Name: Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprenda a isolar e modificar geneticamente células CD34+ de primatas não humanos usando vetores lentivirais. Este método prepara células hematopoiéticas para infusão autóloga em modelos pré-clínicos de terapia gênica.

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Os autores graças Helen Crawford na preparação deste manuscrito, Jim Woolace de design gráfico e Veronica Nelson e Devikha Chandrasekaran para participar no desenvolvimento do protocolo. O desenvolvimento do presente protocolo foi apoiado por concessões do NIH Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (R01 AI135953 e AI138329 para H.P.K.) e nacional de coração, pulmão e Instituto de sangue (R01 HL136135, HL116217, HL122173 P01 e sub-19 HL129902 para H.P.K.), bem como NIH P51 OD010425 e, em parte através do centro de câncer NIH/ICN, suporte Grant P30 CA015704. H.P.K. é um investigador de Medicina Molecular Markey e recebeu apoio como o destinatário inaugural de José Carreras/E. Donnall Thomas dotado cadeira para pesquisa do câncer e o Fred Hutch dotado cadeira para celular e Gene Therapy.

<ol><li>Radtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+hematopoietic+stem+cell+population+for+rapid+multilineage+engraftment+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates.</a> Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).</li>
<li>Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hierarchy+of+multipotent+hematopoietic+progenitors+in+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).</li>
<li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. 333 (6039), 218-221 (2011).</li>
<li>Hoggatt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mobilization+reveals+a+highly+engraftable+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell.</a> Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).</li>
<li>Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+promising+nonmyeloablative+conditioning+regimens+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates.</a> Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).</li>
<li>Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonhuman+primate+transplantation+model+to+evaluate+hematopoietic+stem+cell+gene+editing+strategies+for+beta-hemoglobinopathies.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy.</a> Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).</li>
<li>Peterson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+impact+of+transplantation+on+peripheral+and+tissue-associated+viral+reservoirs%3A+Implications+for+HIV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy.</a> PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).</li>
<li>Zhen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+and+function+of+hematopoietic+stem+cell-derived+chimeric+antigen+receptor+T+cells+in+a+nonhuman+primate+model+of+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS.</a> PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753(2017).</li>
<li>Moffett, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hit-and-run+programming+of+therapeutic+cytoreagents+using+mRNA+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers.</a> Nature Communications. 8 (1), 389(2017).</li>
<li>Burtner, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injection+of+a+foamy+virus+vector+to+correct+canine+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1.</a> Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).</li>
<li>Evans, D. T., Silvestri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhuman+primate+models+in+AIDS+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+HIV+and+AIDS%22%5BJournal%5D)">Nonhuman primate models in AIDS research.</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).</li>
<li>Taraseviciute, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cell-mediated+neurotoxicity+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates.</a> Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).</li>
<li>McGary, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTLA-4%28%2B%29PD-1%28-%29+memory+CD4%28%2B%29+T+cells+critically+contribute+to+viral+persistence+in+antiretroviral+therapy-suppressed%2C+SIV-infected+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques.</a> Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).</li>
<li>Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genomic+mapping+of+vector+integration+sites+in+gene+therapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).</li>
<li>Zonari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ex+vivo+engineering+and+expansion+of+highly+purified+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+populations+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).</li>
<li>Doulatov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+map+of+the+human+progenitor+hierarchy+shows+the+origin+of+macrophages+and+dendritic+cells+in+early+lymphoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development.</a> Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).</li>
<li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li>
<li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+promote+expansion+of+long-term+engrafting+marrow+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).</li>
<li>Peterson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+multilineage+engraftment+of+autologous+genome-edited+hematopoietic+stem+cells+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates.</a> Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).</li>
