Name: No modelo de diferenciação Vitro de células de memória humana Normal B de plasmócitos de vida longa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprenda a diferenciação de células B de memória em plasmócitos usando um modelo in vitro multi-etapas. Este método reproduz as mudanças transcricionais coordenadas e características fenotípicas observadas in vivo.

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Este trabalho foi apoiado por concessões do INCA francês (Institut National du Cancer) Instituto (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) e câncer ITMO (MM & TT).

O protocolo segue as diretrizes em conformidade com o acordo do Centro Hospital Universidade de Montpellier para recursos biológicos e a declaração de Helsinque.
1. no modelo de diferenciação de células plasmáticas Vitro Normal
Nota: PCes são gerados através de uma cultura de quatro etapas11,12,13.
<ol><li>
Diferenciação e amplificação de células b
	<ol>
<li>Utilize células de sangue periféricas de voluntários saudáveis para purificação de células B de memória.</li>
		<li>Dilua com 24,5 mL de meio RPMI 1640, 7,5 mL de sangue.</li>
		<li>Adicione 12,5 mL de gradiente de densidade de temperatura (por exemplo, Ficoll) para um tubo cônico estéril 50 mL. Delicadamente sobrepor o gradiente de densidade com o 32 mL de sangue diluído. Minimize a mistura das duas fases.</li>
		<li>Centrífuga 20 min a 500 x g com o travão de fora. Coletar os PBMCs através da interface de gradiente de densidade/plasma diluído e colocar as células em um tubo estéril 50 mL e completar a 45 mL com solução salina equilibrada do Hank.</li>
		<li>Centrifugar as células durante 5 min à 500 x g. Retire o sobrenadante cuidadosamente e manter a pelota.</li>
		<li>Adicione 45 mL de soro de vitela fetal RPMI1640/10% (FCS) e centrifugar 5min a 500 x g. Retire o sobrenadante cuidadosamente e manter a pelota. Adicione 30 mL de PBS/2% FCS.</li>
		<li>
Remova células CD2 + usando grânulos magnético anti-CD2. Adicione 4 grânulos para a célula de um destino. Incubar 30 min a 4 ° C.
		<ol>
<li>Células grânulo-limite separadas de pilhas unbound usando um ímã para aplicação de separação de células. Recolher pilhas unbound e incubar o centrifugado com anti CD19 APC e anti anticorpos CD27 PE durante 15 minutos a 4 ° C (2 µ l de anticorpo para 106 células).</li>
			<li>Lave duas vezes em soro de cabra PBS/10%.</li>
			<li>Remova contaminantes eventos nas parcelas de ambos FSC e SSC. Plotar singletos em FSC-A vs FSC-H e SSC-A vs QUE CCD-H lotes para remover detritos e para selecionar a população total dos leucócitos. Selecione as células de memória B CD19/CD27 e CD19+CD27+.</li>
			<li>Purifica MBCs usando um classificador de pilha com uma pureza de 95%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Execute todas as etapas de cultura usando FCS IMDM e 10%, suplementado com 50mg/mL humana transferrina e 5 mg/mL de insulina humana.</li>
		<li>
Placa purificado MBCs em placas de cultura de seis poços (1,5 x 105 MBCs/mL, 5 mL/poço), por 4 dias, com IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL).
		<ol>
<li>Adicionar Phosphorothioate CpG ODN 2006, CD40L solúvel humana recombinante com tag histidina (sCD40L; 50 ng/mL) e mAb anti-polyhistidine (5 mg/mL) para a ativação MBCs (Figura 1). Ativação por sCD40L ou ODN somente com a mesma citocina coquetel rende-se a menor amplificação12. A combinação de sinais de ativação descritos aqui com chumbo para o número máximo de ativadas as células B e PrePBs11,12 (Figura 1).</li>
			<li>Para gene expression profiling, purificar CD38 /CD20–– PrePBs, no dia 4, usando um classificador de pilha (Figura 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Geração de célula plasmablastic
	<ol>
<li>No dia 4, conte as células.</li>
		<li>Células em placas de cultura de 12 poços da placa em 2.5 x 105/mL em 2 mL/bem.</li>
		<li>Induzir a diferenciação pela remoção dos oligonucleotides CpG e sCD40L e adição de um novo meio de cultura com uma citocina novo cocktail, incluindo IL-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL) (Figura 1). Células de cultura por 3 dias (do dia 4 ao dia 7) a 37 ° C.</li>
		<li>Para gene expression profiling, purificar CD38+/CD20– PBs, no dia 7, usando um classificador de pilha (Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Geração precoce de células plasmáticas
	<ol>
