Name: Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprenda imuno-histoquímica em neuroesferas de glioma preservando a estrutura 3D durante a inclusão em parafina. Este método mantém a morfologia celular para análise precisa de biomarcadores tumorais em oncologia.

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Este trabalho foi financiado pelo National institutos de saúde nacional Instituto de doenças neurológicas & Stroke (NINDS/NIH) subvenções R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 para M.G.C.; NINDS/NIH concede R01-NS076991 e NS082311-R01 R01-NS096756 a P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; o departamento de neurocirurgia; Corações feliz da Leah M.G.C. e P.R.L.; e RNA biomedicina Grant F046166 para M.G.C. F.M.M. é suportado por um F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. foi apoiado por um argentino Fulbright Ministério do esporte e educação Fellowship.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Michigan e institucional Cuidado Animal.
1. geração de Neurospheres de Tumor de cérebro derivado de um modelo de Mouse
<ol><li>Antes do procedimento de dissecação, preparar a mídia de células-tronco neurais (NSC Media: DMEM/F12 com 1 suplemento de x B27, 1 x N2 suplemento, 1 x normocin e 1 x antibiótico/antimicótico suplementado com humano recombinante EGF e basic-FGF em concentrações de 20 ng/mL cada). Encher um tubo de 1,5 mL com 300 µ l de mídia NSC e reservar para mais tarde.</li>
	<li>Selecione um rato com um grande tumor. Nota: O tamanho de um tumor pode ser monitorado por bioluminescência se o plasmídeo ou vírus injetado codifica luciferina. Geralmente, um grande tumor tem uma bioluminescência de > 106 fótons/s/cm2/sr.</li>
	<li>Eutanásia o mouse com uma overdose de isoflurano: infundir um papel de tecido com isoflurano e introduzir o tecido em uma câmara de eutanásia, evitando o contato direto com os ratos para evitar a irritação. Espere até que os ratos não mostram um reflexo pedal (geralmente 5-10 min). Decapitar o mouse e dissecar o cérebro conforme descrito em Calinescu et al 13.</li>
	<li>Se os tumores são fluorescentes, use um dissecação microscópio equipado com uma lâmpada fluorescente para identificar a massa tumoral dentro do cérebro. Com a pinça fina, disse o tumor (geralmente de 5 a 7 mm de diâmetro) no tecido cerebral normal.</li>
	<li>Coloque o tumor dissecado no tubo de 1,5 mL com mídia NSC (etapa 1.1). Homogeneizar o tumor com um pilão de plástico descartável que se encaixa as paredes do tubo microcentrifuga aplicando uma pressão suave.</li>
	<li>Para dissociar as touceiras de célula, adicione 1 mL de mídia livre de enzima dissociação e incubar durante 5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Filtrar a suspensão através de um filtro de célula 70 µm e lavar o filtro com 20 mL de mídia NSC.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g por 5 min, decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 6 mL ou 15 mL de mídia do NSC, dependendo do tamanho da pelota.</li>
	<li>Placa da suspensão de células de tumor em um frasco de cultura T-25 ou T-75 e cultura a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos, com uma atmosfera de 95% de ar e 5% CO2.</li>
	<li>Depois de 3 dias, transferir o NS suspenso saudável e re-placa-los em um frasco de cultura de tecidos T-25 ou T-75. Se necessário, adicione mais mídia NSC para a cultura. Nota: Normalmente, haverá uma população mista de células, alguns estarão mortos, alguns vão ter aderido e algumas vão ser formando NS que irá flutuar na mídia</li>
</ol>2. manutenção e passagem do NS
Nota: Prevenir o crescimento excessivo e manter as células em densidade relativamente alta. Confluência é determinada pelo tamanho de esferas (pretos centros de grandes esferas supercrescimento de média). A taxa de crescimento do NS dependerá as oncogenes usados para gerar tumores.
