Estimulação simultânea de elétrica e mecânica para aumentar o potencial de Cardiomyogenic das células
January 18th, 2019
Aqui nós apresentamos um protocolo para a formação de uma população celular usando estímulos elétricos e mecânicos, emulando a fisiologia cardíaca. Esta estimulação eletromecânica aumenta o potencial de cardiomyogenic das células tratadas e é uma estratégia promissora para mais terapia celular, modelagem de doença e despistagem de drogas.
Este é um método para aplicar estimulação eletromecânica nas células. Possui múltiplas aplicações para estudar seus efeitos sobre uma população celular, pré-treinamento para entrega in vivo e maturação celular. A vantagem é que estímulos elétricos e mecânicos podem ser aplicados com o mesmo dispositivo individualmente ou simultaneamente, mantendo intacto o viral estéril.
Esta técnica é uma abordagem indireta para nossa terapia. A terapia celular é considerada células eletromecanicamente estimuladas pode ser uma população celular interessante para tratar o intro-miocárdio. Esse método geralmente pertence ao campo cardiovascular, mas também pode ser aplicado ao sistema nervoso.
Esta é uma técnica fácil que requer paciência. A parte mais difícil será trabalhar com as pequenas peças, e manter a esterilidade por toda parte. Há pequenos detalhes de manipulação que são difíceis de explicar, por isso a demonstração visual é realmente útil.
Comece transferindo 12 construções PDMS limpas para placas estéreis de 10 centímetros. Para assegurar a esterilização completa, exponha as placas à luz UV por cinco minutos. Em seguida, transfira cada construção para uma placa de cultura celular separada de 35 milímetros, ou placas de 6 poços para semeadura celular imediata.
Para iniciar a semeadura celular, primeiro lave um frasco confluente T75 de ATDPCs cardíacos com cinco mililitros de 1x PBS. Para desapegar as células, adicione um mililitro de 0,05% de trippsina-EDTA. E incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Em seguida, adicione cinco mililitros de meio completo para inativar o trypsin-EDTA. Colete todas as células separadas em um tubo de 15 mililitros. Lave o vidro celular duas vezes com cinco mililitros de PBS para coletar quaisquer células restantes, e adicione-as ao tubo de 15 mililitros.
Centrífuga a 230 g por cinco minutos a 22 graus Celsius. Remova o supernatário e suspenda as células em dois mililitros de meio completo, e conte-as com o hemótmetro. Semente 200 microliters de ATDPCs cardíacos em cada placa com o PDMS constrói para obter cerca de 80% da superfície de semeadura coberta por células no dia seguinte.
Incubar a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Adicione suavemente 2 mililitros de meio completo pré-aquecido por placa. Incubar as células com os construtos a 37 graus Celsius, e 5% de CO2 durante a noite.
Antes de iniciar este procedimento, atribua seis das 12 construções para estimulação eletromecânica e mantenha seis para controles não estimulados. Use 70% de etanol para limpar a unidade de estimulação. Coloque a unidade de estimulação, eletrodos estéreis e pinças dentro do armário de fluxo.
Para manipular facilmente os eletrodos e construtos, remova 90% do meio de cada placa de cultura celular. Coloque os construções PDMS na posição certa em direção ao ímã para assegurar atração magnética entre ímãs fixos e móveis. Estas duas etapas anteriores em que você manipula as construções PDMS semeadas da célula e os eletrodos, mantendo a esterilidade durante todo o processo são as mais críticas.
Em seguida, conecte o fio de platina aos conectores do eletrodo. Oriente a parte PTFE dos eletrodos em seus espaços designados nas construções PDMS. Adicione 2,5 mililitros de meio completo fresco e pré-aquecido a cada construção.
Uma vez que todos os construtos PDMS são colocados e conectados eletricamente à plataforma, coloque a plataforma de volta para a incubadora de 37 graus Celsius e 5% de CO2. Em seguida, conecte a fonte elétrica e mecânica. Para configurar o programa de estimulação, especifique regimes de estimulação elétrica e mecânica através das interfaces de usuário do estimulador elétrico e da aplicação, que controla a estimulação mecânica.
Para definir o sincronizador, ligue o estimulador elétrico e aguarde que o menu principal apareça no visor. Em seguida, selecione a opção dois, edite sequência, além de Enter. Para editar o menu sequência, use a guia de modo para selecionar a corrente"clicando em mais"e pressionando Enter"Para o período, selecione 1000"com mais/menos e pressione Enter"E para a guia do modo de gatilho, selecione externo por software e pressione Enter"Para a guia de amplitude, selecione 1"com mais/menos e pressione Enter"Em seguida, de volta no menu principal, selecione a opção 4 e, em seguida, gere sequência e pressione Enter"Na seção de estimulação mecânica do painel do aplicativo de controle, primeiro escreva 1000"no controle de texto de período mais.
Em seguida, escreva 500""no controle de texto on time, para definir a duração do pulso mecânico. Finalmente, escreva 2000"no controle de texto de excursão para entregar um alongamento de construção de 10%. Mude a mídia celular duas vezes por semana, primeiro removendo a mídia antiga e, em seguida, adicionando mídia quente e fresca nas laterais do suporte pdms.