<li>No dia 7, conte as células.</li>
		<li>Placa de células em placas de cultura 12-poços em 5 x 105/mL em 2 mL/bem.</li>
		<li>Diferenciar o PB no início PCs usando o meio de cultura fresco com IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) e IFN-α (500 U/mL) por 3 dias a 37 ° C. Para gene expression profiling, purificar CD20–/CD38+/CD138+ PCs cedo, no dia 10, usando um classificador de pilha (Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Geração da pilha de plasma long-lived
	<ol>
<li>Diferencie os primeiros PCs em PCs há muito tempo viveu alterando as condições de cultura.</li>
		<li>Cultura de células em placas de cultura 12-poços em 5 x 105/mL em 2 mL/bem ou em placas de cultura de 24-poço em 1 mL/bem a 37 ° C, usando a IL-6 e células estromais condicionado médio e abril (200 ng/mL).</li>
		<li>Obter do estroma celular-condicionado médio por cultivo de células do estroma por 5 dias com meio de cultura. Filtrar o sobrenadante de cultura de pilha do estroma (0,2 µm) e congelar.</li>
		<li>Adicione 50% da mídia condicionada por células do estroma para culturas de PC com renovação toda semana. PCs long-lived gerados podem ser mantidos por meses13. Sobrevivência de longo prazo dos PCs poderia ser obtida com a IL-6 e abril apenas como relatado13.</li>
		<li>Secreção de Ig medida de citometria de fluxo classificado unid.</li>
		<li>Cultura de PCs em 106 células/mL de sobrenadante de cultura de 24 h e colheita. Medir a IgG e IgA usando humana enzima-lig da imunoabsorção kits de ensaio (ELISA)11,12,13. A secreção de IgG mediana variou de 10 pg/célula/dia, no dia 10 a 17 pg/célula/dia em 60 dias13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. molecular Atlas de B para diferenciação de PC
Nota: Nós construímos um acesso conveniente e aberto de ferramentas de Bioinformática para extrair e visualizar as informações mais proeminentes de dados Affymetrix GEP relacionados com PC diferenciação (GenomicScape)15. GEP estão publicamente disponíveis do banco de dados ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) incluindo purificada MBCs, PrePBs, PBs e EPCs: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 e E-MEXP-3034 e E BMPC-MEXP-2360 de14,15. Genomicscape é uma ferramenta Web livremente disponível.
<ol><li>
Seleção de B para PC dataset
	<ol>
<li>Selecione B para PC dataset no menu Procurar dados na ferramenta de bioinformatic de acesso aberto GenomicScape (http://www.genomicscape.com) chamado humano B células de células plasmáticas. Visualização do perfil de expressão do gene do gene original ou uma lista de genes está disponível usando a ferramenta de Relatório de expressão-Coexpression nas Ferramentas de análise disponíveis na página inicial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de supervisão e análise de componentes principais (PCA)
	<ol>
<li>Selecione ferramentas de análise | webSAM para carregar a ferramenta de SAM.</li>
		<li>Escolha o dataset de células B humano de plasmócitos e selecione os grupos de amostras para comparar.</li>
		<li>Use os filtros diferentes disponíveis para aplicar as opções de filtragem de interesse.</li>
		<li>Para comparar perfis de expressão de gene com ferramenta de SAM, modifica as opções de filtragem, incluindo mudança de dobra, o número de permutações, taxa falsa da descoberta e o tipo de comparação. GenomicScape irá calcular a análise e fornecer genes diferencialmente expressados entre os grupos selecionados.</li>
		<li>Execute análise de componentes principais, selecionando Análise de componente Principal no menu de Ferramentas de análise .</li>
		<li>Escolha o dataset de células B humano de plasmócitos e selecione os grupos de interesse.</li>
		<li>Cole uma lista de genes de interesse ou selecionados genes de acordo com a variação. Para colar uma lista de genes, selecione Genomicscape para analisar uma lista de genes/ncRNAs, clique aqui... irá calcular PCA que poderia ser visualizada e baixada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro-Shelef, M., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plasma-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of plasma-cell development.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).</li>
