><td> saco de aneurisma</td></tr><tr><td>Leica Blue Filter Cube L5</td><td>Leica Microsystems</td><td>513840</td><td>Blue filter cube</td></tr><tr><td>Leica EL6000</td><td>Leica Microsystems</td><td>11504115</td><td>Fonte de luz</td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc</td><td>1104-1</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>Software de análise de imagem de código aberto https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Velocimetria de imagem de partículas Plugin PIV</td><td>Qingson Tseng</td><td>N/A</td><td>https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv</td></tr></tbody></table>

meso-escala particle image velocimetry estudos de neurovascular flui em vitro

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Velocimetria por imagem (PIV) é usada em uma ampla variedade de campos, devido a oportunidade que prevê precisamente Visualizar e quantificar os fluxos através de uma grande gama de spatiotemporal. No entanto, sua implementação geralmente requer o uso de instrumentação caro e especializado, o que limita sua utilidade mais ampla. Além disso, dentro do campo da bioengenharia, em vitro estudos de visualização de fluxo também são frequentemente mais limitado pelo alto custo dos espectros de tecido comercialmente origem que recapitular desejadas estruturas anatômicas, particularmente para aqueles que abrangem o regime de mesoescala (ou seja, submillimeter para escalas de comprimento milímetro). Neste documento, apresentamos um protocolo experimental simplificado desenvolvido para lidar com essas limitações, os elementos-chave dos quais incluem 1) um método de custo relativamente baixo para a fabricação de mesoescala espectros de tecido usando impressão 3-d e carcaça do silicone e 2) uma quadro de análise e processamento de imagem de código-fonte aberto que reduz a demanda sobre a instrumentação para medir os fluxos de mesoescala (ou seja, velocidades de até dezenas de milímetros/segundo). Coletivamente, isso diminui a barreira de entrada para nonexperts, aproveitando recursos já à disposição de muitos pesquisadores de bioengenharia. Nós demonstratethe aplicabilidade do presente protocolo no âmbito da caracterização do fluxo neurovascular; no entanto, espera-se que seja relevante para uma ampla gama de aplicações de mesoescala em Bioengenharia e além.

A Figura 2 ilustra o processo de fabricação de fantasma de tecido PDMS. Os phantoms projetados neste documento destinam-se para o estudo do fluxo em aneurismas idealizados de pescoço largo, sacular, intracranianas, bem como artérias de perforator ramificação proximal. Design adicional importantes características incluem 1) um reservatório comum que todos os navios que desaguam, para garantir o egresso fluido livre do phantom - caso contrário, formação de gotí...

Aqui nós apresentamos métodos simplificados para fabricar fantasmas neurovascular transparente e caracterizando o fluxo nele. Destaca-se vários parâmetros importantes e demonstrar sua relação com a precisão do campo.

