Name: O modelo de infecção Waxworm Galleria mellonella para candidíase disseminada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprenda o protocolo de infecção em Galleria mellonella para estudar candidíase disseminada e fatores de virulência de Candida. Este modelo invertebrado oferece uma alternativa ética, robusta e de baixo custo para pesquisas.

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Os autores gostaria de reconhecer a ajuda de Pamela Washington e Leah Anderson na obtenção de Galleria mellonella para uso neste estudo.

Todos os métodos descritos dependem do uso de hospedeiros invertebrados e não requerem aprovação institucional Cuidado Animal e usar Comité (IACUC).
1. larvas de Waxworm galleria mellonella
<ol><li>Ordem de larvas de atacadistas e fornecedores que não introduza hormonas, antibióticos ou outros tratamentos para as larvas e que são capazes de enviar e entregar espécimes vivos.<ol>
<li>Certifique-se de comprar todas as larvas do mesmo fornecedor durante o curso da experimentação. Tenha cuidado quando encomendar larvas durante os meses de verão, como temperaturas superiores a 30 ° C diminuem a viabilidade de larvas.</li>
		<li>Monitorar temperaturas em toda a rota de transporte esperado e planejar o transporte e a entrega em conformidade ou escolher transporte acelerado para minimizar sua exposição a condições ambientais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando as larvas chegam, verificar cada recipiente para assegurar-se de larvas viáveis e saudáveis estão presentes. As larvas saudáveis vão ser completamente submersa sob a roupa de cama, movendo-se e possuem uma leve coloração amarelo/tan com poucas larvas que contém marcas pretas ou descolorações ao longo do corpo.</li>
	<li>Armazenar as larvas em seu recipiente em um espaço ventilado, à temperatura ambiente (25 ° C). Dependendo da condição inicial das larvas, eles podem ser usados por até duas semanas.</li>
</ol>2. cultura preparação para a Galleria mellonella infecção
Nota: Traje de laboratório apropriado deve ser usado em toda esta parte do protocolo incluindo luvas, jaleco e óculos de segurança.
<ol><li>Fazer glicose de peptona levedura (YPD) líquido e ágar placas. Prepare 1 x salina tamponada fosfato (PBS) e soluções de etanol 70%.</li>
	<li>Crescem as cepas de C. albicans deve ser injetado durante a noite em 3 mL de YPD fresco em tubos de cultura padrão em um tambor rotativo em velocidade média e 30 ° C.</li>
	<li>Gire as células para baixo a 2.500 x g por 5 min em um centrifugador do tabletop. Decantar o líquido sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o centrifugado.<ol>
<li>Ressuspender as células totalmente em 5 mL de 1X PBS pipetagem repetidas ou num Vortex. Repeti a centrifugação e a ressuspensão das células em PBS mais duas vezes para assegurar a remoção de todos os meios de cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após uma lavagem final, Ressuspender as células em 1 mL de PBS e transfira para um tubo de microcentrifugadora.</li>
	<li>Realizar um conjunto de diluições em série em PBS para gerar um 1: 100, 1:1, 000 e a série de diluição de 1: 100.000. Nota: Diluições alternativas podem ser necessárias para atingir a contagem de células desejado.<ol>
<li>Usando um hemocytometer, conte as células da 1: 100 ou a diluição do 1:1,000. Mais frequentemente, a diluição de 1:1,000 fornece que a célula apropriada conta para culturas de c. albicans .</li>
		<li>Calcule a concentração total de células dentro da cultura inicial usando a grade matemática do hemocytometer, apontando para entre 30-300 células a serem contados na grade de 5 x 5 central. Um contador de célula automatizada pode ser usado como uma alternativa; no entanto, a utilização de densidade óptica para determinar a contagem de células é desencorajado como morfologia celular (tamanho, forma, etc.) pode afetar significativamente sua precisão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando a contagem de células medido, fazer uma nova diluição de 2.5x107 células/mL de 1X PBS em um tubo de microcentrifugadora. Esta diluição servirá como base para cada inoculação do mellonella g. com c. albicans. Cada injecção exigirá 10 µ l de inóculo este para uma dose infecciosa de 250.000 células de c. albicans .</li>
	<li>Confirme a exatidão da dose infecciosa por chapeamento o volume correto de diluição 1: 100.000 para 100 unidades formadora de Colônia (CFUs) no ágar YPD para cada cultura a ser usado na infecção.</li>