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<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blimp-1+orchestrates+plasma+cell+differentiation+by+extinguishing+the+mature+B+cell+gene+expression+program%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program.</a> Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).</li>
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<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiation+of+memory+B+cells+into+plasmablasts+and+plasma+cells+including+detailed+phenotypic+and+molecular+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization.</a> Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+supports+the+generation+of+human+long-lived+plasma+cells+in+combination+with+either+APRIL+or+stromal+cell-soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors.</a> Leukemia. , (2014).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+miRNA+expression+analysis+identifies+novel+key+regulators+of+plasma+cell+differentiation+and+malignant+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenomicScape%3A+an+easy-to-use+web+tool+for+gene+expression+data+analysis.+Application+to+investigate+the+molecular+events+in+the+differentiation+of+B+cells+into+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077(2015).</li>
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<li>Leung-Hagesteijn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xbp1s-negative+tumor+B+cells+and+pre-plasmablasts+mediate+therapeutic+proteasome+inhibitor+resistance+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).</li>
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<li>Ahmadnejad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+expression+of+DNMT1+is+associated+with+increased+expansion+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells+co-cultured+with+human+MSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Research%22%5BJournal%5D)">Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs.</a> Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+is+required+for+germinal+center+formation+and+somatic+EZH2+mutations+promote+lymphoid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation.</a> Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).</li>
<li>Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+in+normal+hematopoiesis+and+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies.</a> Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+enables+germinal+centre+formation+through+epigenetic+silencing+of+CDKN1A+and+an+Rb-E2F1+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop.</a> Nature Communications. 8 (1), 877(2017).</li>
<li>Herviou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC2+targeting+is+a+therapeutic+strategy+for+EZ+score+defined+high-risk+multiple+myeloma+patients+and+overcome+resistance+to+IMiDs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs.</a> Clinical Epigenetics. 10 (1), 121(2018).</li>
<li>Asangani, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+EZH2-MMSET+histone+methyltransferase+regulatory+axis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer.</a> Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).</li>
<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMSET+regulates+histone+H4K20+methylation+and+53BP1+accumulation+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites.</a> Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).</li>
<li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EHMT2+inhibitor+BIX-01294+induces+apoptosis+through+PMAIP1-USP9X-MCL1+axis+in+human+bladder+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells.</a> Cancer Cell International. 15 (1), 4(2015).</li>
<li>Santo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+activity%2C+pharmacodynamic%2C+and+pharmacokinetic+properties+of+a+selective+HDAC6+inhibitor%2C+ACY-1215%2C+in+combination+with+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma.</a> Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).</li>
<li>Amengual, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Targeting+of+Protein+Degradation+Pathways+with+the+Selective+HDAC6+Inhibitor+ACY-1215+and+Bortezomib+Is+Synergistic+in+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).</li>
<li>Schoenhals, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+KLF4+expression+increases+the+generation+of+mature+plasma+cells+and+uncovers+a+network+linked+with+plasma+cell+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage.</a> Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