Meso-escala Particle Image Velocimetry estudos de Neurovascular flui em Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da bioengenharia, especificamente aquelas relativas à hemodinâmica e suas interações com dispositivos intervasculares. A principal vantagem dessa técnica é que ela faz uso de equipamentos já encontrados na maioria dos laboratórios de bioengenharia e isso pode ajudar a reduzir a barreira de entrada para não especialistas. Misture a base prepolímero PDMS em agente de cura em uma razão de 10 para um por peso.Uma mistura de 66 gramas fornece material suficiente para a fabricação de fantasmas com volumes de até 50 centímetros cúbicos. Coloque a mistura em um desiccador a vácuo por 60 minutos para desconstrução e minimize a armadilha da bolha. Use a pressurização cíclica para facilitar a ruptura da bolha.Para realizar a montagem de fundição, o molde ABS impresso em um slide de vidro usando massa de moldagem para selar a interface. Despeje cuidadosamente a mistura de PDMS no molde enquanto tenta minimizar a armadilha da bolha. Bolhas persistentes podem ser rompidas manualmente usando uma agulha.Cure o fantasma do elenco à temperatura ambiente por pelo menos 24 horas. Um recipiente pode ser usado para garantir que a poeira não assentar o fantasma durante a cura. Para realizar a demoldagem, dissolva o ABS submergindo o fantasma em acetona.Sonicate por pelo menos 15 minutos usando potências de até 70 watts. Enxágue completamente o fantasma com álcool isopropílico e, em seguida, água deionizada para remover resíduos de solventes. Usando um microscópio óptico com uma câmera conectada no software de captura de imagens, capture uma imagem de um recurso crítico dentro do fantasma sob uma ampliação que maximize o recurso dentro do campo de exibição.Capture uma imagem de uma retílação de calibração apropriada na mesma ampliação. Carregue ambas as imagens no ImageJ arrastando-as para a barra de ferramentas. Clique na imagem de tique-s tração de calibração para torná-la ativa e, em seguida, selecione a ferramenta de linha.Usando o mouse, desenhe uma linha ao longo de uma característica de uma distância conhecida e selecione analisar. Definir escala no menu ImageJ. Digite o comprimento do recurso no campo rotulado distância conhecida e sua unidade na unidade de comprimento rotulada de campo.Verifique a caixa rotulada globalmente para aplicar este fator de calibração em todas as imagens abertas. Torne ativa a imagem do recurso crítico fantasma e use a ferramenta de linha para desenhar uma linha ao longo de uma característica de interesse. A partir do menu ImageJ selecionar analisar, meça para medir o comprimento da linha.Compare o valor esperado em relação ao valor da coluna marcada na janela de resultados para confirmar a fidelidade fantasma. Para fazer a solução de sangue simulada misturar água deionizada e glicerol em uma proporção de 60 a 40 por volume. Adicione um mililitro de 2,5% de solução de contas de poliestireno fluorescente à solução de sangue simulado e sim homogeneize a mistura em uma placa de agitação magnética a 400 rpm por 10 minutos.Realize a configuração do sistema circulatório in vitro conforme descrito no protocolo de texto. Determine a razão de calibração para a imagem de vídeo como antes. Uma folha de acrílico pode ser colocada sobre o estágio do microscópio antes de colocar o fantasma PDMS para proteger o microscópio de derramamentos não intencionais.Para configurar o aparelho, coloque o fantasma PDMS no estágio do microscópio de fluorescência. Conecte o fantasma à bomba de engrenagem e introduza a solução de sangue simulada. Ajuste o controlador do motor da bomba para a taxa de fluxo desejada com base na curva de calibração da bomba.Execute a bomba por um a cinco minutos antes do experimento para garantir condições de estado estáveis. Se a degola de contas for observada após um experimento, sonicar o fantasma em uma solução de detergente aquoso usando potências de até 70 watts. A limpeza do modelo também é fundamental para a fidelidade de campo vetorial, pois contas presas à superfície do fantasma resultarão em janelas de interrogatório com zero deslocamento.Para realizar o processamento da imagem, arraste o arquivo SAVE AVI para a janela ImageJ para importá-lo. Selecione a caixa marcada para converter em escala cinza. A partir do menu ImageJ selecionar analisar, gerar histograma para gerar um histograma de intensidades de pixels de imagem.Tome nota do desvio médio e padrão para a imagem não processada. No menu ImageJ selecione imagem, ajuste o brilho e o contraste para aplicar um filtro de contraste de brilho. No menu de brilho e contraste, clique no botão definir para definir os limites de imagem.Defina o valor mínimo para ser o valor médio mais um desvio padrão e o valor máximo para ser a intensidade máxima da imagem. A partir do processo de seleção do menu ImageJ, ruído, despeckle para reduzir o número de pixels saturados. Em seguida, selecione o processo, filtros, desfoque gaussiano com um raio de 1,5.Isso reduzirá os artefatos decorrentes da remoção ocasional de pixels iluminados em um bairro 3x3 pela operação anterior de despeckling. Clique na ferramenta polígono e clique na imagem para delinear a região de interesse. A partir do menu ImageJ selecione editar, limpe o ruído do sensor em locais onde não se espera nenhum sinal que possa diminuir a relação sinal geral para ruído.Proceda à análise de dados, conforme descrito no protocolo de texto. Mostrado aqui é o fantasma completo destacado com dimensões, bem como a velocimetria de imagem de partículas ou região PIV de interesse. Esta figura mostra tramas de contorno de intensidade de imagem e parcelas de superfície resultantes de contas fluorescentes na artéria perforadora durante a captura de vídeo.Isso demonstra a melhora na relação sinal/ruído após a realização do capping de intensidade. São mostrados aqui os campos de vetores resultantes obtidos em vídeo bruto, após a intensidade de cobertura e, em seguida, novamente após a intensidade de campo vetorial tampado é validado usando o teste mediano normalizado. À medida que as técnicas de pós-processamento e validação de vetores são empregadas, o campo vetorial se torna mais uniforme e se assemelha mais ao perfil esperado para o fluxo em um canal circular.Ao tentar este procedimento é importante focar na minimização do ruído no próprio sinal adquirido. Embora este protocolo delineie técnicas baseadas em software para mitigar essas aberrações, deve-se tomar cuidado a cada passo para reduzir sua ocorrência. Não se esqueça que trabalhar com acetona pode ser extremamente perigoso e você deve sempre usar equipamentos de proteção individual, bem como trabalhar sob um capô de fumaça longe de qualquer fonte de ignição durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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