Name: Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a avaliar respostas imunes e eficácia vacinal em camundongos usando modelos in vivo de patógenos. Este método permite medir carga bacteriana e reações imunológicas em tempo real.

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Este trabalho foi financiado por fundos de 1R01AI125560-01 e start-up da The Ohio State University.

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<li>Hagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Multi-Donor+Study+of+IFNgamma+Secretion+and+Expression+by+Human+PBMCs+Using+ELISPOT+Side-by-Side+with+ELISA+and+Flow+Cytometry+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays.</a> Cells. 4 (1), 84-95 (2015).</li>
<li>Raeven, R. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+signatures+underlying+superior+immunity+against+Bordetella+pertussis+upon+pulmonary+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination.</a> Mucosal Immunology. 11 (3), 1009(2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo completo descrito aqui para estudar a imunidade induzida pela vacina contra a infecção de b. pertussis também permitirá a avaliação das respostas de anfitrião a uma variedade de outros patógenos. O protocolo descreve os métodos para entregar imunizações, determinar a seguinte eficácia de vacina patógeno desafio e dissecação paralela da função imune. Na adaptação do protocolo a fim de estudar outros patógenos, vários parâmetros precisaria ser modificado. Estes incluem, mas não estão limitados a, o mod...

As vacinas representam uma das maiores conquistas da saúde pública do século XX, no entanto, nós ainda não entendemos completamente os mecanismos pelos quais vacinas bem sucedidas estimulam a imunidade protetora. A identificação de assinaturas moleculares (EG., marcadores de ativação celular, expansão dos subtipos celulares e os padrões de expressão gênica) induzido após vacinação fornece uma infinidade de informações para prever e gerando uma eficaz resposta imune. A complexidade das respostas do hospedeiro-patógeno não pode ser adequadamente replicada usando em vitro celular cultura sistemas1. Na vivo vacina modelos são projetados para avaliar concomitantemente vários tipos de células imunes dentro do host. Isso fornece uma vantagem quando caracterizando processamento de antígeno de vacina e apresentação, secreção de citocinas diferencial e expansão de células do sistema imunológico. O protocolo descrito aqui fornece um método detalhado para determinar a eficácia da vacina através da avaliação das respostas imune locais e sistêmicas e quantificação da carga de agentes patogénicos em tecidos de interesse. O exemplo fornecido aqui testa a eficácia de uma vacina experimental para o patógeno Bordetella pertussis (b. pertussis).
B. pertussis é uma bactéria Gram-negativa, que é o agente etiológico da doença respiratória tosse convulsa (coqueluche)2,3. Contato direto com indivíduos infectados (sintomáticos ou assintomáticos) leva à transmissão, colonização e doença. Apesar da vacina global significativa cobertura4, coqueluche é considerada uma doença ressurgente em muitas nações ao redor do mundo e é das principais causas de infância evitáveis mortes5,6,7, 8. em 2015, b. pertussis e coqueluche foram incluídas no Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (NIAID) emergentes lista de patógeno/doenças infecciosas, enfatizando a necessidade de desenvolvimento de uma vacina melhor que confere vida longa imunidade protetora.
Atualmente, uma área ativa de investigação para controlar o ressurgimento da coqueluche é o desenvolvimento de uma vacina pertussis acelular de próxima geração (aPV) com uma combinação ideal de romance adjuvantes e antígenos para imitar a resposta imune eliciada a célula inteira coqueluche vacina (wPV)9. Usando o protocolo descrito, nos informou recentemente que a modificação de um atual aprovado pela FDA aPV pela adição de um adjuvante de romance, fator de colonização de Bordetella A (BcfA), resultou em uma redução mais eficiente da b. pertussis carga bacteriana de rato pulmões10,11. Esta proteção aumentada foi acompanhada pela inclinação de uma alum-induzida resposta imune de Th1/Th2 na mais protetor de perfil imune Th1/Th1710. Este protocolo é detalhada e abrangente, permitindo que o investigador para obter máximas informações por meio de avaliação simultânea de host e respostas imunes a uma variedade de agentes patogénicos.
O protocolo descrito aqui segue o calendário de vacinas representativa, mostrado na Figura 1, para garantir respostas imunes de anfitrião ideal.