	<li>Incubar as placas de contagem celular do passo 2.7 por 48 horas (h) a 30 ° C e contar o número de colônias por placa. Entre 80 e 120 colônias constitui uma faixa aceitável para a exatidão no inóculo.</li>
</ol>3. infecção de larvas de Galleria mellonella com culturas de Candida
Nota: Traje de laboratório apropriado deve ser usado em toda esta parte do protocolo incluindo luvas, jaleco e óculos de segurança.
<ol><li>Adicione 1 mL de etanol 100% e 1 mL de 1X PBS para dois tubos de microcentrifuga separado. O etanol e PBS serão usado para lavar a agulha de injeção entre infecções.</li>
	<li>Espalhe uma pequena quantidade de waxworm de cama em um vazio, 100 x 15mm Petri estéril, que vai abrigar as larvas após inoculação para cada estirpe independente. Adição da cama limita adesão dos mortos mellonella g. larvas para a superfície da placa de Petri.</li>
	<li>Esterilize um 26 G, seringa de 10 µ l por ocupar e Expurgando 10 µ l de etanol a 70% três vezes seguido por três lavagens com 10 µ l de 1X PBS. A diluição de inoculação de c. albicans e toma acima de 10 µ l de cultura de vórtice. Certifique-se de que não há nenhuma bolha de ar dentro da seringa, como injeção de ar promove a morte e vai complicar a análise a jusante.</li>
	<li>Abrir um contêiner segurando as larvas mellonella g. e cuidadosamente virar camas com um dedo para descobrir as larvas. Selecione as larvas que estão de boa saúde, conforme identificado pelo movimento ativo, cor amarelo/tan clara e uma falta de pigmentação preta sobre o corpo de larvas. Essas larvas devem ser de tamanho similar em todo o completo experimental definidas.</li>
	<li>Pegar um único larvas e segure suavemente entre o dedo índice/médio e o polegar semelhante a segurar um lápis. Rode as larvas em sua parte traseira para que as pernas são voltada para cima. Segure o comprimento do corpo entre os dedos e o polegar para que as larvas é incapaz de encaracolar ou afastar a injeção. Nota: Se desejar, esterilize o local da injeção, usando um cotonete de algodão embebido em álcool etílico 100%.</li>
	<li>Gire a seringa para que bisel da agulha virado para e insira lentamente a ponta da agulha incluindo o comprimento do bisel no corpo na junção com a perna esquerda mais recuada. Certifique-se que a agulha penetra no corpo e não simplesmente empurrar o corpo para dentro as larvas. Não utilize força em penetrar o corpo como a agulha pode perfurar completamente as larvas rapidamente. Levantar suavemente com a agulha irá confirmar a penetração adequada. Injetar o inóculo de Candida completa 10 µ l e extrair a agulha.</li>
	<li>Repita a etapa 3.3-3.5 para cada larvas. Para evitar a célula, fixando-se, vórtice a Candida culturas para inoculação após cada terceira injeção. Como um controle, injete um conjunto de g. mellonella com 10 µ l de 1X PBS.</li>
	<li>Casa co 10 larvas injetadas da mesma cultura Candida em cada prato de Petri 100 x 15mm após a inoculação. Incube as larvas a 37 ° C durante oito dias, verificando as larvas cada 24h para monitorar a morte.<ol>
<li>Avaliar a mortalidade inicialmente pela pigmentação escura, a formação de manchas negras ou corpos e a falta de movimento. Para confirmar a mortalidade, use uma pinça para Rode suavemente o moribundas larvas em sua parte traseira e poke levemente inferior das larvas com uma pinça. Não-responsividade como observado por falta de movimento de corpo ou perna visível é marcado como a morte e as larvas são removidas da caixa de Petri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Registro de mortalidade de larvas ao longo do tempo. As larvas que começam a empupar em traças podem ser incluídas na análise, mas devem ser removidas se eles começam a muda. Larvas de pupating podem ser censuradas de análise de ponto de extremidade como as diferenças de virulência entre larvas e pupa são claras.</li>
	<li>Avalie a significância estatística usando estatística teste de Mantel-Cox.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O modelo de waxworm g. mellonella permanece como uma ferramenta eficaz para a análise rápida e reprodutível de virulência de c. albicans . Este protocolo detalhado baseia-se no momento da entrega consistente de uma dose infecciosa definida para o mesmo site através de um lote de larvas. Dose infecciosa tem um profundo impacto sobre a mortalidade mellonella g. Considerando que a utilização de larvas entre sua chegada inicial e dez dias após a recepção produziu resultados semelhantes. Perda do <e...

