Estimulação simultânea de elétrica e mecânica para aumentar o potencial de Cardiomyogenic das células
18 de janeiro de 2019
Aqui nós apresentamos um protocolo para a formação de uma população celular usando estímulos elétricos e mecânicos, emulando a fisiologia cardíaca. Esta estimulação eletromecânica aumenta o potencial de cardiomyogenic das células tratadas e é uma estratégia promissora para mais terapia celular, modelagem de doença e despistagem de drogas.
Este é um método para aplicar estimulação eletromecânica nas células. Possui múltiplas aplicações para estudar seus efeitos sobre uma população celular, pré-treinamento para entrega in vivo e maturação celular. A vantagem é que estímulos elétricos e mecânicos podem ser aplicados com o mesmo dispositivo individualmente ou simultaneamente, mantendo intacto o viral estéril.
Esta técnica é uma abordagem indireta para nossa terapia. A terapia celular é considerada células eletromecanicamente estimuladas pode ser uma população celular interessante para tratar o intro-miocárdio. Esse método geralmente pertence ao campo cardiovascular, mas também pode ser aplicado ao sistema nervoso.
Esta é uma técnica fácil que requer paciência. A parte mais difícil será trabalhar com as pequenas peças, e manter a esterilidade por toda parte. Há pequenos detalhes de manipulação que são difíceis de explicar, por isso a demonstração visual é realmente útil.
Comece transferindo 12 construções PDMS limpas para placas estéreis de 10 centímetros. Para assegurar a esterilização completa, exponha as placas à luz UV por cinco minutos. Em seguida, transfira cada construção para uma placa de cultura celular separada de 35 milímetros, ou placas de 6 poços para semeadura celular imediata.
Para iniciar a semeadura celular, primeiro lave um frasco confluente T75 de ATDPCs cardíacos com cinco mililitros de 1x PBS. Para desapegar as células, adicione um mililitro de 0,05% de trippsina-EDTA. E incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Em seguida, adicione cinco mililitros de meio completo para inativar o trypsin-EDTA. Colete todas as células separadas em um tubo de 15 mililitros. Lave o vidro celular duas vezes com cinco mililitros de PBS para coletar quaisquer células restantes, e adicione-as ao tubo de 15 mililitros.
Centrífuga a 230 g por cinco minutos a 22 graus Celsius. Remova o supernatário e suspenda as células em dois mililitros de meio completo, e conte-as com o hemótmetro. Semente 200 microliters de ATDPCs cardíacos em cada placa com o PDMS constrói para obter cerca de 80% da superfície de semeadura coberta por células no dia seguinte.
Incubar a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Adicione suavemente 2 mililitros de meio completo pré-aquecido por placa. Incubar as células com os construtos a 37 graus Celsius, e 5% de CO2 durante a noite.
Antes de iniciar este procedimento, atribua seis das 12 construções para estimulação eletromecânica e mantenha seis para controles não estimulados. Use 70% de etanol para limpar a unidade de estimulação. Coloque a unidade de estimulação, eletrodos estéreis e pinças dentro do armário de fluxo.
Para manipular facilmente os eletrodos e construtos, remova 90% do meio de cada placa de cultura celular. Coloque os construções PDMS na posição certa em direção ao ímã para assegurar atração magnética entre ímãs fixos e móveis. Estas duas etapas anteriores em que você manipula as construções PDMS semeadas da célula e os eletrodos, mantendo a esterilidade durante todo o processo são as mais críticas.
Em seguida, conecte o fio de platina aos conectores do eletrodo. Oriente a parte PTFE dos eletrodos em seus espaços designados nas construções PDMS. Adicione 2,5 mililitros de meio completo fresco e pré-aquecido a cada construção.