Em humanos, PC são raras células com estágios de diferenciação, ocorrendo em locais anatómicos que dificultam a caracterização biológica. Nós desenvolvemos um B in vitro para PC modelo de diferenciação usando sistemas de cultura de várias etapas onde várias combinações de moléculas de ativação e citocinas posteriormente são aplicadas a fim de reproduzir a diferenciação celular sequencial ocorrendo na diferentes órgãos/tecidos em vivo11,12,<sup class="x...

A diferenciação das células B para células plasmáticas (PCs) é essencial para a imunidade humoral e proteger o hospedeiro contra infecções1. B a diferenciação de PC está associado com grandes mudanças na capacidade de transcrição e metabolismo para acomodar a secreção de anticorpos. Os fatores de transcrição que controlam a B para diferenciação de PC têm sido muito estudados e revelou redes exclusivas incluindo transcrição B PC-específicas e fatores (TFs)2. Em células B, PAX5, BCL6 e BACH2 TFs são os guardiães das células B identidade2,3. Indução de IRF4, PRDM1 , BLIMP1 e XBP1 PC TF de codificação irá extinguir genes de células B e induzir uma coordenada desegregação celular programa transcriptional3,4,5. Essas alterações transcricionais coordenadas estão associadas com a ativação de transcrição de genes de Ig juntamente com um interruptor de forma a membrana-limite para a forma secretada da imunoglobulina cadeia pesada2,3, 4. B para diferenciação de PC está relacionada com a indução de genes envolvidos no retículo endoplasmático e complexo de Golgi funções concomitante com ativação de resposta (UPR) unfolded da proteína conhecida por desempenhar um papel-chave no PC por acomodar a síntese de secretado imunoglobulinas6,7. A XBP1 de TF desempenha um papel importante nesta adaptação celular8,9,10.
As células B e PCs são jogadores-chave da imunidade humoral. Noções básicas sobre o biológico processos que controlam a produção e a sobrevivência das células de plasma normais é crítico em intervenções terapêuticas que precisam assegurar eficientes respostas imunes e prevenir auto-imunidade ou deficiência imunológica. PC são raras células com estágios iniciais de diferenciação que ocorrem em locais anatómicos que dificultam a caracterização biológica, particularmente em humanos. Utilizando sistemas de cultura de várias etapas, registramos um B in vitro para PC modelo de diferenciação. Este modelo reproduz a diferenciação celular sequencial e maturação ocorrendo em diferentes órgãos em vivo11,12,13. Numa primeira fase, as células de memória B são ativado pela primeira vez por quatro dias por combinação de CD40 ligante, oligodeoxynucleotides e citocinas em diferenciarem em preplasmablasts (PrePBs). Em uma segunda etapa, preplasmablasts são induzidas de se diferenciarem em plasmablasts (PBs) removendo estimulação CD40L e oligodeoxynucleotides e mudar a combinação do cytokine. Em uma terceira etapa, plasmablasts são induzidos a se diferenciar em PCs cedo, alterando a combinação de citocina11,12. Um quarto passo foi introduzido para obter PCs totalmente maduros pelo cultivo destes primeiros PCs com meio condicionados de células do estroma de medula óssea ou selecionado de fatores de crescimento13. Estes PCs maduros podem sobreviver vários meses in-vitro e secretam quantidades elevadas de imunoglobulina (Figura 1). Curiosamente, o nosso modelo in vitro recapitula as alterações transcricionais coordenadas e o fenótipo do B diferente fases de PC que pode ser detectado em vivo11,12,13,14 ,15. PCs são células raras e nosso modelo de diferenciação in vitro permite estudar B humano para diferenciação de PC.

<table><tbody><tr><td>contas magnéticas anti-CD2</td><td>Invitrogen</td><td>11159D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD138-APC</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>B49219</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-APC</td><td>BD</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD20-PB</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>B49208</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD27-PE</td><td>BD</td><td>555441</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD38-PE</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>A07779</td><td></td></tr><tr><td>Anti-histidina</td><td>R& D Systems</td><td>MAB050</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN(PT)Sigma</td><td></td><td></td> <td>T*C*G*T*C*G*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T</td></tr><tr><td>humano Transferência</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&alpha;</td><td>Merck</td><td>Intron A</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>31980-022</td><td></td></tr><tr><td>Humano Recombinante CD40L-hi</td><td>R& D Systems</td><td>2706-CL</td><td></td></tr><tr><td>Humano Recombinante APRIL</td><td>R& D Systems</td><td>5860-AP-010</td><td></td></tr><tr><td>IL-10 Humano Recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>217-IL-IL-IL-Humano</td><td></td></tr> <tr><td>Recombinante Proteína</td><td></td><td>Humana Recombinante R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>& D Systems</td><td>202-IL-IL-Humano</td><td></td></tr> <tr><td>Recombinante</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td></td></tr></tbody></table>

no modelo de diferenciação vitro de células de memória humana normal b de plasmócitos de vida longa

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

Os plasmócitos (PCs) secretam grandes quantidades de anticorpos e desenvolver a partir de células B que foram ativadas. PCs são raras células localizadas na medula óssea ou mucosa e garantir imunidade humoral. Devido à sua baixa frequência e localização, o estudo dos PCs é difícil em humanos. Nós relatamos um B para PC modelo de diferenciação in vitro usando combinações selecionadas de citocinas e a ativação de moléculas que permitem reproduzir a diferenciação de células sequenciais ocorrem in vivo. Neste modelo in vitro, células B (MBCs) irão diferenciar em pre-plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), cedo PCes de memória e, finalmente, em Long-lived PCs, com um fenótipo perto de suas contrapartes em indivíduos saudáveis,. Também construímos uma acesso aberto bioinformática ferramentas para analisar as informações mais importantes de dados GEP relacionados à diferenciação de PC. Esses recursos podem ser usados para estudar B humano para diferenciação de PC e no atual estudo, investigamos a regulação da expressão gênica de fatores epigenéticos durante B humano para diferenciação de PC.