<li>Peterson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+polyclonal+engraftment+of+Cal-1+gene-modified+cells+and+in+vivo+selection+after+SHIV+infection+in+a+nonhuman+primate+model+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007(2016).</li>
<li>Thompson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+in+patients+with+transfusion-dependent+beta-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).</li>
<li>Eichler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem-cell+gene+therapy+for+cerebral+adrenoleukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).</li>
<li>Paul, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+enrichment+of+gene-modified+primary+T+cells+via+CCR5-targeted+integration+of+mutant+dihydrofolate+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).</li>
<li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+manufacturing+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Global manufacturing of CAR T cell therapy.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li>
<li>Masiuk, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+gene+therapy+efficiency+through+the+enrichment+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).</li>
<li>Trobridge, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+pigtailed+macaque+hematopoietic+repopulating+cells+with+HIV-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors.</a> Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).</li>
<li>Beard, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+stable+MGMT-mediated+selection+of+long-term+repopulating+stem+cells+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).</li>
<li>Horn, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+lentiviral+gene+transfer+to+canine+repopulating+cells+using+an+overnight+transduction+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol.</a> Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).</li>
<li>Adair, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+closed+system+manufacturing+of+lentivirus+gene-modified+haematopoietic+stem+cells+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy.</a> Nature Communications. 7, 13173(2016).</li>
<li>Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> BMC Biotechnology. 6, 34(2006).</li>
<li>Kiem, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+gene+transfer+into+baboon+marrow+repopulating+cells+using+recombinant+human+fibronectin+fragment+CH-296+in+combination+with+interleukin-6%2C+stem+cell+factor%2C+FLT-3+ligand%2C+and+megakaryocyte+growth+and+development+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor.</a> Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).</li>
<li>Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+chronic+restraint+of+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Veterinary+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates.</a> Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).</li>
<li>Noser, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporine+increases+human+immunodeficiency+virus+type+1+vector+transduction+of+primary+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells.</a> Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).</li>
<li>Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+human+hematopoietic+repopulating+cells+with+a+chimeric+HIV1-based+vector+including+SIV+capsid%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid.</a> Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).</li>
<li>Cornetta, K., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine+sulfate+as+an+effective+alternative+to+polybrene+in+retroviral-mediated+gene-transfer%3A+implications+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy.</a> Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).</li>
<li>Goerner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+granulocyte+colony-stimulating+factor+during+retroviral+transduction+on+fibronectin+fragment+CH-296+enhances+gene+transfer+into+hematopoietic+repopulating+cells+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs.</a> Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).</li>
<li>Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+fibronectin+maintains+regenerative+capacity+during+ex+vivo+culture+and+transduction+of+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).</li>
<li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+enhances+human+cord+blood+stem+cell+xenotransplants+and+shows+long-term+safety+in+preclinical+nonhuman+primate+transplant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).</li>
<li>Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+immunodeficiency+through+HSC+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Treating immunodeficiency through HSC gene therapy.</a> Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).</li>
<li>Humbert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immune+reconstitution+of+SCID-X1+canines+after+G-CSF%2FAMD3100+mobilization+and+in+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy.</a> Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Vetor de LV engenharia é o método mais bem caracterizado para gene-modificar tipos de célula como CD34 + HSPCs, para posterior transplante em vivo. O protocolo descrito aqui é projetado para maximizar o número de HSPCs gene modificado que persistem a longo prazo na vivo e fornecem benefícios clínicos aos pacientes com várias doenças malignas, infecciosas e genéticas. Embora o gene-edição estratégias surgiram na última década, LV-modificado células são os melhores estudadas in vitro, em modelos animais e em pac...