<table><tbody><tr><td>Câmara de indução 2L</td><td>Vet Equip</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>Vet One</td><td>V1 501017</td><td>qualquer marca é apropriada</td></tr><tr><td>Base de ágar Bordet Gengou BD</td><td>bioscience</td><td>248200</td><td></td></tr><tr><td>Caseína</td><td>Sigma</td><td>C-7078</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos Casamino</td><td>VWR</td><td>J851-500G</td><td>Filtro Scholte (SS) componentes de mídia</td></tr><tr><td>Ácido L-glutâmico</td><td>Produtos de Pesquisa Int</td><td>G36020-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Produtos de Pesquisa Int</td><td>P50200-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio monobásico</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio hexahidratado</td><td>Fisher</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio</td><td>Fisher</td><td>C75-500</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína HCl</td><td>Fisher</td><td>BP376-100</td><td>SS suplementos de mídia</td></tr><tr><td>Sulfato ferroso heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>F-7002</td><td></td></tr><tr>Produtos de pesquisa de<td>niacina</td><td>Int</td><td>N20080-100</td><td></td></tr><tr><td>Glutationa</td><td>Produtos de Pesquisa Int</td><td>G22010-25</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Ascórbico</td><td>Produtos de Pesquisa Int</td><td>A50040-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442-500mL</td><td>&nbsp; qualquer fonte dos EUA,</td></tr><tr><td>gentamicina</td> não inativada por calor <td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>B-mercaptoetanol</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>15mL moedor de tecidos dounce</td><td>Wheaton</td><td>357544</td><td>qualquer marca semelhante é apropriado</td></tr><tr><td>Homogeneizador de Mão Sem Fio</td><td>Kontes/Sigma&nbsp;</td><td>Z359971-1EA</td><td>qualquer marca semelhante é apropriada</td></tr><tr><td>Instrumentos - tesouras, tesouras curvas, fórceps, pinças finas, espalhadores de</td><td></td><td></td> triângulo <td>qualquer marca é apropriada</td></tr><tr><td>Seringas de 3mL</td><td>BD bioscience</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 15mL</td><td>Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>339651</tr><tr><td>tubos de microfuga de 1,5mL</td> Filtros de células <td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>70um</td><td>Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>22363548</tr><tr><td>placas de 60 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultura de tecidos de 48 poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-772-1C</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina de 1 mL 28G1/2</td><td>Fisher Scientific/Excel Int.</td><td>14-841-31</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit</td><td>Invitrogen / eBioscience</td><td>50-173-21</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit</td><td>Invitrogen / eBioscience</td><td>50-173-77</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit</td><td>Invitrogen / eBioscience</td><td>50-172-09</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

As vacinas são uma maravilha deth do século 20 médica. Eles reduziram drasticamente a morbidade e a mortalidade causada por doenças infecciosas e contribuíram para um aumento marcante na expectativa de vida ao redor do globo. No entanto, determinar a eficácia da vacina continua a ser um desafio. Emergentes a evidência sugerem que a atual vacina acelular (aPV) para Bordetella pertussis (b. pertussis) induz imunidade suboptimal. Portanto, um grande desafio é projetar uma vacina de próxima geração que induz a imunidade protetora, sem os efeitos colaterais de uma vacina de células inteiras (wPV). Aqui descrevemos um protocolo que usamos para testar a eficácia de um adjuvante promissora, a novela que distorce as respostas imunes de um fenótipo Th1/Th17 protetora e promove um melhor apuramento de um desafio de b. pertussis do tracto respiratório murino. Este artigo descreve o protocolo para a imunização de rato, inoculação bacteriana, tecido colheita e análise de respostas imunes. Usando esse método, dentro de nosso modelo, nós com sucesso ter elucidado mecanismos cruciais, provocados por uma vacina pertussis acelular promissor de última geração. Esse método pode ser aplicado para qualquer modelo de doença infecciosa, a fim de determinar a eficácia da vacina.

