Name: Processo de moldagem baseados em molhado-fiação de gelatina para regeneração de tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprenda a técnica de molhado-fiação de gelatina para engenharia de tecidos e aplicações médicas. Este método simples e econômico permite desenvolver biomateriais sem polímeros sintéticos para regeneração tecidual.

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Este estudo foi suportado pelo Ministério da defesa nacional (MAB-105-070; MAB-106-077; MAB-107-032; Mab-107-065), o Ministério da ciência e tecnologia (a maioria dos 107-2320-B016-016), Tri-Service General Hospital, o National Defense centro médico, Taiwan (TSGH-C106-046; TSGH-C106-115; TSGH-C107-041) e Hospital Geral de Cheng-Hsin e cooperação centro de médico de defesa nacional (CH-NDMC-107-8).

Os tecidos gordos foram obtidos em cirurgias ortopédicas como certificada pelo institucional Review Board do Tri-serviço geral Hospital, Taipei, Taiwan, R.O.C. procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal nacional Centro médico de defesa, Taiwan (R.O.C).
1. Umedeça girando o processo
<ol><li>
Preparação da solução
	<ol>
<li>Dissolva 5 g de gelatina em pó em 100 mL de água bidestilada para obter a concentração da solução de 5% (p/v).</li>
		<li>Agite a mistura lentamente a 60-70 ° C durante a noite para conseguir uma dispersão homogênea completamente sem quaisquer bolhas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Molhar a fiação
	<ol>
<li>Formação das fibras Nota: Um esquema do método é mostrado na Figura 1A. A instalação da fiação está equipada com uma máquina de bomba peristáltica (ver Tabela de materiais) que fornece alta precisão velocidade e controla a entrega Lisa do fluxo.<ol>
<li>Conecte uma seringa de 26 x 1/2 polegada (0,45 x 12 mm) como o injetor de solução tubo de vinil clara.</li>
			<li>Prepare 100 mL de solução de acetona 99,5% em um copo de béquer deve ser usado como banho de coagulação.</li>
			<li>Executar a máquina de bomba peristáltica em 21 rpm (3,25 mL/min) e deixe a solução de gelatina descansar por alguns segundos numa solução de acetona antes de enrolar.</li>
			<li>Retire as fibras de gelatina a partir da solução de acetona e mergulhe-os em 2,5% (p/v) de solução de diclorometano/policaprolactona (PCL/DCM) com 01:20 (w/w).</li>
			<li>Deixe a gelatina de fibras na solução PCL/DCM seca durante a noite, sob o capô à temperatura ambiente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Formação do tubo Nota: Um esquema do método é mostrado na Figura 1B.<ol>
<li>Use um cateter venoso periférico de 24 x 3/4 de polegada (0,7 x 19 mm) como molde do tubo.</li>
			<li>Carregar o cateter para a solução de gelatina e segurá-la lá por 3 s.</li>
			<li>Carregar o cateter para a solução de acetona e segure por 1 min.</li>
			<li>Carregar o cateter novamente para a solução de gelatina e segurá-la lá por 3 s.</li>
			<li>Repita este procedimento alternativo de 20x.</li>
			<li>Retire o cateter a partir da solução de acetona e deixe o tubo moldado secar à temperatura ambiente por 5 min.</li>
			<li>Suavemente retire o tubo de gelatina do cateter, usando uma pinça hemostática e transferir cuidadosamente o tubo de gelatina em um copo de pipetas com a imersão de 2,5% (p/v) da solução de PCL/DCM.</li>
			<li>Deixe a pipeta Pasteur contendo que o tubo de gelatina e solução PCL/DCM seca durante a noite, sob o capô à temperatura ambiente.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. morfologia do tubo gelatina
<ol><li>Monte o pedaço de tubo de gelatina secas em um esboço de carbono.</li>
	<li>Colocar a amostra na máquina íon sputter coater (ver Tabela de materiais) e revestir a amostra com ouro por 60 s; em seguida, observar sua morfologia por microscopia eletrônica (ver Tabela de materiais).</li>
</ol>3. cultura de células-tronco adiposas humana
<ol><li>Coloque os tecidos gordos (obtidos de tecido adiposo oral por cirurgia clínica) em uma placa de Petri contendo 10 mL de solução de transferência consiste em 0.1 M tampão fosfato salino (PBS), 1% penicilina/estreptomicina e 0,1% de glicose.</li>
	<li>Corte os tecidos em pedaços pequenos (menos de 1 mm2) com uma lâmina de bisturi.</li>
	<li>Transferi os tecidos em um tubo plástico de 15 mL e centrifugar 500 x g por 5 min.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e incubar o sedimento em um tubo de plástico contendo 10 mL de meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM, consistindo de 4 mM L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM e vermelho de fenol de 15 mg/L) com colagenase de 0,1% a 37 ° C, em um ambiente umidificado contendo 95% ar e 5% CO2, por 1 dia.</li>
	<li>Centrifugar o tubo plástico a 500 x g por 5 min, descartar o sobrenadante cuidadosamente (não toque o sedimento) e então, suspender o sedimento suavemente pela adição de 10 mL de DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e deixe 1 dia a 37 ° C , em um ambiente umidificado contendo 95% ar e 5% de CO2.</li>
	<li>Centrifugar o tubo plástico a 500 x g por 5 min e descartar o sobrenadante cuidadosamente; em seguida, adicione 1 mL de meio de células-tronco (composto de queratinócitos soro livre médio (K-SFM), 5% de FBS, N-acetil-L-cisteína, ácido ascórbico-2-fosfato, estreptomicina e anfotericina) para suspender o sedimento, transferi-lo para um balão de cultura T25 contendo 4 mL de meio de célula-tronco e deixá-lo ficar por 3 dias a 37 ° C, em um ambiente umidificado contendo 95% ar e 5% de CO2.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 mL de ácido de 0,25% do trypsin-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-incubar a 37 ° C, em um ambiente umidificado contendo ar de 95% e 5% de CO2 para 3,5 min, para separar as células da parte inferior do recipiente de cultura.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de FBS, suspender a mistura e transfira para um tubo de microcentrifugadora.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de 500 x g durante 3,5 minutos, suspender o sedimento com 1 mL de meio de células-tronco e transferi-lo para o frasco de cultura contendo 5 mL de meio de células-tronco; em seguida, mantê-lo a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 95% ar e 5% de CO2.</li>