<ol><li>Uma vez que a cultura de NS alcançou a confluência, pelota o NS a 300 x g por 5 min e coletar a cultura num tubo de centrífuga estéril.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 mL da solução de desprendimento de célula Pipetar para Ressuspender o pellet.</li>
	<li>Incube a 37 ° C por 5 min, passando rapidamente o tubo cada 2 min para ajudar a dissociação de célula. Nota: Quando NS alcançar confluência, eles podem ser normalmente vistos macroscopicamente como pequenas esferas brancas. Para assegurar a dissociação de célula, pelo menos todos os NS visíveis deve ter desaparecido.</li>
	<li>Adicionar 5 mL de HBSS 1 x e pipeta várias vezes. Pellet de células a 300 x g, durante 5 min. descartar o sobrenadante. Ressuspender o pellet em 5 mL de mídia NSC suplementada com recombinante EGF e basic-FGF.</li>
	<li>Adicione 1 mL de células para 15 mL de NSC mídia e cultura num balão de T-75 a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos, com uma atmosfera de 95% de ar e 5% CO2.</li>
	<li>Adicione fatores de crescimento (EGF e basic-FGF) a cada 3 dias. Se a mídia se transforma luz laranja e as células ainda não são confluentes, mudar os meios de comunicação. Para fazer isso, centrifugar o NS a 300 x g, durante 4 min e ressuspender em mídia NSC suplementada com fatores de crescimento. Nota: Dependendo do tamanho da pelota formado, células podem precisar ser dividido em mais balões.</li>
</ol>3. NS de congelamento para armazenamento a longo prazo
<ol><li>Quando a cultura NS se tornar confluente, dissocia as células como descrito nos passos 2.1-2.4. Uma vez que o sedimento foi re-suspenso em HBSS, retirar uma alíquota e contar as células.</li>
	<li>Centrifugar as células em 300 x g, durante 4 min e remover o máximo possível do líquido sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em congelamento mídia (FBS inactivados por calor, 10% DMSO). É aconselhável congelar entre 1 x 106 e 3 x 106 células por frasco por mL.</li>
	<li>Divida as células re-suspensas em tantas cryovials como necessários e lentamente arrefecer os frascos pela primeira transferi-las para gelo, então a-20 ° C, então a-80 ° C e, finalmente, no dia seguinte para um recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido.</li>
</ol>4. fixação do Tumor NS
<ol><li>Tumor de cultura NS num balão de T-25 por 2-3 dias até que as células são confluentes (~ 3 x 106 células). Recolha o tumor NS em um tubo cônico de 15 mL de um frasco confluente menos de um T-25. Pelota a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em 1 mL de formol a 10% e manter à temperatura ambiente (RT) por 10 min. adicionar 5 mL de 1 x HBSS e as células como feito no passo 3.2 de Pelotas. Repita essa etapa mais uma vez.</li>
	<li>Coloque o tubo cônico de 15 mL, contendo a pelota no gelo.</li>
</ol>5. parafina incorporação de Tumor NS
<ol><li>Ressuspender o pellet NS lavado em 500 µ l de 2% de agarose líquido morno e misture suavemente pipetando.</li>
	<li>Coloca imediatamente o NS de agarose-incorporado no gelo até se polimeriza a agarose. Retire o pedaço de agarose abrigando o NS. Coloque o pedaço de agarose polimerizado com o NS na gaveta para tecido de transformação (Figura 2).</li>
	<li>Continuar com o processamento do tecido (usando um processador automático de parafina) e incorporação de objetos (usando uma estação de encaixe) de parafina.</li>
</ol>6. corte de parafina NS
<ol><li>Definir o banho-maria a 42 ° C e coloque a lâmina sobre o micrótomo com cuidado, usando dois pincéis para certificar-se de que está nivelado. Use esta lâmina apenas para aparar.</li>
	<li>Coloque o bloco de parafina no micrótomo. Com a mão não dominante, pressione a alavanca localizada no lado esquerdo que controla a espessura de cada seção. Pressione para a segunda parada que indica uma espessura de 30 µm.</li>
	<li>Começar a aparar o bloco (i. e., removendo o excesso parafina) girando a roda de mão grossa com a mão direita até atingir a superfície da amostra. Neste ponto, solte a alavanca que controla a espessura guarnição a 10 μm ou 5 μm. Pare de aparar quando a superfície da amostra é alcançada.</li>