O modelo descrito mostra um método para avaliar a eficiência de vacina e respostas imunes durante as interações patógeno-hospedeiro. A Figura 1 mostra o calendário de vacinas representante usado para imunizar e infectar camundongos e colheita de tecidos para análise. A Figura 2 demonstra a configuração do sistema de anestesia empregado para induzir os ratos, permitindo que os investigadores entregar imunizações e inóculo bacteria...

Aqui nós apresentamos um protocolo elegante na vivo avaliação da vacina respostas imunes de eficácia e de acolhimento. Este protocolo pode ser adaptado para modelos de vacina que estudar virais, bacterianas ou parasitárias patógenos.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

O protocolo permite a avaliação das respostas do hospedeiro a uma variedade de patógenos e formulações de vacinas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a avaliação da carga bacteriana e das respostas imunes in vivo, utilizando um modelo animal tratável. Demonstrando este procedimento está Kacy Yount, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.Para a imunização, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do sol em um rato anestesiado de seis a doze semanas de idade, e carregue uma seringa de insulina de um mililitro, equipada com uma agulha calibre 28,5 com um mililitro de 0,1 mililitro da vacina de interesse. Segurando a seringa em um ângulo de 45 graus, com o bisel voltado para cima, insira a agulha aproximadamente cinco milímetros no deltoide do camundongo e injete a vacina. Mantenha a agulha inserida no músculo por cinco a dez segundos, depois gire a seringa 180 graus, de modo que o chanfrado esteja virado para baixo para criar uma vedação, e para evitar o vazamento da vacina, antes de retirar lentamente a agulha do local da injeção.Em seguida, devolva o mouse para sua gaiola, com monitoramento, até a recuperação completa. Cerca de duas semanas depois de impulsionar, infectar camundongos imunizados. Segure um rato anestesiado pelo escroto do tórax dorsal, atrás das omoplatas e pescoço, e posicione o mouse ereto para acessar o nariz.Usando uma ponta de pipeta de 200 microliteres, aplique lentamente de 20 a 25 microlitrais do inóculo bacteriano de interesse a cada nare do animal, segurando o rato até que todo o inóculo tenha sido inalado. Em seguida, entregue um volume igual de PBS estéril a um grupo de ratos como um controle negativo. No ponto final experimental apropriado, coloque um lado ventral do rato infectado em uma placa de dissecção e proteja os membros.Molhe o corpo com 70% de etanol, e use fórceps para apertar a pele abaixo do abdômen no centro da pelve. Usando uma tesoura afiada, faça um corte vertical até a mandíbula, e disseca a pele da parede peritoneal. Mova a pele para os lados da carcaça para criar um campo desobstruído para a colheita de órgãos estéreis, e segure o peritônio intacto abaixo da caixa torácica, em ou perto do fígado.Corte o peritônio em direção à caixa torácica para expor o trato digestivo inferior, e mova o cólon para a esquerda para revelar o baço. Usando fórceps curvas, segure o baço e disseca o tecido conjuntivo com uma tesoura. Em seguida, coloque o baço em um tubo cônico de 15 mililitros contendo 3 mililitros de RPMI, e 5% de soro bovino fetal no gelo.Use fórceps para estabilizar a caixa torácica no processo xifoide e abra o diafragma. Os pulmões devem esvaziar, e cair em direção à coluna. Corte a caixa torácica nas laterais para remover o peitoril, e corte as artérias e veias pulmonares para isolar e remover o lobo superior do pulmão direito.Fixar o lobo em um tubo cônico de 15 mililitros de formalina tamponada 10% neutra à temperatura ambiente por pelo menos 24 horas, e isolar os lóbulos restantes dos pulmões direito e esquerdo. Em seguida, coloque lóbulos em um tubo cônico de 15 mililitros, contendo dois mililitros de 1% de caseína em PBS no gelo. Use um pipetman de um mililitro com ponta para coletar o sangue que preenche a cavidade torácica, e transfira o sangue para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro no gelo.Remova as glândulas e linfonodos parótidas, sublinguais e submaxilares que cobrem a traqueia, e abra e remova as membranas protetoras ao redor da traqueia. Usando fórceps finos e tesouras, separe cuidadosamente a traqueia do esôfago, e qualquer outro tecido conjuntivo do topo das