	<li>Manter a subcultura, alterando o meio de células-tronco em 3 dias.</li>
</ol>4. cultivo de células do tubo de gelatina
<ol><li>Esterilizar o tubo de gelatina com luz UV para 2h; em seguida, mergulhe-a em 75% (v/v) de etanol e lavá-lo 2 x com média de células-tronco para remover o etanol residual.</li>
	<li>
Colete as células-tronco adiposas humanas (hASCs) do frasco de cultura.
	<ol>
<li>Retire o meio do frasco de cultura.</li>
		<li>Adicione 1 mL de 0,25% do trypsin-EDTA e incubar a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 95% ar e 5% CO2 para 3,5 min, para desanexar o hASCs do fundo do balão de cultura.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de FBS, suspender a mistura e transfira para um tubo de microcentrifugadora.</li>
		<li>Centrifugar o tubo microcentrifuga a 500 x g durante 3,5 min; em seguida, descartar o sobrenadante, cuidadosamente e suspender o sedimento com 1 mL de meio de células-tronco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque o tubo de gelatina em uma placa de 6 contendo 3 mL do meio de células-tronco e semente 4 x 104 de hASCs para o tubo; Incube-os por 2 semanas a 37 ° C, em um ambiente umidificado contendo 95% ar e 5% de CO2.</li>
	<li>Altere o meio de células-tronco em 3 dias para fornecer a nutrição suficiente para crescimento celular.</li>
</ol>5. imunocitoquímica
<ol><li>Retire o meio de células-tronco e lave o poço com PBS.</li>
	<li>Fixe o tubo com células com 0,1% de ácido acético glacial por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave bem 2 x com PBS.</li>
	<li>Adicionar um surfactante (NP-40, 0.05%) e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave-o bem 3x com PBS.</li>
	<li>Adicionar 2% de soro de cabra normal e incubar a temperatura ambiente por 30 min.</li>
	<li>Decantar a solução, adicionar o anticorpo primário nestin (marcador de células progenitoras neurais) e incubar durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Lave-o bem 3x com PBS.</li>
	<li>Adicione o anticorpo secundário burro isotiocianato de anti-mouse-fluoresceína (FITC) e manter a amostra no escuro por 2 h.</li>
	<li>Lave-o bem 3x com PBS.</li>
	<li>Adicione 1 mL de Hoechst 33342 para manchar os núcleos e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave o bem suavemente e observá-lo sob um microscópio de fluorescência.</li>
</ol>6. no ensaio de biocompatibilidade In Vivo
Nota: Ratos com peso entre 201-225 g tem testados com êxito usando este protocolo.
<ol><li>
Anestesia
	<ol>
<li>Induzir e manter a anestesia; de preferência, anestesiar um rato (ratos Sprague Dawley de 8 semanas de idade, fêmea) através de uma injeção intramuscular de tiletamina e eficiente (25 mg / kg + 25 mg / kg, respectivamente) e xilazina (5 mg/kg). Execute um teste de estímulo de dor, pressionando os dedos do rato para confirmar a anesthetization.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esterilização do local cirúrgico
	<ol>
<li>Raspar e limpar a pele da área do trapézio do rato (sobre a parte traseira do pescoço) e limpe-a com loção de iodo-povidona para preparar a condição asséptica da pele (100 mg/mL).</li>
		<li>Cobrir o rato com cortinas cirúrgicos estéril para reduzir transferência bacteriana e subsequente contaminação do local cirúrgico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Implantação de tubo de gelatina
	<ol>
<li>Delicadamente, corte a pele da área do trapézio do rato com uma tesoura cirúrgica.</li>
		<li>Criar uma ferida de 2 cm e coloque o tubo de gelatina diretamente na camada entre a fáscia e o músculo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cirurgia postimplantation
	<ol>
<li>Feche a ferida com sutura de nylon e limpe-a com solução de iodo-povidona (100mg/mL).</li>
		<li>Induzi o rato através de uma injeção intramuscular de cetoprofeno (2,5 mg/kg) e cefazolina (15 mg/kg).</li>
		<li>Mantenha o rato em condições assépticas, por 7 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eutanásia
	<ol>
<li>Rato é eutanásia através de asfixia de CO2 em conformidade com diretrizes de AVMA para eutanásia. Confirme a morte do rato pela pitada de dedo do pé e cauda, seguida tocando no peito para garantir os batimentos cardíacos.</li>
		<li>Cortar o rato delicadamente com uma lâmina de bisturi, remover o tecido implantado e tirar fotos para observação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bagnall, A. M., Jones, L., Duffy, S., Riemsima, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+fixation+surgery+for+acute+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Spinal fixation surgery for acute traumatic spinal cord injury.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 1, 004725(2008).</li>
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<li>Lundgren, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+fibers+made+from+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthetic fibers made from proteins.</a> Advances in Protein Chemistry. 5, 305-351 (1954).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Apresentamos o desenvolvimento de biomateriais baseados em gelatina usando um simples molhado girando a técnica que pode ser aplicada no estudo de polímeros naturais para a regeneração de tecidos. Este trabalho demonstrou a possibilidade de fabricação de gelatina como fonte de proteína excelente, sem adição de outras fontes, com o objetivo de otimizar as propriedades da gelatina em si. O desenvolvimento de biomateriais baseados em gelatina foi inteiramente realizado em temperatura ambiente (22-26 ° C). Uma preparação de ...