	<li>Preencher uma caixa de gelo com gelo e adicione água suficiente apenas para que quando o bloco de parafina é colocado no gelo, a água atua como um filme em torno do bloco de parafina, protegendo-o de tocar diretamente o gelo. Incube o bloco de parafina no gelo por 20 min.</li>
	<li>Descarte a lâmina velha e inserir um novo para a corte. Bloco seco usando gaze, coloque-o sobre o micrótomo.</li>
	<li>Com a mão não dominante, obter um par de pinças curvas que serão usados para puxar a fita de parafina. Manter um pincel úmido perto da mão direita, que será usado para transferir a faixa de opções de parafina para banho. Começar a seção girando a roda de mão grossa com a mão direita em um rápido ritmo. Use a pinça na mão esquerda para segurar a fita de parafina.</li>
	<li>Use o pincel úmido para transferir a fita de parafina para o banho de água.</li>
	<li>Use a curva da pinça para separar as seções superficialmente colocando a pinça entre as duas secções de parafina, e pressionando as duas seções fora delicadamente. Nota: Este movimento deve ser totalmente sobre a superfície da seção de parafina. Não pressione a seção.</li>
	<li>Use o pincel úmido para empurrar as seções separadas de parafina em corrediças do microscópio de adesão carregadas positivamente.</li>
	<li>Permitir que os slides para secar durante a noite dentro de uma capa de química antes de armazená-los em caixas de slide. O armazenamento de slides depende do tipo de mancha realizada.</li>
</ol>7. imuno-histoquímica (IHC) de parafina NS
<ol><li>Derreta parafina colocando os slides em uma cremalheira do metal e incubando-os a 60 ° C por 20 min.</li>
	<li>Deparaffinize os slides de incubação em um trem de reidratação em RT: 3x xileno por 5 min, 100% de etanol x 2 para 2 min, etanol a 95% x 2 para 2 min, etanol a 70% 1 x por 2 min e 1 x água desionizada para 2 min. Hereon, manter as lâminas em água da torneira até a recuperação do antígeno , como secagem causará a ligação do anticorpo específico.</li>
	<li>A incubar em tampão citrato (ácido cítrico de 10mm, 0,05% de detergente não-iônico, pH 6) a 125 ° C por 30 s e 90 ° c, durante 10 s. Deixe-as arrefecer e, em seguida, enxágue as lâminas 5 vezes com água destilada.</li>
	<li>Incube em RT em 0,3% H2O2 por 30 min.</li>
	<li>Lave as lâminas 3 vezes no tampão (0.025% de detergente na TBS) por 5 min com agitação suave de lavagem.</li>
	<li>A incubar em RT com bloqueio de solução (soro de cavalo de 10%, 0,1% BSA em TBS) por 30 min.</li>
	<li>A incubar durante a noite a 4 ° C, numa câmara umidificada com anticorpo primário, preparado em solução de diluição (0,1% BSA em TBS). Lave as lâminas 3 vezes no buffer para 5 min com agitação suave de lavagem.</li>
	<li>Incube os slides no RT para 1 h com anticorpo secundário biotinilado, preparado em solução de diluição. Lave as lâminas 3 vezes no buffer para 5 min com agitação suave de lavagem.</li>
	<li>Incube em RT no escuro por 30 min com peroxidase de rábano avidina-biotinilado complexo. Lave as lâminas 3 vezes no buffer para 5 min com agitação suave de lavagem.</li>
	<li>Incubar as lâminas com DAB-H2O2 substrato marcas aqui durante 2-5 min à RT</li>
	<li>Lavar 3 vezes com água da torneira. Mergulho (1-2 s) as lâminas em solução de hematoxilina de counterstain e enxague bem em água corrente até a clareira.</li>
	<li>Desidratar os slides como segue: incubar em água destilada por 2 min, mergulhe 3 vezes em 80% de etanol, incubar em etanol a 95% 2 vezes por 2 min cada, incubar em etanol 100% 2 vezes por 2 min cada e finalmente em xilol 3 vezes por 3 min cada.</li>
	<li>Lamela dos slides com um meio de montagem baseada em xileno e deixe-os secar sobre uma superfície plana em RT até que estejam prontos para a imagem latente.       Nota: Se executar 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) coloração, as lâminas podem ser armazenadas no RT No entanto, se a mancha da imunofluorescência é executada, slides devem ser armazenados no escuro a-20 ° C para reduzir a foto-branqueamento.</li>
</ol>