clavículas até a parte inferior da mandíbula. Use fórceps para segurar a traqueia, e corte a traqueia no topo da clavícula.Puxe a traqueia para maximizar a elasticidade, e corte a traqueia na parte inferior da mandíbula, bem acima da laringe, isolando cerca de um centímetro de tecido. Em seguida, coloque o órgão em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro pré-rotulado, contendo 0,3 mililitros de 1% de caseína em PBS no gelo. Agora gire o mouse para acesso claro ao nariz, e pulverize a cabeça com 70% de etanol.Segure manualmente o animal diretamente atrás do crânio, e use uma tesoura para cortar a carne macia do focinho, começando da parte inferior do nariz e movendo-se para cima. Retire a pele, a pele e os bigodes ao redor do nariz, e insira as pontas de um par de tesouras curvas nas nares com as curvas apontadas para baixo. Abra a passagem nasal em direção aos olhos, criando uma formação em v.Em seguida, use fórceps finos para coletar o septo nasal e tecido mole dentro da formação, e coloque o tecido em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros pré-rotulado contendo 0,3 mililitros de 1% de caseína em PBS, no gelo. Para processar o tecido pulmonar, transfira todo o conteúdo do tubo da amostra pulmonar em um homogeneizador do Dounce de 15 mililitros e use um pilão para homogeneizar o tecido. Dissociar a amostra até que não permaneçam grandes partículas de tecido e retorne a suspensão homogeneizada ao tubo original de 15 mililitros.Remova uma alíquota de 0,3 mililitro para unidades formadoras de colônias de chapeamento e colete o resto do homogeneado por centrifugação. Alíquota 0,5 mililitros de supernascer em tubos de microcentrifuuge pré-rotulados para armazenamento a 20 graus Celsius até a análise da expressão citocina por Eliza. Em seguida, diluir em série 0,1 mililitros alíquotas da suspensão pulmonar homogeneizada em 0,9 mililitros de PBS estéril por diluição, e usar um divisor de triângulos estéril para placa 0,1 mililitro de cada diluição empiricamente escolhida em placas de 10% Bordet-Gengou mais estreptomicina.Aqui, são mostrados 600 medições e cálculos de densidade óptica representativa para alcançar uma suspensão bacteriana de densidade óptica, para preparar um inóculo bacteriano diluído de cem vezes a ser entregue aos camundongos. Após sete dias de estimulação de antígenos vacinais, células de baço imunizadas do grupo de vacina combinada produzem interferon gama, e IL17, enquanto regulam significativamente o IL5, promovendo um ajudante T, um auxiliar T 17 polarização da resposta imune durante uma infecção por coqueluche B. A enumeração da unidade de formação de colônias de bactérias recuperadas de problemas do trato respiratório de um rato infectado por coqueluche B pode ser usada para avaliar os efeitos protetores da vacina de interesse.Trabalhe o mais rápido e eficiente possível para evitar a necrose tecidual, e armazene o tecido isolado no gelo para preservar a viabilidade das bactérias recuperadas. A citometria de fluxo ELISpot e o isolamento de DNA e RNA podem ser realizados para avaliar células imunes, produção de analitos e permitir análises epigenéticas e transcriômicas. Ao trabalhar com agentes infecciosos como a coqueluche Bordetella, é importante lembrar de usar o EPI apropriado, e trabalhar em um armário de biossegurança certificado para evitar a transmissão de patógenos.Este protocolo detalha a enumeração da UFC do trato respiratório, especificamente a faringe nasal. Para tirar dúvidas sobre a vacina e as áreas de doenças infecciosas sobre o direcionamento da colonização bacteriana no nariz.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para testar a eficácia de uma vacina acelular contra coqueluche acelular contra a infecção por Bordetella pertussis em camundongos. Após a vacinação, os camundongos foram submetidos à infecção e seu homogeneizado tecidual foi cultivado para analisar as colônias bacterianas como uma leitura da imunidade protetora induzida pela vacina.

Avaliação da imunidade induzida por vacina contra infecção bacteriana em modelo de camundongo

A resposta imune do hospedeiro à infecção do agente patogénico é um processo fortemente regulado. Utilizando um modelo de exposição do pulmão lipopolissacarídeo em ratos, é possível realizar avaliações de alta resolução dos complexos mecanismos associados à patogênese da doença.