No sétimo dia, no final do experimento, colete as amostras conforme descrito no manuscrito. ATDPCs cardíacos eletromecanicamente estimulados aumentaram seu potencial cardiomiogênico. Isso foi indicado pelo PCR em tempo real mostrando aumento da expressão de genes cardíacos precoces e tardios especificamente o fator de transcrição cardíaca GATA-4, a cadeia pesada de marcadores estruturais beta-miosina, e o gene relacionado ao cálcio Connexin43.
A mancha de faloides contra fibras de actina mostrou que a maioria das células se alinhava de acordo com o padrão vertical. A distribuição connexin43 foi principalmente no citoplasma, e na membrana plasmática, contribuindo para a comunicação intracelular através de junções de lacunas. Os fatores de transcrição mef2 e GATA-4 foram localizados nos núcleos em ATDPCs cardíacos.
Mas o GATA-4 não foi detectado em ATDPCs subcutâneos. Os marcadores citoplasmados SERCA2, e alfa-actinina sarcomeric, não mostraram uma organização sarcomere madura típica para cardiomiócitos. E o espancamento não foi observado no controle e estimulou as populações celulares.
Uma monocamada celular saudável no início deste protocolo e manter a esterilidade durante todo o procedimento são cruciais. Após a coleta da amostra, as técnicas padrão de expressão da proteína do genoma podem ser realizadas. Esta técnica ajuda a entender melhor o efeito dos estímulos elétricos e/ou mecânicos das células.
Até recentemente, era impossível usar o mesmo dispositivo para ambos os estímulos, o que tornava os resultados mais difíceis de comparar.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para aplicar estimulação eletromecânica às células, melhorando seu potencial cardiomiogênico. Esta técnica tem aplicações em terapia celular, modelagem de doenças e triagem de medicamentos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa cardiovascular
- Terapia celular
- Aplicações em neurociência
Fundamentos
- A estimulação eletromecânica pode melhorar a maturação celular.
- Este método permite a aplicação simultânea de estímulos elétricos e mecânicos.
- A técnica mantém condições estéreis para integridade viral.
- É relevante para estudos tanto do sistema cardíaco quanto do sistema nervoso.
Objetivo do Estudo
- Melhorar o potencial cardiomiogênico de populações celulares.
- Explorar os efeitos da estimulação eletromecânica nas células.
- Fornecer um método de pré-treinamento para administração in vivo.
Métodos Utilizados
- Aplicação de estímulos elétricos
- Aplicação de estímulos mecânicos
- Técnicas de estimulação simultânea
- Manutenção de condições estéreis
Principais Resultados
- Melhoria na maturação das células tratadas.
- Potencial para aplicações efetivas de terapia celular.
- Versatilidade na aplicação em diferentes campos.
- Indicações para pesquisas adicionais em modelagem de doenças.
Conclusões
- A estimulação eletromecânica é uma estratégia promissora para terapia celular.
- Este método pode levar a avanços na triagem de medicamentos.
- Estudos adicionais são necessários para explorar todo o seu potencial.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Electromechanical stimulation addresses a key limitation in cardiac cell therapy: the immature phenotype of stem cell-derived cardiomyocytes. By recapitulating physiological electrical and mechanical cues, this method enhances cardiomyogenic potential, improving predictive confidence in preclinical models. This supports de-risking of cell-based therapies and disease modeling platforms prior to IND-enabling studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac lineage commitment through upregulation of early (GATA-4), structural (beta-myosin heavy chain), and calcium-regulating (Connexin43) genes.
- Operational Value: Provides a standardized stimulus platform to compare electrical, mechanical, or combined conditioning effects on cell populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates electrically and mechanically conditioned cells with aligned actin fibers and membrane-localized Connexin43, supporting functional assay readiness.
- Operational Value: Allows consistent pre-conditioning of cell batches for reproducible drug response profiling in high-throughput formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical workflows by maturing cells toward an adult-like phenotype, reducing mechanistic ambiguity in engraftment studies.
- Operational Value: Supports scalable production of stimulated cell populations for dose-response and toxicity screening in cardiovascular disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling conditioned cell generation after progenitor expansion and prior to functional validation or compound testing.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that biophysical cues drive cardiomyogenic differentiation, supporting target validation via marker expression.
- Screening: Produces stimulation-primed cells with enhanced structural and electrical coupling, improving assay sensitivity to cardiotropic compounds.
- Analytics: Delivers quantitative PCR and imaging readouts (e.g., gene expression, actin alignment, gap junction distribution) for objective comparison across conditions.
- Translational Research: Advances cells from progenitor state to a more mature cardiac phenotype, supporting preclinical continuity in disease modeling.
- Enterprise Reuse: The stimulation platform is reusable across cell lines and stimulus regimens, promoting standardization across discovery teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in cardiac lineage specification through multi-parametric maturation readouts.
- Operational Value: Sterile, simultaneous electrical and mechanical stimulation reduces variability and manual handling.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by de-risking mechanistic uncertainty in cell therapy mechanisms of action.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell candidates based on stimulation-responsive maturation potential.
Implementation Considerations
- Expertise in cell culture, sterile technique, and stimulation device operation.
- Access to electrical and mechanical stimulators with synchronized control software.
- Standardized protocols for construct seeding, medium exchange, and stimulus parameter configuration.
- Adaptation considerations for different cell types, matrix materials, and stimulation waveforms.
- Limitation: Maturation assessed via marker expression; functional metrics like contractility were not observed in this study.