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<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Glioblastoma+Cell+Culture+Resource%3A+Validated+Cell+Models+Representing+All+Molecular+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes.</a> EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).</li>
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<li>Dirks, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cells%3A+bringing+order+to+the+chaos+of+brain+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).</li>
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<li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).</li>
<li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51088(2014).</li>
<li>Pileri, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+techniques+in+immunohistochemistry%3A+comparison+of+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods.</a> The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste artigo, detalhamos um método versátil e pode ser reproduzido para realizar a imuno-histoquímica na parafina glioma NS, que mantêm a estrutura 3D característica de células de tumor crescendo no cérebro em situ. Esta técnica possui as seguintes vantagens sobre usando células chapeadas em vidro ou superfícies de plástico: eu) preservação da estrutura 3D do NS; II) evitando stress de dissociação de célula antes da análise da expressão da proteína; III) têmpera de qualquer expressão de fluoróforo endógena de tu...

Gliomas são tumores sólidos primários do sistema nervoso central, classificadas por suas características fenotípicas e genotípicas de acordo com a Organização Mundial de saúde1. Esta classificação incorpora a presença ou ausência de mutações do motorista, que representam uma fonte atraente de biomarcadores2. Biomarcadores são características biológicas que podem ser medidas e avaliadas para indicar processos normais e patológicos, bem como respostas farmacológicas para uma intervenção terapêutica3. Biomarcadores podem ser detectados no tecido do tumor e células derivadas de glioma, permitindo a sua caracterização biológica em diferentes aspectos. Alguns exemplos de biomarcadores de glioma mutante isocitrato desidrogenase 1 (IDH1), uma enzima mutante característica de gliomas de baixo grau associadas a melhor prognóstico4. IDH1 mutado é expressa frequentemente em combinação com TP53 e síndrome de deficiência de alfa-talassemia/mental ligada ao X (ATRX)-Inactive mutações, definindo um glioma específico de subtipo4,5. ATRX-inactivar as mutações também ocorrem em 44% dos gliomas de alto grau pediátrica2,6 e têm sido associadas com tumores agressivos e instabilidade genômica6,7. Além disso, pediátricas gliomas Pontinas intrínsecas difusas (DIPG) são diferenciadas em subgrupos de acordo com a presença ou ausência de uma mutação K27M no gene de histona H3 H3F3A, ou no gene1,HIST1H3B/C6. Portanto, a introdução de caracterização molecular permite a subdivisão, estudo e tratamento de gliomas como entidades separadas, o que permitirá mais o desenvolvimento de mais direcionados a terapias para cada subtipo. Além disso, a análise de biomarcadores pode ser usada para avaliar diferentes processos biológicos, tais como apoptose8, autofagia9, de progressão do ciclo celular10, proliferação de célula11e diferenciação celular12 .
Modelos de animais geneticamente modificados que abrigam as lesões genéticas presentes em cânceres humanos são fundamentais para o estudo da sinalização de caminhos que medeiam a progressão da doença. Nosso laboratório implementou o uso do sistema de transposase beleza dormindo (SB) para desenvolver modelos de rato geneticamente modificados de glioma abrigando mutações específicas que recapitular glioma humano subtipos13,14. Estes modelos de rato geneticamente modificados são usados para gerar tumor derivado NS, que permitem estudos em vitro em um sistema 3D, espelhamento principais características presentes nos tumores in situ15. Além disso, o transplante de orthotopical de NS em ratos pode gerar tumores secundários que retêm características do tumor primário e imitam as propriedades fenotípicas, genômicas e histopatológicas do tumor primário correspondente15.
Em cultura livre de soro, células de tumor cerebral com propriedades de célula-tronco podem ser enriquecidas, e na presença de fatores de crescimento epidérmico (EGF) e fatores de crescimento do fibroblasto (FGF), eles podem ser crescidos como colônias única derivado de células, tais como culturas de NS. Neste sistema de cultura seletiva, a maioria das células de diferenciação ou diferenciados rapidamente morrer, Considerando que as células-tronco dividir e formar os grupos celulares. Isto permite a geração de uma cultura de NS que mantém glioma tumor características16,17,18. Glioma NS pode ser usado para avaliar diversos aspectos da biologia do tumor, incluindo a análise de biomarcadores que têm aplicações em diagnóstico, prognóstico, classificação, estado de progressão do tumor e estado de diferenciação da célula. Aqui, detalhamos um protocolo para gerar glioma NS e incorporar as culturas 3D em parafina a ser usado para coloração de IHC. Uma vantagem da fixação e incorporação de glioma NS é que a morfologia do NS é mantida melhor em comparação ao convencional cytospin método19, no qual glioma NS estão sujeitos à manipulação estressante para dissociação da célula em tornam-se achatados. Além disso, a incorporação sacia qualquer expressão de fluoróforo endógena de tumor geneticamente NS, permitindo que a coloração em todo o espectro fluorescente. O objectivo geral deste método é para preservar a estrutura 3D de células de glioma através de uma processo de incorporação de parafina e permitir a caracterização de glioma neurospheres usando imuno-histoquímica.

