No modelo de diferenciação Vitro de células de memória humana Normal B de plasmócitos de vida longa

As células plasmáticas são células raras com 30 estágios de diferenciação que ocorrem em locais anatômicos que prejudicam a caracterização biológica completa, particularmente no ser humano. Nosso modelo de diferenciação de células plasmáticas B2 in vitro reproduz a diferenciação e maturação celular sequencial que ocorrem nos diferentes órgãos in vivo. Este modelo in vitro recapitula as alterações transcricionais coordenadas e o fenótipo dos diferentes estágios das células plasmáticas B2 que podem ser detectados in vivo.

Também construímos uma ferramenta bioinformática de acesso aberto para analisar as informações mais proeminentes de dados de exploração relacionados à diferenciação de células plasmáticas. Demonstrando o procedimento será Hugues de Boussac, um pós-doutor do meu laboratório. Para começar, obtenha células sanguíneas periféricas de voluntários saudáveis para purificação celular da memória B.

Diluir 7,5 mililitros de sangue com 24,5 mililitros de RPMI 1640 médio. Em seguida, adicione 12,5 mililitros de gradiente de densidade de temperatura ambiente a um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Sobreponha suavemente o gradiente de densidade com os 32 mililitros de sangue diluído, certificando-se de minimizar a mistura das duas fases.

Centrífuga por 20 minutos a 500 vezes a gravidade com o freio desligado. Coletar as células mononucleares de sangue periféricos da interface de plasma diluído e gradiente de densidade. Transfira as células para um tubo estéril de 50 mililitros e encha o tubo até 45 mililitros com a Solução de Sal Balanceado da Hank.

Centrífuga a 500 vezes a gravidade por cinco minutos. Remova cuidadosamente o supernatante e mantenha a pelota. Em seguida, adicione 45 mililitros de RPMI 1640 médio, complementado com 10% de FCS.

Centrífuga a 500 vezes a gravidade por cinco minutos. Remova cuidadosamente o supernatante e mantenha a pelota. Adicione 30 mililitros de PBS, complementados com 2%de FCS.

Use contas magnéticas anti-CD para remover células CD2 positivas adicionando quatro contas para uma célula alvo. Incubar a 4 graus Celsius por 30 minutos. Usando um ímã para aplicação de separação celular, separe as células ligadas às contas das células desvinculadas.

Colete as células desvinculas e incuba-as com anticorpos anti-CD19 APC e anti-CD27 PE por quinze minutos a quatro graus Celsius. Lave as células duas vezes em PBS contendo 10% de soro de cabra. Em seguida, use o classificador de células para purificar as células B da memória a uma pureza de 95%.

Depois disso, adicione ligante CD40 solúvel e anticorpo monoclonal anti-polihistidina para ativação celular B de memória. Plaque as células B de memória purificada em placas de cultura de seis poços durante quatro dias com interleucina-2, interleucina-10 e interleucina-15. Para traçar perfis de expressão genética, use um classificador de células para purificar os préplasmablasts CD38 negativos CD38-negativos no quarto dia.

No quarto dia, conte as células e as emplaque em placas de cultura de 12 poços a uma densidade celular de 250.000 células por mililitro adicionando dois mililitros de suspensão celular em cada poço. Para induzir a diferenciação, remova os oligonucleotídeos CPG e o ligante CD40 solúvel e adicione um novo meio de cultura contendo um novo coquetel de citocina, incluindo interleucina-2, interleucina-6, interleucina-10 e interleucina-15. Cultue as células por três dias a 37 graus Celsius.

Para traçar perfis de expressão genética, use um classificador de células para purificar os plasmablastos de plasma CD38 positivos e CD20 negativos no sétimo dia. No sétimo dia, conte as células. Plaque as células em placas de cultura de 12 poços a uma densidade celular de 500.000 células por poço, adicionando dois mililitros de suspensão celular a cada poço.

Diferencie os plasmablastos em células plasmáticas precoces usando meio de cultura fresco contendo interleucina-6, interleucina-15 e interferon-alfa por três dias a 37 graus Celsius. Para traçar perfis de expressão genética, use um classificador de células para purificar as células plasmáticas iniciais CD20-negativas, CD38-positivas, CD138 no dia 10. Primeiro, as células estrogonais da cultura por cinco dias com o meio da cultura.