Espécies de Candida são comensais humanas comuns que são capazes de emergir como patógenos oportunistas em severamente imunocomprometidos e pacientes disbióticas. Embora muitas espécies de Candida podem causar doença, c. albicans é a causa mais prevalente de candidíase disseminada1,2. Doença sistêmica resulta da c. albicans acessando na corrente sanguínea através de qualquer penetração directa das barreiras restritivas anteriormente anfitrião ou introdução em sítios cirúrgicos e outras violações do corpo3. Espécies de Candida utilizam uma variedade de processos patogênicos para causar doença sistêmica dentro do host, incluindo filamentação, formação de biofilmes, evasão de células imunes e fuga e ferro4de eliminação. Existem em vitro abordagens para investigar mecanismos patogénicos individuais, mas modelos animais continuam a fornecer a melhor opção para investigar a totalidade do resultado de doença5,6. Pesquisas anteriores detalhou muitas instâncias do promissor em vitro investigações de virulência falhando reproduzir na vivo7,8. Assim, modelos animais ainda são necessários para avaliar a virulência in vivo. A maioria dos modelos da doença dependem de ratos para servir como um substituto para infecções humanas apesar da incapacidade de c. albicans naturalmente colonizar sistemas murino como um comensal9. Modelos de invertebrados de candidíase disseminada incluem o nematódeo Caenorhabditis elegans, a fruta voa melanogaster da drosófilae o waxworm Galleria mellonella, embora as preocupações sobre diferenças fundamentais em fisiologia básica, a temperatura do corpo hospedeiro e rotas de exposição têm dificultado sua ampla aceitação10,11.
Mais recentemente, foi adotado o modelo de infecção de waxworm g. mellonella a patogenicidade de modelo de uma vasta gama de patógenos bacterianos e fúngicos12,13,14. Vantagens deste modelo incluem sua taxa de transferência de custo relativamente baixo, maior facilidade de uso e reduziram as preocupações éticas sobre animal beneficência em relação aos modelos de murino. Para os pesquisadores, isso se traduz em maior capacidade de testar várias variáveis, intervalos de confiança mais fortes, mais rápida experimentação e desvio dos protocolos de animais. G. mellonella tem servido como uma plataforma para avaliar rapidamente a virulência de c. albicans após perturbação de genes necessários para regulamento de gene, filamentação e formação de biofilme em isolados clínicos11,15 ,16. Estudos recentes têm incorporado a investigação da eficácia antifúngica usando mellonella g. para avaliar a farmacocinética da droga atividade e resistência sob configurações na vivo , que são outro modo desafiador e demorado 17,18. Ainda, estudos de virulência de c. albicans em g. mellonella tem sido complicados por alegadamente altos níveis de variação dentro de experiências e protocolos inconsistentes entre grupos de pesquisa que produzem diferentes fenótipos de virulência entre ratos e waxworms11,13,19,20,21. Aqui, nós esboçamos um mellonella g. protocolo para padronizar a reprodutibilidade de aumento de infecções, de c. albicans em experimentos de virulência e demonstrar coerência com o descrito anteriormente estudos de virulência em murino modelos.
Estudos anteriores demonstraram que a c. albicans acasalamento como tipo (MTL) locus no cromossomo 5 regula a identidade da célula e competência semelhante ao Saccharomyces cerevisiae e outros de fungos ascomicetes22de acasalamento. A maioria dos isolados de c. albicans é heterozigota para o locus MTL , codificação um de cada dos MTLum e MTLα alelos (MTLum/α) e é consequentemente estéril15, 23 , 24. a perda de um dos alelos MTL através da perda de heterozigosidade (LOH) ou mutação leva à homozigotos MTLuma MTLα estirpes ou podem sofrer uma mudança fenotípica do estado estéril 'branco' para a acasalamento de Estado competente 'opaco'25. Trabalhos anteriores evidenciou que a perda de heterozigosidade MTL também reduz virulência em modelos murino de infecção sistêmica através de tensão diferentes origens26. Aqui, detalhamos o modelo g. mellonella para candidíase disseminada, usando um conjunto experimental geneticamente semelhante para retratar o contributo da heterozigosidade MTL de virulência em mellonella g.. Mostramos que a configuração de MTL influenciado patogenicidade de c. albicans , onde cepas MTLα foram menos virulentas em relação tantoum/α MTLe MTLuma células, semelhantes às conclusões dentro de modelo murino de infecção26.