O mais recente desenvolvimento na regeneração de tecidos envolve a aplicação de engenharia de tecidos, o que representa um desafio para a melhoria de novas estratégias terapêuticas em tratamentos médicos. Por exemplo, o limitado potencial de regeneração do sistema nervoso, seguir lesão ou doença, coloca um problema de saúde significativo em todo o mundo. Devido à complexidade dos processos fisiopatológicos associados com o sistema nervoso, o uso de auto-enxerto tradicional ou a execução de cirurgia de estabilização tem sido mostrada para oferecer benefícios em termos de resultados funcionais, mas não há nenhuma evidência forte para os efeitos de fixação da coluna vertebral, cirurgia1,2. O tecido na área danificada é perdido e substituído com astrócitos hypertrophically induzido3, eventualmente formando uma densa cicatriz glial4,5. Esta matriz age como uma barreira que bloqueia a recuperação do nervo função6,7 e é, assim, dificulta grandemente regeneração. Portanto, espera-se um material de abertura de enchimento adequado para evitar a perda de tecido e reduzir a formação de cicatriz-associado do tecido conjuntivo, mantendo a integridade da área danificada, bem como fornecendo a substituição direta de células neurais e circuitos para promover a regeneração do axônio.
Biomateriais poliméricos tem sido preferidos como andaimes para a terapia de regeneração de tecido, baseado na regulamentação da progressão de comportamento e o tecido celular ou axônio através de suporte natural da matriz extracelular (ECM). O formato da fibra é comumente considerado como um bloco de construção para vários materiais, devido à sua estrutura unidimensional8. As fibras geralmente podem ser obtidas por extrusão de derretimento ou molhado girando o método; no entanto, o grande tamanho e custo do equipamento e a dificuldade para realizar esses métodos são desafiadores. Além disso, a maioria dos trabalhos relacionados com fibras de polímero tem sido focada em materiais sintéticos ou compostos. Polímeros naturais como fonte de biomaterial oferecem melhor biocompatibilidade Propriedades, para o corpo humano. No entanto, para obter o alinhamento das fibras de polímero natural é relativamente mais difícil do que de polímero sintético fontes9. Portanto, a conversão de um polímero natural, como uma rica fonte de proteína em fibras biomaterial é uma importante estratégia — não somente as fibras do biomaterial podem ser diretamente isolado da matéria-prima, evitando assim uma transformação desnecessária de monômeros, mas o fibras de proteínas também têm uma boa aparência e características favoráveis10.
A este respeito, nós descrevemos um método de baixo custo de processamento para a fabricação de fibras de polímero natural através do conceito básico de fiação úmida, que pode ser implementada na escala de laboratório para a engenharia de tecidos. Fiação úmida é executada pela extrusão e coagulação de uma solução de polímero em um nonsolvent de polímero apropriado. Uma solução adequada, viscous dopada em meio de coagulação faz com que as moléculas de polímero dissolver. Durante a transição de fase, os filamentos então perdem sua solubilidade e são precipitados sob a forma de um polímero sólido fase11. Referindo-se a este conceito, então ampliamos o desenvolvimento de gelatina para a forma de tubo por um processo de moldagem, que é considerado adequado para a aplicação de regeneração do tecido. Além disso, intrinsecamente, podemos também desenvolver qualquer forma de material de fibras de gelatina (por exemplo, canalização de gelatina enrolado de várias fibras de gelatina), para outro desejado aplicações.
Gelatina, um polímero natural e biodegradável, é formada por colágeno hidrolisado e desnaturado, incluindo qualquer estado helicoidal semicrystalline, amorfo ou triplo de colágeno12. É sabido que o colágeno é a proteína estrutural essencial em todos os tecidos conjuntivos de vertebrados e invertebrados13,14, que é semelhante à estrutura da proteína do ECM principal que induz o crescimento do nervo e, simultaneamente, substitui uma grande quantidade de glicosaminoglicano secretada durante lesões na medula espinhal. Portanto, o uso da gelatina como uma fonte seria uma ótima escolha para qualquer veículo a médica. Além de ser uma fonte de baixo custo, a gelatina também é biodegradável e cytocompatible e clinicamente provado ser um temporário defeito de enchimento15. Desenvolvido em forma de tubo,, testes in vitro e in vivo, descritos aqui demonstram que a gelatina tem um excelente biocompatibilidade e adequação do tecido futura aplicações de engenharia. Cultivadas com células-tronco adiposas humanas, tubos de gelatina melhoram a diferenciação de célula em células progenitoras neurais usando positivo nestin coloração como um marcador de células nervosas. Além disso, gelatina como enchimento material de lacuna, como produzido pelo método estabelecido neste estudo, é esperada para ser seguro e gerenciável e beneficiar muito engenheiros de tecido que estão actualmente a desenvolver polímeros naturais correlativos ao reforço de tecido estratégias de regeneração.