<table><tbody><tr><td>Lâmina de micrótomo revestida HP35</td><td>Thermo Scientific</td><td>3150734</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo RM 2135</td><td>Leica</td><td>MR2135</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formalina, tamponada neutra, 10%</td> <td>Sigma-aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Coelho policlonal anti-ATRX,</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-15408</td><td>IHC, diluição 1:250</td></tr><tr><td>Coelho policlonal anti-Ki-67</td><td>Abcam</td><td>Ab15580</td><td>IHC, diluição 1:1000</td></tr><tr><td>Coelho policlonal anti-OLIG2</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>IHC, diluição 1:500</td></tr><tr><td>Cabra policlonal anti-coelho conjugado com biotina</td><td>Dako</td><td>E0432</td><td>IHC, diluição 1:1000</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC HRP kit</td><td>Vector Laboratories Inc</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT</td><td>Biocare medical</td><td>BDB2004 L/preço até Suplemento N-2 12/18</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N-27</td><td>ThermoFisher</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Accutase&reg; Solução de descolamento celular</td><td>Biolegend</td><td>423201</td><td></td></tr><tr><td>AGAROSE LE</td><td>GoldBio</td><td>A-201-1000</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>Olympus 15 ml</td><td>21-103</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>TC-75 frasco tratado</td><td>25-209</td><td></td></tr><tr><td>Genesee Sc. Corporation</td><td>TC-25 frasco tratado</td><td>25-207</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-057</td><td>Mídia NS</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GibcoTM</td><td>14175-103</td><td>solução salina balanceada</td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Taconic</td><td>B6-f</td><td>C57BL/6 mouse</td></tr></tbody></table>

avaliação de biomarcadores em glioma por imuno-histoquímica na parafina glioma 3d neurosphere culturas

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Análise da expressão da proteína no glioma é relevante para vários aspectos no estudo da sua patologia. Inúmeras proteínas têm sido descritas como biomarcadores com aplicações no diagnóstico, prognóstico, classificação, estado de progressão do tumor e estado de diferenciação da célula. Essas análises de biomarcadores também são úteis para caracterizar o tumor neurospheres (NS) gerados a partir de pacientes de glioma e modelos de glioma. Tumor NS fornecem um modelo valioso em vitro para avaliar diferentes características do tumor do qual eles são derivados e podem com mais precisão o espelho glioma biologia. Aqui nós descrevemos um método detalhado para analisar biomarcadores em tumor NS usando imuno-histoquímica (IHC) tumor de parafina NS.

Para monitorar o desenvolvimento do tumor e avaliar se o tumor tiver atingido o tamanho necessário para gerar NS, analisamos a luminescência emitida por tumores usando a bioluminescência. Isso permite que o estudo da eficiência de transdução nos filhotes e progressão do tumor pelo sinal da luminescência de luciferase (Figura 1A e 1B). Quando o tamanho do tumor atinge um sinal de 1 x 107 fótons/s/cm2/RS (<strong cla...

Neurospheres crescidos como 3D culturas constituem uma poderosa ferramenta para estudar a biologia de glioma. Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar a imuno-histoquímica, mantendo a estrutura 3D de glioma neurospheres através da incorporação de parafina. Esse método permite a caracterização das propriedades de glioma neurosphere como stemness e diferenciação neural.

Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Este protocolo é significativo porque pode ser usado para estudar a presença de biomarcador de glioma por um método que preserva a estrutura 3D das neurosferas tumorais. A principal vantagem deste protocolo é que a morfologia das neurosferas é mantida em comparação com o método citospina no qual as células são submetidas a manipulação estressante e se tornam achatadas. Este método pode ser aplicado a qualquer outro sistema de cultura tecidual em que as células são cultivadas em 3D e a manutenção da estrutura é importante.Para começar, cultura neurosferas tumorais ou NS em um frasco T-25 até que as células sejam confluentes. Eleja o tumor NS em um tubo cônico de 15 mililitros. Impellet o NS a 300 Gs por cinco minutos.Depois disso, suspenda a pelota em um mililitro de 10% de formalina e incubar o tubo em temperatura ambiente por 10 minutos. Adicione cinco mililitros de HBSS ao NS re-suspenso. Impellet as células como descrito anteriormente. Coloque o tubo contendo a pelota no gelo.Suspenda a pelota NS lavada em 500 microliters de 2% de líquido quente. E misture por um cachimbo suave ou agitação. Coloque a ágarose incorporada NS no gelo até que a agarose polimerize.Em seguida, remova

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este protocolo vídeo demonstra o isolamento e expansão de células-tronco como de mutliforme glioblastoma humano ressecado cirurgicamente (GBM) tecido tumoral utilizando o método de cultura neurosphere ensaio.

Isolamento e Expansão da Human Glioblastoma Multiforme Células Tumorais Utilizando o Ensaio Neurosphere

Fonte: Núñez, F. J., et al. Avaliação de biomarcadores em glioma por imuno-histoquímica em culturas de neuroesferas de glioma 3D embebidas em parafina. J. Vis. Exp. (2019). Este vídeo demonstra uma técnica imuno-histoquímica para rotular biomarcadores tumorais em neuroesferas tumorais cerebrais embebidas em parafina. As seções da neuroesfera são submetidas à remoção e reidratação da parafina, seguida de tratamento para expor os locais dos biomarcadores. Anticorpos primários e secundários são...

Coloração imuno-histoquímica de biomarcadores em seções de neuroesferas de tumores cerebrais

Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

Este protocolo foi desenvolvido para identificar quantitativamente os componentes do microambiente tumoral em resecções do paciente com glioblastoma usando imuno-histoquímica cromogênica e ImageJ.

Imuno-histoquímica quantitativa do microambiente celular em resecações do glioblastoma do paciente

Aqui apresentamos um sistema de cultura monocamada mista ex-vivo para o estudo da migração de células glioma humanas (hGC) em tempo real. Este modelo fornece a capacidade de observar interações entre hGCs e axônios mielinated e não-myelinated dentro de uma câmara compartimentada.

Monitoramento em tempo real da migração humana de células glioma em co-culturas de raiz dorsal Ganglion Axon-Oligodendrocyte

A microdissecção a laser (LMD) é uma técnica sensível e altamente reprodutível que pode ser usada para descobrir caminhos que mediam a heterogeneidade e invasão do glioma. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar áreas discretas do tecido glioma usando LMD a laser seguido de análise transcritiva.

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

Aqui, estabelecemos uma plataforma de perfil metabólico integrando esferóides de glioma tridimensionais (3D) e normalização baseada em imagem por meio de análise de fluxo extracelular. Essa abordagem permite uma avaliação mais precisa das respostas metabólicas do tumor aos tratamentos medicamentosos e fornece informações sobre os possíveis mecanismos de resistência.

Avanços no perfil metabólico de esferoides tridimensionais de tumores cerebrais para triagem de drogas

Apresentamos um modelo de migração de glioblastoma 3D usando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes geradas a partir de tumores recém-diagnosticados e recorrentes. Esta plataforma permite visualização da dinâmica de migração específica do paciente e avaliação da eficácia terapêutica. O ensaio pode ser multiplexado após a migração para avaliar a localização e os padrões de expressão da proteína.

Ensaio de Migração de Glioblastoma 3D Reproduzível com Localização Magnética de Esferoides Mediadas por Nanopartículas sob Condições Hipóxicas

Este protocolo descreve um método para o rápido processamento de amostras de glioma pontino intrínsecas difusas post-mortem para o estabelecimento de modelos de culturas de células derivadas de pacientes ou caracterização directa de células tumorais e microambiente.

Um protocolo para a Cultura rápidos post-mortem celular de Difuso Intrínseca Pontine glioma (DIPG)

Aprenda imuno-histoquímica em neuroesferas de glioma preservando a estrutura 3D durante a inclusão em parafina. Este método mantém a morfologia celular para análise precisa de biomarcadores tumorais em oncologia.

Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas

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