Uma vez que todos os construtos PDMS são colocados e conectados eletricamente à plataforma, coloque a plataforma de volta para a incubadora de 37 graus Celsius e 5% de CO2. Em seguida, conecte a fonte elétrica e mecânica. Para configurar o programa de estimulação, especifique regimes de estimulação elétrica e mecânica através das interfaces de usuário do estimulador elétrico e da aplicação, que controla a estimulação mecânica.
Para definir o sincronizador, ligue o estimulador elétrico e aguarde que o menu principal apareça no visor. Em seguida, selecione a opção dois, edite sequência, além de Enter. Para editar o menu sequência, use a guia de modo para selecionar a corrente"clicando em mais"e pressionando Enter"Para o período, selecione 1000"com mais/menos e pressione Enter"E para a guia do modo de gatilho, selecione externo por software e pressione Enter"Para a guia de amplitude, selecione 1"com mais/menos e pressione Enter"Em seguida, de volta no menu principal, selecione a opção 4 e, em seguida, gere sequência e pressione Enter"Na seção de estimulação mecânica do painel do aplicativo de controle, primeiro escreva 1000"no controle de texto de período mais.
Em seguida, escreva 500""no controle de texto on time, para definir a duração do pulso mecânico. Finalmente, escreva 2000"no controle de texto de excursão para entregar um alongamento de construção de 10%. Mude a mídia celular duas vezes por semana, primeiro removendo a mídia antiga e, em seguida, adicionando mídia quente e fresca nas laterais do suporte pdms.
No sétimo dia, no final do experimento, colete as amostras conforme descrito no manuscrito. ATDPCs cardíacos eletromecanicamente estimulados aumentaram seu potencial cardiomiogênico. Isso foi indicado pelo PCR em tempo real mostrando aumento da expressão de genes cardíacos precoces e tardios especificamente o fator de transcrição cardíaca GATA-4, a cadeia pesada de marcadores estruturais beta-miosina, e o gene relacionado ao cálcio Connexin43.
A mancha de faloides contra fibras de actina mostrou que a maioria das células se alinhava de acordo com o padrão vertical. A distribuição connexin43 foi principalmente no citoplasma, e na membrana plasmática, contribuindo para a comunicação intracelular através de junções de lacunas. Os fatores de transcrição mef2 e GATA-4 foram localizados nos núcleos em ATDPCs cardíacos.
Mas o GATA-4 não foi detectado em ATDPCs subcutâneos. Os marcadores citoplasmados SERCA2, e alfa-actinina sarcomeric, não mostraram uma organização sarcomere madura típica para cardiomiócitos. E o espancamento não foi observado no controle e estimulou as populações celulares.
Uma monocamada celular saudável no início deste protocolo e manter a esterilidade durante todo o procedimento são cruciais. Após a coleta da amostra, as técnicas padrão de expressão da proteína do genoma podem ser realizadas. Esta técnica ajuda a entender melhor o efeito dos estímulos elétricos e/ou mecânicos das células.
Até recentemente, era impossível usar o mesmo dispositivo para ambos os estímulos, o que tornava os resultados mais difíceis de comparar.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para aplicar estimulação eletromecânica a células, aumentando seu potencial cardiomiogênico. Esta técnica possui aplicações na terapia celular, modelagem de doenças e triagem de fármacos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Pesquisa cardiovascular
- Terapia celular
- Aplicações em neurociência
Contexto
- A estimulação eletromecânica pode melhorar a maturação celular.
- Este método permite a aplicação simultânea de estímulos elétricos e mecânicos.
- A técnica mantém condições estéreis para a integridade viral.
- É relevante para estudos do sistema cardíaco e do sistema nervoso.
Objetivo do Estudo
- Para aumentar o potencial cardiomiogênico de populações celulares.
- Para explorar os efeitos da estimulação eletromecânica sobre as células.
- Para fornecer um método de pré-treinamento para entrega in vivo.
Métodos Utilizados
- Aplicação de estímulos elétricos
- Aplicação de estímulos mecânicos
- Técnicas de estimulação simultânea
- Manutenção de condições estéreis
Resultados Principais
- Maturação aprimorada das células tratadas.