<table><tbody><tr><td><forte>Preparação da solução:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelatina tipo B (suína)</td><td>Ferak</td><td>Art. -Nr. 10733 Frasco de</td><td>500 g</td></tr><tr><td><forte>Processo de fiação úmida:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson</td><td>Modelo M312</td><td>Minipuls*3</td></tr><tr><td>Conector de tubo de plástico</td><td>World Precision Instruments</td><td>14011</td><td>1 caixa</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Sterican</td><td>5A06258541</td><td>26Gx1/2"(0.45 x 12mm)</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Ferak</td><td>Art. -Nr. 00010</td><td>2.5 L vial</td></tr><tr><td>Policaprolactona CAPA 6500</td><td>Perstorp</td><td>24980-41-4-Diclorometano</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Scharlau</td><td>CL03421000</td><td>frasco de 1 L</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A-Hemostat</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Shinetec instruments</td><td>ST-B021-Cateter</td><td></td></tr> <tr><td>venoso periférico (Introcan Certo)</td><td>B. Braun</td><td>1B03258241</td><td>24Gx3/4"(0,7 x 19mm)</td></tr><tr><td><forte>Morfologia do tubo de gelatina:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina de revestimento por pulverização catódica de íons&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>e1010-Microscopia</td><td></td></tr> <tr><td>eletrônica de varredura</td><td>Hitachi</td><td>S-3000N</td><td>-</td></tr><tr><td><forte>Cultivo de células no tubo de gelatina:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>488625</td><td>frasco de 100 mL Soro</td></tr><tr><td>fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>923119</td><td>frasco de 500 mL</td></tr><tr><td>Meio de Eagle modificado de Dulbecco&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31600-034</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Queratinócitos-SFM médio</td><td>Gibco</td><td>10744-019</td><td>frasco de 500 mL</td></tr><tr><td>T25</td> frasco <td>de cultura TPP</td><td>90025</td><td>VENT tipo</td></tr><tr><td>placa de 6 poços</td><td>Falcon</td><td>1209938</td><td>-</td></tr><tr><td>Imunocitoquímica:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phospate-buffered salina</td><td>Gibco</td><td>654471</td><td>Frasco para injetáveis de 500 ml</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Ferak</td><td>Art. -Nr. 00697</td><td>Frasco de 500 mL</td></tr><tr><td>NP-40 surfactante (solução de Tergitol)</td><td>Sigma</td><td>056K0151</td><td>Frasco de 500 mL</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000-20 Frasco de</td><td>20 mL, concentrado</td></tr><tr><td>Nestin (anticorpo primário)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-23927-Donkey</td><td></td></tr> <tr><td>anti-mouse-fluoresceína isotiocianato ( anticorpo secundário)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2099-Hoechst</td><td></td></tr> <tr><td>33342</td><td>Anaspec</td><td>AS-83218</td><td>frasco de 5 mL</td></tr><tr><td>In vivo teste de biocompatibilidade:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiletamine+zolazepam&nbsp;</td><td>Virbac</td><td>BC91</td><td>frasco de 5 mL</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Bayer Coreia</td><td>KR03227</td><td>frasco de 10 mL</td></tr><tr><td>Cetoprofeno</td><td>Astar</td><td>1406232 frasco de</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Solução de iodopovidona</td><td>Everstar</td><td>HA161202</td><td>Barril de 4 L</td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>China Chemical & Farmacêutico</td><td>18P909</td><td>1 g</td></tr><tr><td>frasco Lâmina de bisturi</td><td>Shinetec instrumentos</td><td>ST-B021-Surgical</td><td></td></tr> <tr><td>scissor</td><td>instrumentos Shinetec</td><td>ST-B021</td><td>-</td></tr></tbody></table>