<table><tbody><tr><td>Galleria mellonella</td><td>Snackworms.com</td><td></td><td>Compre o dobro de vermes do que o esperado para usar</td></tr><tr><td>10 uL, Modelo 1701 N SYR Agulha cimentada, 26G, seringa tipo 2</td><td>Placa</td> de Petri Hamilton <td>80000</td><td></td></tr>, <tr><td>100X15 mm, embalagem de 500</td><td></td><td></td> Tubo de microcentrífuga Fisher FB0875712<td></td></tr><tr><td>, 1,7 mL, embalagem de 500 VWR</td><td></td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (grau de biotecnologia), 500 mL</td><td>VWR</td><td>97062-818</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto, &ge; 99,5% puro, 500 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>EM-EX0276-1S</td><td></td></tr><tr><td>autoclavado ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

o modelo de infecção waxworm galleria mellonella para candidíase disseminada

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Espécies de Candida são comensais fungos comuns dos seres humanos colonizando a pele, mucosas e trato gastrointestinal. Sob certas condições, a Candida pode overgrow seus nichos naturais resultando em debilitantes infecções da mucosa como infecções sistêmicas bem como risco de vida, que são um grande foco de investigação devido a seus associados altas taxas de mortalidade. Existem modelos animais de infecção disseminada para estudar a progressão da doença e dissecando as características de patogenicidade da Candida . Destes, o modelo de infecção waxworm Galleria mellonella fornece uma ferramenta de experimental cost-effective para investigações de alta produtividade de virulência sistêmica. Muitos outros agentes infecciosos bacterianos e eukaryotic têm sido efetivamente estudados em mellonella g. para entender a patogenicidade, tornando-se um sistema de modelo amplamente aceito. Ainda, variação no método usado para infectar mellonella g. pode alterar os resultados fenotípicos e complicar a interpretação dos resultados. Aqui, podemos descrever os benefícios e as desvantagens do modelo waxworm para estudar a patogênese de Candida sistêmica e uma abordagem para melhorar a reprodutibilidade de detalhe. Nossos resultados destacam a variedade de cinética de mortalidade em g. mellonella e descrevem as variáveis que podem modular esses cinética. Em última análise, este método permanece como uma abordagem ética, rápida e econômica para estudar a virulência em um modelo de candidíase disseminada.

Aqui, vamos demonstrar um método reprodutível para o uso de waxworms g. mellonella para investigar um modelo de candidíase disseminada de infecção usando c. albicans. O armazenamento adequado, manutenção e seleção de larvas para infecção são um componente crítico do garantindo a reprodutibilidade em mellonella g. mortalidade (Figura 1A). As larvas saudáveis que estão ativas, têm uma luz cor de amarelo/tan, e patches...

Galleria mellonella serve como um modelo de invertebrados para candidíase disseminada. Aqui, detalhamos a infecção do protocolo e fornecer dados de apoio para a eficácia do modelo.