Terapia gênica de células-tronco é um meio poderoso para abordar um vasto leque de patologias humanas. Terapia de gene HSPC é uma abordagem particularmente atraente, devido à i) a relativa facilidade de coletar essas células dos pacientes, ii) a riqueza de conhecimentos disponíveis sobre fenótipos de superfície celular e ex vivo parâmetros de cultura, e, como o campo se expande, Porque iii) apresenta cientistas com uma caixa de ferramentas cada vez maior de estratégias de modificação do gene adaptados às várias doenças de interesse. Estamos investigando ativamente HSPC abordagens de terapia de gene de vários ângulos, incluindo a ciência básica da HSPC biologia, a enxertia de HSPCs gene-modificado em modelos in vivo pré-clínicos e a aplicação de populações de pacientes relevantes. Nós e os outros têm caracterizado o fenótipo de superfície celular de funcionalmente distintos HSPC subconjuntos1,2,3, a mobilização e regimes de condicionamento que maximizar o rendimento HSPC e enxertia, minimizando toxicidade de4,5e o gene modificação e edição de gene estratégias que têm sido adaptadas para uma ampla gama de maligno, genética e doenças infecciosas6,7,8, 9,10. A função e a enxertia de HSPCs gene modificado podem ser avaliados em um número de modelos de pequeno e grande-animal, incluindo ratos, cães e NHPs. Em particular, modelos de PNC são vantajosos porque muitos reagentes, por exemplo, os anticorpos específicos para as proteínas superfície celular HSPC como CD34 e CD90, podem ser usados permutavelmente em humanos e células do PNC. Além disso, em contraste com os ratos, animais de grandes porte como NHPs permitem uma maior aproximação da escala da modificação genética necessária para a eficácia clínica. Finalmente, NHPs são o padrão ouro para a modelagem de patologias humanas tais como a infecção de HIV-111 e um sistema de modelo emergente para candidato anticâncer e anti-HIV imunoterapias12,13.
O propósito do presente protocolo é delinear os métodos de purificação, modificação genética, e a preparação de produtos de infusão NHP HSPC. Embora fora do âmbito do presente protocolo, anteriormente mostramos que esses produtos engraft em hospedeiros de PNC autólogos, dão origem a todas as linhagens hematopoiéticas e fornecem eficácia terapêutica em uma ampla gama de modelos de doença1. Temos também caracterizada a clonality de HSPCs engrafting e construiu uma plataforma para rastrear a cinética, o tráfico e o fenótipo dos HSPCs individuais e seus descendentes, seguir transplante autólogo1,14. Os métodos aqui apresentados foram desenvolvidos com os seguintes objetivos: i) para isolar HSPCs altamente puros e subconjuntos HSC engrafting a longo prazo, ii) para manter o primitivos linfócitos durante ex vivo de cultura e iii) eficientemente gene-modificar qualquer granel HSPCs ou a longo prazo engrafting HSC subconjuntos. Nós empregamos magnética assistida por célula-classificação (MACS), bem como fluorescência-ativado da pilha (FACS), para isolar fenotipicamente/funcionalmente HSPC populações distintas, consistentes com os métodos de muitos grupos2,15, de classificação 16. A manutenção da primitivas linfócitos em cultura (ou seja, minimizando a diferenciação dessas células em progenitores comprometidos que dão origem a totalmente diferenciadas subconjuntos mieloides e linfoides) é um aspecto essencial do protocolo descrito aqui. Embora nós anteriormente caracterizaram abordagens para expandir HSPCs mantendo um fenótipo primitivo17,18, aqui, descrevemos um protocolo que centra-se na manutenção de linfócitos através de uma mínima (48 h) e definido ex vivo cultura.
A modificação eficiente de HSPCs e HSC subconjuntos é um objetivo central do presente protocolo. Entre várias abordagens temos relatado, dois são de longe os mais investigados em ensaios clínicos: modificação genética de LV-mediada e mediada por nuclease gene edição1,6,19. Gene-edição estratégias usam um de um número de plataformas de nuclease para modificar especificamente um gene alvo de interesse, por exemplo, o receptor do chemokine C-C tipo 5 (CCR5) para o tratamento da infecção de HIV7,19 ou Bcl11A para o tratamento de Hemoglobinopatias6. Aqui, focalizamos a modificação genética de LV-mediado, no qual cargas transgênicas semirandomly integrarem o genoma1,8,20. A principal vantagem da LV abordagens é a capacidade de entregar grandes quantidades de material genético (até 8 ou 9 kilobases). Embora o gene-edição estratégias estão sendo desenvolvidas para direcionar um transgene de interesse para integrar somente em um locus especificado por recombinação homóloga doador (HDR), esses métodos exigem mais desenvolvimento in vitro e em modelos animais pequenos. Em contraste, vetores de LV têm sido amplamente utilizados em NHPs e em pacientes21,22. Importante, o protocolo descrito aqui, que usa aprontado BM como uma fonte HSPC a partida, pode ser facilmente e amplamente adaptado, por exemplo, para isolar o PBSCs. Conforme descrito acima, podemos aproveitar o alto grau de similaridade genética entre NHPs e os seres humanos usar reagentes que são aplicáveis a ambas as espécies. Finalmente, esta abordagem tem sido adaptada para modificar outros subconjuntos hematopoiéticos, nomeadamente T células12,23,24; o advento das abordagens de imunoterapia eficazes células T tem dependia fortemente a mesma plataforma de LV utilizada neste protocolo. Esses métodos são adequados para qualquer pesquisador interessado em biologia HSPC ou modificação genética mediada por LV. Por exemplo, o protocolo de purificação HSPC apresentado aqui pode ser usado para caracterizar o romance subconjuntos HSC-enriquecido, conforme descrito anteriormente,1,15,25. Da mesma forma, a transdução de LV métodos apresentados aqui da mesma forma poderiam ser aplicada e desenvolvida para vários outros tipos de células e perguntas experimentais, tanto em modelos in vitro e in vivo.
Em resumo, apresentamos métodos para isolar e modificar geneticamente NHP HSPCs. Esses métodos podem ser facilmente adaptados para outras espécies e outras fontes de HSPCs. Este protocolo exaustivamente investigado mostra uma grande promessa na modelagem de terapias eficazes para várias doenças humanas.