processo de moldagem baseados em molhado-fiação de gelatina para regeneração de tecidos

Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

Este artigo apresenta um método de baixo custo para fabricar gelatina, como um polímero natural, em fibras monofilamento ou outras formas adequadas. Através da fiação método molhado, fibras de gelatina são fabricadas por extrusão suave em um meio adequado de coagulação. Para aumentar a superfície funcional destas fibras de gelatina e sua capacidade de imitar as características dos tecidos, a gelatina pode ser moldada em forma de tubo referindo-se a este conceito. Examinado por testes in vitro e in vivo, os tubos de gelatina demonstram um grande potencial para aplicação em engenharia de tecidos. Atuando como um material de enchimento adequado lacuna, gelatina de tubos podem ser usados para substituir o tecido na área danificada (por exemplo, no sistema nervoso ou cardiovascular), bem como a promover a revitalização, fornecendo uma substituição direta de células-tronco e circuitos neurais. Este protocolo fornece um procedimento detalhado para a criação de um biomaterial, baseado em um polímero natural, e sua implementação deverá beneficiar muito o desenvolvimento de polímeros naturais correlativos, que ajudam a perceber as estratégias de regeneração do tecido.

Neste estudo, temos desenvolvido com sucesso a gelatina em fibras(Figura 2)e tubos (Figura 2B, C), através do conceito de fiação úmida user-friendly. Estes materiais à base de gelatina podem ser utilizados como qualquer ferramenta médica, dependendo de suas formas. Considerando que a superfície funcional e quadro de tais materiais são mais apropriados para a regeneração dos tecidos, examinamos a ...

Desenvolvemos e descrever um protocolo baseado no conceito de fiação úmida, para a construção de biomateriais baseados em gelatina, usada para a aplicação da engenharia de tecidos.

Processo de moldagem baseados em molhado-fiação de gelatina para regeneração de tecidos

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...