Use um filtro de 0,2 microliter para filtrar a cultura celular escrumal para obter o meio econsciente condicionado à célula estromada e congelar até estar pronto para usar. Em seguida, cultue as primeiras células plasmáticas em placas de cultura de 12 poços, usando o meio de células estromicinas previamente obtidas com interleucina-6 e ABRIL a uma densidade celular de 500.000 células por poço, adicionando dois mililitros de suspensão celular a cada poço. Incubar a 37 graus Celsius, renovando o meio condicionado de células estromas a cada semana.

Em seguida, meça a secreção de imunoglobulina a partir de células plasmáticas classificadas por citometria de fluxo. Cultue as células plasmáticas a uma densidade de um milhão de células por mililitro por 24 horas e colmeia a cultura sobrenatária. Usando um kit ELISA, meça a imunoglobulina G e a imunoglobulina A.First, inicie a ferramenta web de bioinformática de acesso aberto GenomicScape.

No menu de dados de navegação, selecione o conjunto de dados chamado células B humanas para células plasmáticas. A visualização do perfil de expressão genética de um gene ou lista de genes únicos está disponível usando a ferramenta Expression/Coexpression Report nas Ferramentas de Análise. Em seguida, selecione Ferramentas de análise webSAM para carregar a ferramenta SAM.

Escolha as células B humanas para o conjunto de dados das células plasmáticas e selecione o grupo de amostras para comparar. Use os diferentes filtros disponíveis para aplicar as opções de filtragem de interesse. Para comparar perfis de expressão genética com a ferramenta SAM, modifique as opções de filtragem, incluindo alteração de dobra, número de permutações, taxa de detecção falsa e o tipo de comparação.

O software calculará a análise e fornecerá genes expressos diferencialmente entre os grupos selecionados. Neste estudo, são investigadas as alterações de expressão dos fatores epigenéticos na diferenciação normal das células plasmáticas. Usando a análise sam multi-classe, 71 genes são vistos como significativamente expressos diferencialmente entre as células B da memória, os preplasmablasts, os plasmablastos, as células plasmáticas primitivas e as células plasmáticas da medula óssea com uma falsa taxa de descoberta de menos de 5%O estágio da célula B da memória é caracterizado pela superexpressão de 23 genes de jogadores epigenéticos, incluindo 39,13% de acetiltransferases histonas, 30,43% de histona metiltransferases , 21,74% das demetiláases de histona, 4,35% das proteínas de ligação de metila e 4,35% das deacetilases de histona.

14 genes de reprodução epigenética são superexpressos significativamente na fase pré-plasmablast, incluindo 50% das histonas metiltransferases, 14,28% das metiltransferases de DNA, 21,43% das deacetillases histonas, 7,14% das demetilases de histona e 17,14% das acetiltransferases de histona. Após este procedimento, várias análises para identificar e entender modificações na estrutura e arquitetura da cromatina durante essas diferenciações de células plasmáticas B2 poderiam ser realizadas. Este modelo de diferenciação in vitro permitirá gerar células suficientes para completar esta análise molecular para revelar tanto os caminhos envolvidos em toda essa modelagem quanto seu impacto transcricional a jusante durante a diferenciação de células plasmáticas B2.

Esse conhecimento derivado desta pesquisa poderia informar e instruir sobre estratégias diagnósticas e terapêuticas para distúrbios celulares plasmáticas, como no caso do mieloma múltiplo, um câncer sem cura definitiva, para o qual melhores prognósticos e melhores estratégias terapêuticas são criticamente necessárias. Caracterizar e compreender as mudanças estruturais e arquitetônicas de remodelação epigenética que afetam a cromatina durante a diferenciação de células plasmáticas B2 será de particular interesse. Isso poderia ser feito usando sequenciamento genético, ERRBS, sequenciamento ATAC, IC e sequenciamento de RNA.

Uma heterogeneidade moderada poderia ser observada na porcentagem de células B ativadas, preplasmablasts, plasmablastos e células plasmáticas, dependendo do sangue saudável do doador, usado para purificação celular B da memória.