<table><tbody><tr><td>Stemspam SFEM II ("HSPC") Mídia</td><td>StemCell</td><td>09655</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Decon labs</td><td>M18027161M</td><td></td></tr><tr><td>Ciclosporina</td><td>Sigma</td><td>30024-25MG</td><td></td></tr><tr><td>500 mM EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino Inativado</td><td>por Calor Sigma Aldrich</td><td>PS-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>CH-296/ RetroNectina (2.5 mL, 1 &micro; g/&micro; L)</td> <td>TaKaRA</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A7906-100g</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H9897</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos magnéticos IgM anti-rato</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-047-301</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Células-Tronco Humanas Recombinantes (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>Trombopoetina Humana Recombinante (TPO)</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>Tirosina quinase 3 semelhante ao FMS humano recombinante (FLT-3)</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de protamina</td><td>Sigma</td><td>P-4505</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Polipropileno Tubo de fundo redondo</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Colony Gel 1402</td><td>ReachBio</td><td>1402</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separadores</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Colunas MACS L25</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>10 mM PGE2</td><td>Cayman Chemical</td><td>14753-5mg</td><td></td></tr><tr><td>frascos T-75 tratados com TC</td><td>Bioexpress</td><td>T-3001-2</td><td></td></tr><tr><td>Frascos T-75 não tratados com TC</td><td>Seringas Thermo-Fisher</td><td>13680-57</td><td></td></tr><tr><td>20 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>16,5 G agulhas</td><td>BD Tampa</td> de ponta de seringa <td>de 305198</td><td></td>de precisão</tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>305819</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA Solution</td><td>Epicentre</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>8-tube strip cap PCR Tubes</td><td>USA scientific</td><td>1402-2708</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler de 96 poços</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de pré-separação</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Filtro, Célula; Falcão BD; Estéril; Malha de nylon; Tamanho de malha: 70um; Cor: branco; 50/CS</td><td>fisher scientific</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Ultracomp ebeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Seringas Luer-Lock de 3 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14823435</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 35 mm x 10 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 60 mm x 15 mm</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430196</tr><tr><td>Placa de cultura de células de 150 mm x 25 mm</td><td></td> Frascos não tratados com <td>Corning</td> 430599 <td></td></tr> TC <tr><td></td><td>Falcon</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>Extração de DNA Qiagen Qiagen</td><td>51104</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone: 5E10</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone: 563</td><td>BD horizon</td><td>562449</td><td></td></tr><tr><td>APC-H7 Camundongo Anti-Humano CD45RA Clone: 5H9</td><td>BD Pharmingen</td><td>561212</td><td></td></tr><tr><td>V450 Camundongo Anti-NHP CD45 Clone: d058-1283</td><td>BD Biosciences</td><td>561291</td><td></td></tr><tr><td>Soro Autólogo</td><td>Coletado do hospedeiro autólogo e criopreservado antes da mobilização e coleta de CD34+ HSPCs</td><td>N/A</td><td>Beard, B. C. et al. Seleção eficiente e estável mediada por MGMT de células-tronco de repovoamento de longo prazo em primatas não humanos. Jornal de Investigação Clínica. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td></tr><tr><td>Mídia Condicionada por Vírus (VCM)</td><td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td><td>N/A</td><td>Beard, B. C. et al. Seleção eficiente e estável mediada por MGMT de células-tronco de repovoamento de longo prazo em primatas não humanos. Jornal de Investigação Clínica. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD34, Clone 12.8</td><td>Kiem Lab</td><td>N/A</td><td>Beard, B. C. et al. Seleção eficiente e estável mediada por MGMT de células-tronco de repovoamento de longo prazo em primatas não humanos. Jornal de Investigação Clínica. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td></tr><tr><td>Primer Lenti F: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Peterson, C. W. et al. Enxerto policlonal multilinhagem de células modificadas pelo gene Cal-1 e seleção in vivo após infecção por SHIV em um modelo de primata não humano de AIDS. Mol Ther Métodos Clin Dev. 3 16007, (2016).</td></tr><tr><td>Primer Lenti R: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Peterson, C. W. et al. Enxerto policlonal multilinhagem de células modificadas pelo gene Cal-1 e seleção in vivo após infecção por SHIV em um modelo de primata não humano de AIDS. Mol Ther Métodos Clin Dev. 3 16007, (2016).</td></tr><tr><td>Primer de actina F: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Peterson, C. W. et al. Enxerto policlonal multilinhagem de células modificadas pelo gene Cal-1 e seleção in vivo após infecção por SHIV em um modelo de primata não humano de AIDS. Mol Ther Métodos Clin Dev. 3 16007, (2016).</td></tr><tr><td>Primer de actina R: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>Peterson, C. W. et al. Enxerto policlonal multilinhagem de células modificadas pelo gene Cal-1 e seleção in vivo após infecção por SHIV em um modelo de primata não humano de AIDS. Mol Ther Métodos Clin Dev. 3 16007, (2016).</td></tr></tbody></table>

preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Transplante de células (HSPC) de haste e progenitoras hematopoiético tem sido uma terapia de pedra angular para a leucemia e outros tipos de câncer há quase meio século, subjaz a única cura conhecida de infecção de vírus de imunodeficiência humana (HIV-1) e mostra a imensa promessa em o tratamento de doenças genéticas, tais como talassemia beta. O nosso grupo desenvolveu um protocolo para a terapia de gene HSPC modelo em primatas não-humanos (NHPs), permitindo que os cientistas otimizar muitos dos mesmos reagentes e técnicas que são aplicadas na clínica. Aqui, descrevemos os métodos para a purificação CD34+ HSPCs e subconjuntos de células-tronco hematopoiéticas (HSC) persistentes a longo prazo da medula óssea aprontada (BM). Técnicas idênticas podem ser empregadas para a purificação de outras fontes HSPC (por exemplo, sangue periférico mobilizado células-tronco [PBSCs]). Descrito, é um protocolo de 2 dia em que células são purificadas, culta, modificadas com lentivirus (LV) e preparadas para infusão de volta para o host autólogo. Leituras chaves de sucesso incluem a pureza do CD34+ HSPC da população, a capacidade de HSPCs purificados para formar colônias morfologicamente distintas na mídia semi-sólido e, mais importante, eficiência de modificação genética. A principal vantagem para a terapia de gene HSPC é a capacidade de fornecer uma fonte de vida longa células que dão origem a todos os tipos de células hematopoiéticas. Como tal, esses métodos têm sido usados para terapias de modelo para câncer, doenças genéticas e doenças infecciosas. Em cada caso, eficácia terapêutica é estabelecida, aumentando a função de progênie HSPC distintas, incluindo células vermelhas do sangue, as células T, células B, e/ou subconjuntos mieloides. Os métodos de isolar, modificar e preparar HSPC produtos são directamente aplicáveis e traduzíveis para várias doenças em pacientes humanos.