O modelo de infecção Waxworm Galleria mellonella para candidíase disseminada

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da Candida sobre a virulência da tensão e as contribuições de genes específicos para esses processos. As principais vantagens dessa técnica são que ela evita preocupações com o uso de animais, é robusta, rápida, barata e proporciona um alto número de animais por experimento. De um modo geral, indivíduos que são novos neste método provavelmente lutarão um pouco porque terão alguma dificuldade em avaliar a viabilidade dos vermes antes do início do experimento ou podem ter alguns problemas com a injeção inconsistente dos vermes.Peça larvas de atacadistas e fornecedores que não introduzem hormônios, antibióticos ou outros tratamentos às larvas e que são capazes de enviar e entregar espécimes vivos. Quando as larvas chegarem, verifique cada recipiente para confirmar a saúde e viabilidade das larvas. Larvas saudáveis ficarão completamente submersas sob a cama, movendo-se e possuindo uma coloração amarela e bronzeada com poucas larvas contendo marcas pretas ou descolorações ao longo do corpo.As larvas podem ser armazenadas em seus recipientes em um espaço ventilado à temperatura ambiente por até duas semanas. Para preparar as cé

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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O desenvolvimento rápido, tamanho pequeno e transparência de peixes-zebra são enormes vantagens para o estudo do controle imunológico inato de...

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O inseto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um modelo de infecção poderosa para investigar Patogênese Bacteriana

A larva da cera traça Galleria mellonella foi recentemente estabelecido como um modelo in vivo para estudar a infecção Legionella pneumophila. Aqui, nós demonstramos técnicas fundamentais para caracterizar a patogênese da Legionella nas larvas, incluindo a inoculação, a medida da virulência bacteriana e replicação, bem como extração e análise de hemócitos infectados.

Utilização de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um organismo modelo para estudar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infecção

In vivo interações espaço-temporais de patógenos e defesas imunes no nível da mucosa não são facilmente visualizadas em hospedeiros vertebrados existentes. O método aqui apresentado descreve uma plataforma versátil para estudar a candidíase mucosa em vertebrados vivos usando a bexiga natatória do peixe-zebra juvenil como local de infecção.

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

Aqui, apresentamos o nemátodo Caenorhabditis elegans como modelo de acolhimento versátil para estudar a interação microbiana.

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para um modelo de administração oral usando Galleria mellonella larvas e como caracterizar induzido inatas respostas imunes. Usando este protocolo, será capazes de usar a alimentação forçada método mellonella g. pesquisadores sem experiência prática.

Um modelo de administração Oral Galleria mellonella para respostas imunes Study Commensal-Induced inata

Estabelecemos um modelo murino de infecção relacionada ao cateter (IRC) associada a C.albicans, no qual o biofilme se forma no cateter, e a interação entre C.albicans e hospedeiro correlaciona-se bem com a IRC clínica. Esse modelo ajuda a selecionar terapias para IRC associada ao biofilme de C.albicans , estabelecendo uma base para a transformação clínica.

Modelo de Infecção por Candida albicans Relacionada a Cateter em Camundongos

Este estudo apresenta uma estrutura padronizada para otimizar os modelos de infecção por G. mellonella para uso na avaliação antimicrobiana pré-clínica. A aplicação de um modelo de G. mellonella como parte de um pipeline de desenvolvimento antimicrobiano pré-clínico pode diminuir o número de compostos ineficazes que progridem para ensaios clínicos.

Galleria mellonella como modelo de triagem antimicrobiana

Durante o processo de infecção, um passo fundamental é a adesão de patógenos com células do hospedeiro. Na maioria dos casos esta etapa de adesão ocorre na presença de estresse mecânico gerado pelo fluxo de líquido. Descrevemos uma técnica que apresenta tensão de cisalhamento como um parâmetro importante no estudo da adesão bacteriana.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

Aprenda o protocolo de infecção em Galleria mellonella para estudar candidíase disseminada e fatores de virulência de Candida. Este modelo invertebrado oferece uma alternativa ética, robusta e de baixo custo para pesquisas.

O modelo de infecção Waxworm Galleria mellonella para candidíase disseminada

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