A utilização de orofaringe Intratraqueal Administração PAMP e Lavagem Broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos

Os modelos animais provaram ser ferramentas valiosas para a definição de acolhimento e de patógenos mecanismos específicos que contribuem para o desenvolvimento da inflamação crônica. Aqui nós descrevemos um modelo do rato de infecção oral com o patógeno humano Porphyromonas gingivalis e metodologias detalhe para avaliar a progressão da inflamação em sites locais e sistêmicos.

Um modelo de rato para induzida por patógeno inflamação crônica no local e sistêmica Sites

Detalhamos aqui a metodologia seguida para comparar a eficácia protetora e a resposta imune pulmonar induzida pela imunização intranasal e subcutânea com BCG em modelo de camundongo. Nossos resultados mostram os benefícios da vacinação pulmonar e sugerem um papel da resposta mediada por IL17 na proteção induzida pela vacina.

A eficácia de protecção e Pulmonar resposta imune Seguindo subcutânea e intranasal BCG Administração em Ratinhos

Este protocolo descreve como para inocular ratinhos C57BL / 6J com a estirpe de Listeria monocytogenes EGD (L. monocytogenes) e para medir o interferão-γ (IFN-γ) respostas de células assassinas naturais (NK), as células T assassinas naturais (NKT), e adaptativa linfócitos T após a infecção. Este protocolo descreve como também a realização de estudos de sobrevivência de ratinhos após a infecção com uma dose de LD 50 modificada do agente patogénico.

Infecção experimental com<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y

Vírus da influenza A (IAVs) são importantes patógenos respiratórios humanos. Para entender a patogenicidade de IAVs e realizar testes pré-clínicos de vacina romance abordagens, modelos animais, imitando a fisiologia humana são necessários. Aqui, descrevemos técnicas para avaliar a patogênese do IAV, respostas humorais e eficácia de vacina usando um modelo do rato da infecção.

Estudos de vírus da influenza A em um modelo do rato da infecção

Apresentamos aqui um pedido de uma norma técnica imunológica (CFSE manchado OT-eu proliferação) destinados a monitorar rapidamente mediada por adjuvante T linfócitos citotóxicos (CTL) geração in vivo. Esta estimativa rápida das capacidades CTL é útil para o desenvolvimento de vacinas profiláticas contra patógenos intracelulares, bem como as vacinas terapêuticas do câncer.

Rápida na Vivo avaliação dos recursos de geração de linfócitos de T citotóxicos do adjuvante para desenvolvimento de vacinas

Uma abordagem é descrita para a detecção em tempo real da resposta imune inata de ferimento cutâneo e Staphylococcus aureus infecção de ratos. Por LysM-EGFP comparando os ratos (que possuem fluorescentes neutrófilos) com um LysM-EGFP mestiços cepa de rato imunodeficientes, avançamos nossa compreensão da infecção e o desenvolvimento de abordagens para combater a infecção.

Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

Este artigo descreve protocolos de avaliação da resposta Tfh e GC B no modelo de camundongos de infecção por vírus influenza.

Avaliação de células auxiliares tolas e resposta do centro germinal durante a infecção pelo vírus da influenza A em camundongos

Aqui, apresentamos um método eficaz e eficiente para injeções de veias da cauda de roedores usando um dispositivo de aquecimento/contenção exclusivamente projetado. Ao simplificar o início dos processos de vasodilatação e contenção, este protocolo permite injeções intravenosas precisas e oportunas de grandes grupos de animais com o mínimo de angústia.

Um dispositivo de aquecimento/contenção contemporâneo para injeções eficientes de veia de cauda em um modelo de sepse fúngica murina

O presente protocolo prepara e avalia as propriedades físicas, a resposta imune e o efeito protetor in vivo de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão.

Avaliação da Resposta Imune de uma Vacina Adjuvante em Nanoemulsão Contra a Infecção por Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (MRSA)

Aprenda a avaliar respostas imunes e eficácia vacinal em camundongos usando modelos in vivo de patógenos. Este método permite medir carga bacteriana e reações imunológicas em tempo real.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

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