O protocolo descrito acima é projetado para isolar e gene-modificar NHP CD34+ HSPCs, que posteriormente pode ser infundido volta para o host autólogo (Figura 1 e Figura 2). Quando este protocolo a seguir, nós geralmente obter até 8 x 109 glóbulos brancos totais do BM purgado de macacos de pigtail e, às vezes, o dobro desse montante de macacos rhesus. Em ambas as espécies, o número de CD34+ HSPCs q...

O objetivo do presente protocolo é isolar os primatas não-humanos CD34+ células de medula aprontada, gene-modificar estas células com vetores Lentivirus e preparar um produto para infusão no hospedeiro autólogo. O comprimento total do protocolo é aproximadamente 48 h.

Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Para avaliar a eficiência e a segurança de abordagens promissoras e novas de terapia genética, o teste abrangente de células modificadas por genes em modelos in vivo pré-clínicos validados é crucial. A conservação da reatividade cruzada dos marcadores de superfície celular relevantes dos reagentes e a capacidade de aplicar os mesmos tratamentos de suporte administrados aos pacientes ao longo de modelos de primatas não humanos para imitar de perto parâmetros clínicos. Demonstrando o procedimento comigo estará Anai Perez, um técnico de pesquisa do laboratório do Dr. Hans-Peter Kiem.Comece adicionando alíquotas de 10 a 12 mililitros de medula óssea isoladas de um saudável doador de primatas não humanos em tubos cônicos de 50 mililitros. Leve o volume do tubo até 50 mililitros com tampão hemollítico e incuba as células por até sete minutos em temperatura ambiente. Remova os detritos celulares por centrifugação, e aspire todos, exceto os últimos dois a cinco mililitros do supernatante.Resuspenque a pelota no volume de supernacante residual movendo o tubo, e transfira as suspensões da medula óssea para um novo tubo de 50 mililitros usando um coador de células porosas de 70 micrômetros para remover quaisquer coágulos sanguíneos. Adicione um tampão hemollítico fresco para trazer o volume até 50 mililitros, e incubar as células por mais cinco minutos à temperatura ambiente antes de sua coleta por centrifugação. Aspire todos os supernascentes e resuspense as células em 10 mililitros de tampão máximo.Antes de filtrar a suspensão da célula através de outro filtro de poros de 70 micrômetros, enxágue o tubo com 40 mililitros de tampão fresco e acumule a lavagem com a suspensão da célula. Depois de enriquecer para células positivas CD34 de acordo com protocolos padrão de classificação celular assistido magnético, lave as células isoladas de contas em até 50 mililitros de tampão máximo fresco, e resuspenda a pelota no meio HSPC. Em seguida, a placa de 10 a 20 mililitros das células em tecido ventilado cultivados tratados frascos T75 para sua cultura durante a noite em uma incubadora de 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono.Para avaliar a pureza pré e pós-enriquecimento das amostras celulares da medula óssea criam um protocolo de citometria de fluxo com as parcelas apropriadas e a hierarquia populacional mostrando todos os portões para todos os eventos dispersos, células-tronco bamopoiéticas, progenitoras multipotentes an-eritróidas e progenitores mieloides linfo. Em seguida, execute uma amostra de células brancas não manchadas, pré-enriquecimento para ajustar as tensões para os parâmetros de dispersão dianteira e lateral, e todos os canais de fluorescência seguidos de contas de compensação manchada única para ajustar a compensação entre os canais adjacentes. Em seguida, execute todas as amostras restantes não manchadas e manchadas com o protocolo ajustado e compensado para documentar a eficiência de enriquecimento do CD34.Quando todas as compensações tiverem sido definidas, configure o classificador de células para a purificação do tipo de subconjuntos CD34 em ensaios celulares formadores de colônias, e carregue o tubo de amostra enriquecido CD34 manchado no cítmetro. Em seguida, registos de 2000 a 3000 eventos, e ajuste bem os portões de classificação para se adequar à força do sinal e atingir populações. Quando a configuração estiver completa, a aquisição das células ajustando a taxa de fluxo para 500 a 1000 células por segundo, e classificação de 800 a 1200 células da dispersão, célula-tronco baterótica, hematopoiética, progenitora multipotente an-eritróida e progenitor mieloide linfo em tubos separados contendo 3,6 mililitros de colônia formando meio celular por tubo.No final do tipo vórtice os tubos de coleta, e adicionar um mililitro de suspensão celular a três estéreis 3,5 centímetros, cultura não-tecido tratada placas de petri definidas dentro de placas de petri individuais de 15 