Este protocolo melhora um conceito básico de fiação úmida para desenvolver um material a partir de uma única tira de fibra em várias tiras que podem ser usadas para qualquer aplicação médica preferida. Esta técnica é simples, barata, e não requer a adição de polímeros sintéticos para personalização dos polímeros naturais em um recurso de proteína para materiais de interesse. Esta técnica pode ser estendida ao desenvolvimento de biomateriais para matar a terapia fria, como tratamento do sistema nervoso central ou periférico, substituição de vasos sanguíneos ou reconstrução direta do trato urinário.Este método destina-se à aplicação médica, inclusive como estratégia para neuralização tecidual ou medicina regenerativa. Esta técnica pode ser facilmente implementada por iniciantes. Observe que, após várias repetições de moldagem, a qualidade da solução deve ser sempre verificada para manter uma formação ideal.Para formar o tubo giratório molhado, primeiro submerse um medidor de 24 por três quartos de polegada cateter venoso periférico em solução de gelatina recém-preparada por três segundos, seguido de imersão em solução de acetona recém-preparada por um minuto. Repita esses passos 20 vezes. Após a última imersão de acetona, deixe o tubo moldado secar por cinco minutos à temperatura ambiente, e use um hemostat para transferir cuidadosamente o tubo de gelatina do cateter para uma pipeta Pasteur de vidro com solução de diclorometano de policaprolactona de 2,5% para uma incubação durante a noite sob a temperatura ambiente.Na manhã seguinte, esterilize a gelatina por duas horas sob luz ultravioleta antes de submergir brevemente o tubo em 75% de etanol. Em seguida, lave o tubo duas vezes com o meio de células-tronco para remover o etanol residual. Para cultivar o tubo de gelatina com a cultura celular, substitua a extremidade supinada das células-tronco adiposas humanas de um frasco de cultura com um mililitro de 0,25% Trypsin-EDTA para uma incubação de 3,5 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Quando as células se separarem, prendam a reação com um mililitro de soro bovino fetal e transfiram a suspensão celular para um tubo de microcentrifuge. Colete as células por centrifugação e resuspense a pelota em um mililitro de meio de células-tronco. Em seguida, coloque o tubo de gelatina em um poço de uma placa de seis poços contendo três mililitros de meio de células-tronco.Depois de contar as células, a semente quatro vezes 10 a 4 das células-tronco adiposas humanas no tubo para uma incubação de duas semanas na incubadora de cultura celular. Depois de confirmar o nível apropriado de sedação por falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em uma fêmea de oito semanas de idade, raspe o cabelo da área trapézio e esterilize a pele exposta com solução povidone-iodo. Cubra o rato com cortinas cirúrgicas estéreis para reduzir a contaminação bacteriana do local cirúrgico e use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão de pele rasa de dois centímetros de comprimento.Coloque o tubo de gelatina diretamente na camada entre a fáscia e o músculo e use uma sutura de nylon para fechar a ferida. Em seguida, esterilize a incisão com solução povidone-iodo. Induzir o rato através de uma injeção intramuscular de cetoprofeno e cefazolina e manter o animal sob condições assépticas por sete dias.Este conceito de fiação molhada amigável pode ser usado para desenvolver gelatina em fibras e tubos. Observações morfológicas do tubo de gelatina por meio da microscopia eletrônica de varredura revelam uma superfície não muito lisa com um diâmetro interno superior a 200 micrômetros e uma espessura de aproximadamente 20 micrômetros. A coloração de um tubo de gelatina de cultura de células-tronco adiposas humanas para a expressão do marcador de células neurais demonstra uma coloração positiva para o marcador, juntamente com múltiplos núcleos detectados sugerindo que as células podem penetrar e aderir ao tubo de gelatina e se diferenciar em células progenitoras neurais.A implantação do tubo de gelatina na camada de fáscia confirma sua segurança e biocompatibilidade, pois não há indicação de vermelhidão, inchaço ou outros sintomas de inflamação no tecido local e o tubo é cercado por tecido conjuntivo bem desenvolvido. Ao tentar este procedimento de dois pontos um, garantir a imersão do molde no tempo específico de revestimento em cada solução é muito importante para construir uma forma precisa de tubo. Após este procedimento, nossos experimentos utilizam modelo animal de doença humana para investigar com precisão o resultado dos biomateriais para a estratégia de regeneração tecidual.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores no desenvolvimento de polímeros de natureza correlativa simples em qualquer tipo de material para uma aplicação médica decidida. Em condição normal de uso, a solução de policaprolactona dicloroometano é considerada como um risco ambiental mínimo, mas não se esqueça de realizar quaisquer etapas com este produto químico em um armário de biossegurança apropriado.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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