O procedimento geral de diferenciação in vitro de PC normal é representado na Figura 1. Usando o protocolo apresentado aqui, nós poderia gerar uma quantidade adequada de células que não pode ser obtido com ex vivo amostras humanas. Embora o papel da rede complexa de fatores de transcrição envolvidos na diferenciação do PC tem sido investigado, os mecanismos de regulação principais redes de transcrição de diferenciação de PC permanecem pouco conhecidos. Difere...

Utilizando sistemas de cultura de várias etapas, relatamos uma células B in vitro para o modelo de diferenciação de células plasmáticas.

No modelo de diferenciação Vitro de células de memória humana Normal B de plasmócitos de vida longa

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

As células plasmáticas são células raras com 30 estágios de diferenciação que ocorrem em locais anatômicos que prejudicam a caracterização biológica completa, particularmente no ser humano. Nosso modelo de diferenciação de células plasmáticas B2 in vitro reproduz a diferenciação e maturação celular sequencial que ocorrem nos diferentes órgãos in vivo. Este modelo in vitro recapitula as alterações transcricionais coordenadas e o fenótipo dos diferentes estágios das células plasmáticas B2 que podem ser detectados in vivo.Também construímos uma ferramenta bioinformática de acesso aberto para analisar as informações mais proeminentes de dados de exploração relacionados à diferenciação de células plasmáticas. Demonstrando o procedimento será Hugues de Boussac, um pós-doutor do meu laboratório. Para começar, obtenha células sanguíneas periféricas de voluntários saudáveis para purificação celular da memória B.Diluir 7,5 mililitros de sangue com 24,5 mililitros de RPMI 1640 médio. Em seguida, adicione 12,5 mililitros de gradiente de densidade de temperatura ambiente a um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Sobreponha suavemente o gradiente de densidade com os 32 mililitros de sangue diluído, certificando-se de minimizar a mistura das duas fases.Centrífuga por 20 minutos a 500 vezes a gravidade com o freio desligado. Coletar as células mononucleares de sangue periféricos da interface de plasma diluído e gradiente de densidade. Transfira as células para um tubo estéril de 50 mililitros e encha o tubo até 45 mililitros com a Solução de Sal Balanceado da Hank.Centrífuga a 500 vezes a gravidade por cinco minutos. Remova cuidadosamente o supernatante e mantenha a pelota. Em seguida, adicione 45 mililitros de RPMI 1640 médio, complementado com 10% de FCS.Centrífuga a 500 vezes a gravidade por cinco minutos. Remova cuidadosamente o supernatante e mantenha a pelota. Adicione 30 mililitros de PBS, complementados com 2%de FCS.Use contas magnéticas anti-CD para remover células CD2 positivas adicionando quatro contas para uma célula alvo. Incubar a 4 graus Celsius por 30 minutos. Usando um ímã para aplicação de separação celular, separe as células ligadas às contas das células desvinculadas.Colete as células desvinculas e incuba-as com anticorpos anti-CD19 APC e anti-CD27 PE por quinze minutos a quatro graus Celsius. Lave as células duas vezes em PBS contendo 10% de soro de cabra. Em seguida, use o classificador de células para purificar as células B da memória a uma pureza de 95%.Depois disso, adicione ligante CD40 solúvel e anticorpo monoclonal anti-polihistidina para ativação celular B de memória. Plaque as células B de memória purificada em placas de cultura de seis poços durante quatro dias com interleucina-2, interleucina-10 e interleucina-15. Para traçar perfis de expressão genética, use um classificador de células para purificar os préplasmablasts CD38 negativos CD38-negativos no quarto dia.No quarto dia, conte as células e as emplaque em placas de cultura de 12 poços a uma densidade celular de 250.000 células por mililitro adicionando dois mililitros de suspensão celular em cada poço. Para induzir a diferenciação, remova os oligonucleotídeos CPG e o ligante CD40 solúvel e adicione um novo meio de cultura contendo um novo coquetel de citocina, incluindo interleucina-2, interleucina-6, interleucina-10 e interleucina-15. Cultue as células por três dias a 37 graus Celsius.Para traçar perfis de expressão genética, use um classificador de células para purificar os plasmablastos de plasma CD38 positivos e CD20 negativos no sétimo dia. No sétimo dia, conte as células. Plaque as células em placas de cultura de 12 poços a uma densidade celular de 500.000 células por poço, adicionando dois mililitros de suspensão celular a cada poço.Diferencie os plasmablastos em células