centímetros por população celular para sua incubação de 10-14 dias a 37 graus celsius. Na manhã seguinte, use uma pipeta de 10 mililitros para enxaguar suavemente as células aderentes do fundo de cada frasco com HBSS estéril, e coletar as células colhidas por centrifugação. Resuspend as células em meio de transdução em uma 1 x 10 para a 6ª células por concentração mililitro.E adicione um mililitro de células para o controle simulado em um poço de um fragmento de fibronectina recombinante revestido 12 placas de poço para uma incubação durante a noite na incubadora de cultura celular. Em seguida, adicione 10 alíquotas mililitros das células restantes em fragmento de fibronectina recombinante revestido frascos T75 para uma incubação de 30 minutos na incubadora de cultura celular com as tampas ventiladas. Durante a incubação, o vírus condigentou amostras médias e calculou a quantidade de vírus a ser adicionada com base no título e no número de unidades infecciosas de células por mililitro.Tire o frasco da incubadora e adicione o volume adequado de vírus condicionado a cada frasco antes de devolver as células a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, transfira as células do frasco para tubos cônicos individuais de 50 mililitros. Lave as células em até 50 mililitros de HBSS por lavagem, e repita este passo até três vezes para remover o vírus residual.Incubar as células por duas horas em mídia HSPC complementada com prostaglandina E2. Em seguida, lave as células e resuspenja as células em 10 mililitros de HBSS suplementados com soro 2% autólogo por tubo. Em seguida, aspire as suspensões celulares usando uma seringa de 20 mililitros equipada com uma agulha calibre 16,5. Lave o interior do tubo com HBSS fresco mais soro 2% autólogo e aspire na seringa.Corte cuidadosamente a seringa com a tampa da agulha antes de colocar a solução celular no gelo até sua infusão em um hospedeiro autólogo. Para determinar a eficiência de modificação genética das células transduzidas, a placa 1 x 10 até a 6ª células simuladas ou transduzidas reservadas por mililitro de meio HSPC em placas tratadas de cultura não-tecidual. Nos dias dois, cinco e doze pós-transdução, colher e contar as células.Nos dias dois e cinco, repata 33% das células em meio HSPC fresco em uma concentração de 1 x 10 para o 6º por mililitro. Nos dias dois, cinco e doze, congele 33% das células no tampão de extração de DNA para PCR quantitativo em tempo real, e analise os 33% finais das células por citometria de fluxo de acordo com protocolos padrão para avaliar a composição fenotípica da prole hematopoiética. Para quantificar a expressão transgênica por citometria de fluxo, adicione três dispersão lateral adicional vs.transgene plots;and gate the first plot on the hematopoietic stem cells, the second plot on the multipotent an-erythro myeloid progenitors, e o terceiro enredo sobre os progenitores mieloides linfo, todos vs. o transgene. Em seguida, registos de 2000 a 3000 eventos e ajuste bem os portões de classificação para se adequar à força do sinal e atingir populações.Usando este protocolo, o número de HSPC positivos de primatas não humanos que são enriquecidos é tipicamente proporcional à contagem total de glóbulos brancos de entrada. Como os achados anteriores demonstraram que o produto HSPC positivo cd34 total inclui células que não são verdadeiras a longo prazo e enxertam células-tronco hematopoiéticas, essas técnicas de células baseadas em citometria de fluxo e colônia podem ser usadas para identificar e diferenciar subconjuntos enriquecidos para células-tronco hematopoiéticas de longo prazo de progenitores comprometidos. Células-tronco humanas positivas CD34 podem ser eficientemente modificadas por genes usando vetores lentivirais.As células que carregam uma cópia não integrada do diluir vetorial durante o período de ensaio de cultura líquida de 12 dias, enquanto vetores integrados no genoma são passados para toda a descendência. Como confirmado pela expressão do vetor na colônia formando ensaios celulares. Este método pré-clínico pode ser usado para isolar geneticamente modificado em células hematopoiéticas de primatas não-humanas controladas de qualidade e células progenitoras para terapia genética.Este método pode ser facilmente adaptado para outras espécies, fontes de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras, ferramentas de terapia genética e doenças. Este protocolo completamente controlado mostra grande promessa para a modelagem de terapias eficazes para inúmeras doenças humanas. Tenha em mente que trabalhar com tecidos primatas não humanos requer medidas de segurança aprimoradas, incluindo equipamentos de proteção individual.