- Potencial para aplicações eficazes em terapia celular.
- Versatilidade na aplicação em diferentes áreas.
- Indicações para pesquisas futuras em modelagem de doenças.
Conclusões
- A estimulação eletromecânica é uma estratégia promissora para terapia celular.
- Esse método poderia levar a avanços na triagem de fármacos.
- São necessários estudos adicionais para explorar seu potencial completo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A estimulação eletromecânica aborda uma limitação fundamental na terapia celular cardíaca: o fenótipo imaturo dos cardiomiócitos derivados de células-tronco. Ao recapitular estímulos fisiológicos elétricos e mecânicos, este método potencializa o potencial cardiomiogênico, melhorando a confiabilidade preditiva em modelos pré-clínicos. Isso contribui para a redução de riscos em terapias baseadas em células e em plataformas de modelagem de doenças antes dos estudos habilitadores de IND.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação do comprometimento da linhagem cardíaca por meio da superexpressão de genes precoces (GATA-4), estruturais (cadeia pesada da beta-miosina) e reguladores do cálcio (Connexina43).
- Valor Operacional: Fornece uma plataforma padronizada de estímulo para comparar os efeitos do condicionamento elétrico, mecânico ou combinado sobre populações celulares.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera células eletricamente e mecanicamente condicionadas com fibras de actina alinhadas e conexina 43 localizada na membrana, favorecendo a prontidão para ensaios funcionais.
- Valor Operacional: Permite o pré-condicionamento consistente de lotes celulares para perfis reprodutíveis de resposta a fármacos em formatos de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Conecta descobertas e fluxos de trabalho pré-clínicos ao amadurecer células rumo a um fenótipo semelhante ao adulto, reduzindo a ambiguidade mecanicista em estudos de enxerto.
- Valor Operacional: Permite a produção escalonável de populações celulares estimuladas para triagem de resposta à dose e toxicidade em modelos de doenças cardiovasculares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se na sequência de descoberta a pré-clínico, permitindo a geração de células condicionadas após a expansão de progenitores e antes da validação funcional ou testes de compostos.
- Biologia da Descoberta: Testa a hipótese de que sinais biofísicos induzem a diferenciação cardiomiogênica, apoiando a validação de alvos por meio da expressão de marcadores.
- Triagem: Gera células pré-estimuladas com acoplamento estrutural e elétrico aprimorado, aumentando a sensibilidade do ensaio a compostos cardiotrópicos.
- Análises: Fornece leituras quantitativas de PCR e de imagens (por exemplo, expressão gênica, alinhamento da actina, distribuição de junções comunicantes) para comparação objetiva entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Promove a maturação das células desde um estado progenitor até um fenótipo cardíaco mais avançado, apoiando a continuidade pré-clínica na modelagem de doenças.
- Reutilização Empresarial: A plataforma de estímulo pode ser reutilizada em diferentes linhagens celulares e regimes de estímulo, promovendo a padronização entre equipes de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na especificação da linhagem cardíaca por meio de leituras multiparamétricas de maturação.
- Valor Operacional: Estimulação elétrica e mecânica simultânea e estéril reduz a variabilidade e o manuseio manual.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar ao reduzir incertezas mecanicistas nos mecanismos de ação da terapia celular.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos celulares com base no potencial de maturação em resposta à estimulação.
Considerações sobre a Implementação
- Experiência em cultura celular, técnica estéril e operação de dispositivos de estimulação.
- Acesso a estimuladores elétricos e mecânicos com software de controle sincronizado.
- Protocolos padronizados para semeadura de construtos, troca de meio e configuração de parâmetros de estímulo.
- Considerações sobre adaptação para diferentes tipos celulares, materiais da matriz e formas de onda de estimulação.
- Limitação: a maturação foi avaliada por meio da expressão de marcadores; métricas funcionais como contratilidade não foram observadas neste estudo.