plasmáticas precoces usando meio de cultura fresco contendo interleucina-6, interleucina-15 e interferon-alfa por três dias a 37 graus Celsius. Para traçar perfis de expressão genética, use um classificador de células para purificar as células plasmáticas iniciais CD20-negativas, CD38-positivas, CD138 no dia 10. Primeiro, as células estrogonais da cultura por cinco dias com o meio da cultura.Use um filtro de 0,2 microliter para filtrar a cultura celular escrumal para obter o meio econsciente condicionado à célula estromada e congelar até estar pronto para usar. Em seguida, cultue as primeiras células plasmáticas em placas de cultura de 12 poços, usando o meio de células estromicinas previamente obtidas com interleucina-6 e ABRIL a uma densidade celular de 500.000 células por poço, adicionando dois mililitros de suspensão celular a cada poço. Incubar a 37 graus Celsius, renovando o meio condicionado de células estromas a cada semana.Em seguida, meça a secreção de imunoglobulina a partir de células plasmáticas classificadas por citometria de fluxo. Cultue as células plasmáticas a uma densidade de um milhão de células por mililitro por 24 horas e colmeia a cultura sobrenatária. Usando um kit ELISA, meça a imunoglobulina G e a imunoglobulina A.First, inicie a ferramenta web de bioinformática de acesso aberto GenomicScape.No menu de dados de navegação, selecione o conjunto de dados chamado células B humanas para células plasmáticas. A visualização do perfil de expressão genética de um gene ou lista de genes únicos está disponível usando a ferramenta Expression/Coexpression Report nas Ferramentas de Análise. Em seguida, selecione Ferramentas de análise webSAM para carregar a ferramenta SAM.Escolha as células B humanas para o conjunto de dados das células plasmáticas e selecione o grupo de amostras para comparar. Use os diferentes filtros disponíveis para aplicar as opções de filtragem de interesse. Para comparar perfis de expressão genética com a ferramenta SAM, modifique as opções de filtragem, incluindo alteração de dobra, número de permutações, taxa de detecção falsa e o tipo de comparação.O software calculará a análise e fornecerá genes expressos diferencialmente entre os grupos selecionados. Neste estudo, são investigadas as alterações de expressão dos fatores epigenéticos na diferenciação normal das células plasmáticas. Usando a análise sam multi-classe, 71 genes são vistos como significativamente expressos diferencialmente entre as células B da memória, os preplasmablasts, os plasmablastos, as células plasmáticas primitivas e as células plasmáticas da medula óssea com uma falsa taxa de descoberta de menos de 5%O estágio da célula B da memória é caracterizado pela superexpressão de 23 genes de jogadores epigenéticos, incluindo 39,13% de acetiltransferases histonas, 30,43% de histona metiltransferases , 21,74% das demetiláases de histona, 4,35% das proteínas de ligação de metila e 4,35% das deacetilases de histona.14 genes de reprodução epigenética são superexpressos significativamente na fase pré-plasmablast, incluindo 50% das histonas metiltransferases, 14,28% das metiltransferases de DNA, 21,43% das deacetillases histonas, 7,14% das demetilases de histona e 17,14% das acetiltransferases de histona. Após este procedimento, várias análises para identificar e entender modificações na estrutura e arquitetura da cromatina durante essas diferenciações de células plasmáticas B2 poderiam ser realizadas. Este modelo de diferenciação in vitro permitirá gerar células suficientes para completar esta análise molecular para revelar tanto os caminhos envolvidos em toda essa modelagem quanto seu impacto transcricional a jusante durante a diferenciação de células plasmáticas B2.Esse conhecimento derivado desta pesquisa poderia informar e instruir sobre estratégias diagnósticas e terapêuticas para distúrbios celulares plasmáticas, como no caso do mieloma múltiplo, um câncer sem cura definitiva, para o qual melhores prognósticos e melhores estratégias terapêuticas são criticamente necessárias. Caracterizar e compreender as mudanças estruturais e arquitetônicas de remodelação epigenética que afetam a cromatina durante a diferenciação de células plasmáticas B2 será de particular interesse. Isso poderia ser feito usando sequenciamento genético, ERRBS, sequenciamento ATAC, IC e sequenciamento de RNA.Uma heterogeneidade moderada poderia ser observada na porcentagem de células B ativadas, preplasmablasts, plasmablastos e células plasmáticas, dependendo do sangue saudável do doador, usado para purificação celular B da memória.