preparation-gene-modification-nonhuman-primate-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este procedimento descreve como estabelecer culturas primárias de células hematopoiéticas da medula óssea de camundongos e é seguido por transfecção usando o Gene Pulser sistema de eletroporação MXCell.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

Aqui, apresentamos pluripotentes humanas de protocolos de cultura de células-tronco (hPSC), usados para diferenciar hPSCs em CD34+ progenitores hematopoiéticos. Este método usa a manipulação de estágio específico de WNT canônico sinalização para especificar células exclusivamente para ambos o programa hematopoiética definitivo ou primitivo.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

Este protocolo ilustra um procedimento seguro e eficiente para modificar CD133+ células-tronco hematopoiéticas. A apresentado não-virais, magnética polyplex abordagem pode fornecer uma base para a otimização dos efeitos terapêuticos células-tronco, bem como acompanhamento do produto celular administrado via ressonância magnética.

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

Aqui, descrevemos o ex vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do CD34+ células derivadas do sangue do cordão umbilical, tratados com uma combinação de um cocktail de citocinas e VPA. Esse método leva a um grau significativo de ex vivo expansão dos linfócitos primitivos para qualquer clínica ou aplicações de laboratório.

Ex Vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do cordão humano hemoderivados CD34+ células usando o ácido valproico

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

O presente protocolo descreve um procedimento de cultura otimizado de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) para o enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.

Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica

Novas estratégias para modelar fielmente mutações somáticas em células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) são necessárias para melhor estudar a biologia das células-tronco hematopoiéticas e as neoplasias hematológicas. Aqui, um protocolo para modelar mutações heterozigotas de ganho de função em HSPCs combinando o uso de CRISPR/Cas9 e transdução dupla de doador de rAAV é descrito.

Engenharia de Mutações de Ganho de Função Heterozigotas Oncogênicas em Células-Tronco Hematopoiéticas Humanas e Progenitoras

Apresentamos um método de cultura e edição gênica de células B primárias de macaco rhesus usando CRISPR/Cas9 e vírus adenoassociado recombinante sorotipo 6 para o estudo de terapias com células B.

Edição Gênica de Células B Primárias de Macaco Rhesus

O presente protocolo descreve um método para isolar, expandir e reprogramar células derivadas da urina de primatas humanos e não humanos para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), bem como instruções para a manutenção livre de alimentadores das iPSCs recém-geradas.

Geração e Manutenção de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Primatas Derivadas da Urina

A eletroporação de organoides cerebrais de primatas fornece uma abordagem precisa e eficiente para introduzir modificações genéticas transitórias em diferentes tipos de progenitores e neurônios em um sistema modelo próximo ao desenvolvimento do neocórtex (pato)fisiológico de primatas. Isso permite o estudo de processos neurodesenvolvimentais e evolutivos e também pode ser aplicado para modelagem de doenças.

Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

Aprenda a isolar e modificar geneticamente células CD34+ de primatas não humanos usando vetores lentivirais. Este método prepara células hematopoiéticas para infusão autóloga em modelos pré-clínicos de terapia gênica.

Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

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