in-vitro-differentiation-model-human-normal-memory-b-cells-to-long

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós descrevemos um método para gerar linhas B transformada célula usando vírus Epstein-Barr. Nós também ilustrar um ensaio de romance que pode identificar as células B destinados a sofrer transformações logo aos três dias após a infecção.

Estabelecimento de Epstein-Barr Virus Crescimento transformada linhagens de células linfoblastóides

A síntese de anticorpos monoclonais humanos é o primeiro passo em estudos destinados a desvendar os mecanismos fisiopatológicos das respostas imunes mediadas por auto-anticorpos. Desenvolvemos um protocolo para gerar anticorpos monoclonais de imunoglobulina G humana (IgG) recombinantes a partir de células B classificadas no sangue, incluindo isolamento de células B, clonagem de anticorpos e síntese in vitro.

Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas

O sangue periférico humano é comumente usado para a avaliação da resposta imune humoral. Aqui, são descritos os métodos para isolar células B humanas do sangue periférico, diferenciar células B humanas em células B secretoras de anticorpos (Ab) (ASCs) em cultura e enumerar o total de IgM- e IgG-ASCs por meio de um ensaio ELISpot.

O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

Este protocolo descreve a geração reprodutível e fenotipagem de células T reguladoras humanas induzida (iTregs) a partir de células naive T CD4 + in vitro. Diferentes protocolos de indução de FOXP3 permitem o estudo de fenótipos específicos iTreg obtidos com os respectivos protocolos.

Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo

Um método simples de lise de glóbulos vermelhos para o estabelecimento de B-LCLS foi desenvolvido com alta eficiência de imortalização, requerendo uma pequena quantidade de sangue e de economia de tempo desde a iniciação à criopreservação.

Um glóbulo vermelho simples método de lise para o estabelecimento de linhas celulares linfoblastóides B

Nós descrevemos um método para a produção de anticorpos humanos específicos para um antígeno de interesse, a partir de raras células B que circulam no sangue humano. Geração destes anticorpos naturais é rápida e eficiente, e os anticorpos obtidos podem discriminar entre antígenos altamente relacionados.

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Este artigo descreve um método novo para gerar emigrantes Thymic de pilha-derivado induzido antígeno-específico do tumor (iTE) por um sistema Thymic tridimensional da cultura (3D). iTE é um subconjunto homogêneo de células T intimamente relacionadas com células T ingênuas com a capacidade de proliferação, formação de memória e supressão tumoral.

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

O método de BSelex para identificar e recuperar anticorpos antígeno-específicos individuais das pilhas mononucleares do sangue periférico humano combina a citometria do fluxo com o único PCR da pilha e a clonagem.

Método de triagem de célula única para a seleção e recuperação de anticorpos com especificidades desejadas de populações de células B de memória humana enriquecida

Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

Este protocolo descreve a diferenciação de células T CD4+ virgens em células Th17 patogênicas in vitro. Especificamente, quando combinado com uma abordagem baseada em citometria de fluxo multiparâmetro, 90% de pureza de células Th17 patogênicas podem ser obtidas de células T CD4 + virgens usando este método de diferenciação.

Diferenciação in vitro de células T CD4+ virgens em células Th17 patogênicas em camundongos

Para estudar a diferenciação e a função das células T CD8 in vitro, as células T CD8 podem ser isoladas do camundongo para serem co-cultivadas a longo prazo com organoides epiteliais vaginais murinos infectados pré-formados. Aqui, descrevemos esse processo e avaliamos a aquisição dos marcadores residentes de células T da memória após a co-cultura.

In Vitro Diferenciação de Células T CD8 de Memória Residente usando Sistema de Co-cultura Organoide-Célula T Epitelial

Aprenda a diferenciação de células B de memória em plasmócitos usando um modelo in vitro multi-etapas. Este método reproduz as mudanças transcricionais coordenadas e características fenotípicas observadas in vivo.

No modelo de diferenciação Vitro de células de memória humana Normal B de plasmócitos de vida longa

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