Name: Deteção da atividade de Protease por zimografia peptídeo fluorescente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Aprenda a técnica de zimografia com peptídeos fluorescentes para detecção de proteases em amostras biológicas. Este método modular permite personalizar sequências de peptídeos para identificar diferentes proteases em estudos de biomateriais.

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Financiamento concedido pela The Ohio estado Universidade faculdade de engenharia, departamento de engenharia biomédica e a Comprehensive Cancer Center - Hospital de câncer de James Arthur G. e Richard J. Solove Research Institute.

1. preparação da camada de Gel de resolução
<ol><li>Prepare uma poliacrilamida 10% resolução solução de gel, conforme tabela 1. Adicione o tempted (TEMED) e persulfato de amónio (APS) imediatamente antes de derramar o gel como sua adição inicia a reação de polimerização.</li>
	<li>Encha uma gaveta de mini gel vazio 1,5 mm (5 mL) a meio caminho com a solução 10% de gel de resolução.</li>
	<li>Adicione uma camada fina de isopropanol (~ 500 µ l) na parte superior do gel de polyacrylamide para produzir um gel de nível e evitar bolhas. Use a solução de poliacrilamida sobra para rastrear o progresso da reação de polimerização. Quando a poliacrilamida no tubo completamente solidificada, a reação é completa (~ 40 min).</li>
</ol>2. preparação da molécula de vinculador Azido-PEG3-maleimide
<ol><li>Enquanto a primeira camada de gel de resolução é a polimerização, recuperar o azido-PEG3-maleimide kit de armazenamento-20 ° C e permitir que os componentes atingir a temperatura. Existem dois componentes em cada kit. Frasco 1 contém um éster maleimide-NHS, um off-White para cinza sólida. Frasco 2 contém azido-PEG3-amina, um óleo ligeiramente amarelo. Nota: Os autores sugerem usando o kit de azido-PEG3-maleimide de 25 mg, como só pode ser armazenado por curtos períodos de tempo (1-2 horas) a-20 ° C após estar preparado antes de começar a degradar. 25 mg é suficiente para produzir 10 géis de peptídeo. Use o gel dentro de 3 semanas de preparação.</li>
	<li>Dissolver os componentes do frasco 2 no fabricante recomendado volume de Dimetilsulfóxido (DMSO) e vórtice por 30 s para garantir os líquidos foram bem misturados.</li>
	<li>Transferi o conteúdo do frasco 1 para um balão de fundo redondo de 100ml limpo e seco, contendo uma barra de agitação. Nota: Lavar o balão com acetona e secar completamente antes do uso para evitar a umidade de interferir com a reação.</li>
	<li>Imediatamente coloque uma rolha de septo de borracha com um diafragma que pode ser perfurado com uma seringa na boca do balão. Trabalhe rapidamente para impedir a entrada no balão de umidade.</li>
	<li>Inserir dois 18 calibre seringa de agulhas para o diafragma e se conectar a um tanque de gás inerte (por exemplo, gás argônio). Permitir que o gás inerte para encher o balão de 3 min. Misture os componentes de frascos 1 e 2 sob gás inerte para evitar que os produtos de reação indesejável. Atenção: A segunda agulha da seringa é fornecer um respirador, permitindo assim que o ar atmosférico contido no balão para fluir para fora do balão como enche de gás inerte. Não se esqueça de incluir uma agulha de ventilação!</li>
	<li>Desligar o gás inerte e desconectá-lo da agulha. Usando uma seringa, injete o conteúdo total do frasco 2 para o balão.</li>
	<li>Retire as agulhas e seringa e permitir que os componentes misturar durante 30 min à temperatura ambiente, agitando.</li>
	<li>Remova o bujão de septo de borracha e transferir o conteúdo para um tubo de centrifugação de limpeza 5 mL. A solução de azido-PEG3-maleimide deve ser usada dentro de 1 hora em temperatura ambiente.</li>
</ol>3. preparação do Peptide resolver a camada de Gel
<ol><li>Uma vez que a primeira camada de gel de resolução tem polimerizado, despeje a camada de isopropanol. Lave a parte superior do gel por pipetagem 1 mL de água desionizada na parte superior do gel e em seguida, despeje a água.</li>
	<li>Recuperar o peptídeo fluorescente thiol-acrescida de armazenamento-80 ° C e deixe-a descongelar à temperatura ambiente. Nota: O peptídeo thiol-acrescida pode ser preparado como descrito anteriormente,11,12. Peptídeos disponíveis comercialmente também podem ser usados, mas exigem a adição de um resíduo de cisteína terminal para permitir que o maleimide-tiol clique reação. Dissolver o peptídeo a uma concentração das ações de 10 mM e armazená-lo a-80 ° C em pequenas alíquotas (30 uL) para limitar a ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.</li>
	<li>Prepare um 10% de solução de solução de gel que contém a molécula de vinculador azido-PEG3-maleimide e o peptídeo fluorescente conforme tabela 1. Adicione o TEMED e APS imediatamente antes de derramar o gel como sua adição inicia a reação de polimerização.</li>
	<li>Encha metade da parte restante da fita gel (3 mL) com o peptídeo resolver a solução de gel. Nota: Uma abordagem multi-camada de gel de resolução reduz a quantidade de peptídeos e vinculador necessária para cada gel. O tamanho da camada de gel de resolução de peptídeo pode ser ajustado para acomodar uma maior gama de pesos moleculares, conforme necessário.</li>
	<li>Pipete uma camada fina de isopropanol (~ 500 µ l) para o topo do gel de poliacrilamida para produzir um gel de nível e evitar bolhas. Use a solução de poliacrilamida sobra para rastrear o progresso da reação de polimerização. Quando a poliacrilamida no tubo completamente solidificada, a reação é completa (~ 40 min). Nota: O peptídeo fluorescente é sensível à luz. Manter os géis cobertos com papel alumínio para evitar fotobranqueamento durante o desenvolvimento, a electroforese, a lavagem e a preparação do gel.</li>
	<li>Despeje a camada de isopropanol e enxaguar o topo do peptide resolvendo gel com água desionizada, como no passo 3.1.</li>
	<li>Se usar o gel imediatamente, avance para o passo 4, caso contrário, mergulhe os géis preparados em 100 mL de 1x solução salina tamponada fosfato (PBS) a 4 ° C em uma caixa de plástico para evitar que os géis de secar. Embrulhe a caixa em papel de alumínio para evitar fotobranqueamento. Géis podem ser armazenados em PBS por até 3 semanas antes do uso.</li>
</ol>4. preparação do Gel de empilhamento
<ol><li>Prepare uma solução de gel de empilhamento de 5% conforme tabela 1. Adicione o TEMED e APS imediatamente antes de derramar o gel como sua adição inicia a reação de polimerização.</li>
	<li>Preencha a parte restante vazia da fita gel (~ 2 mL) com a solução de gel de empilhamento.</li>
	<li>Inserir rapidamente um pente de gel de 1,5 mm para a camada de gel de empilhamento, certificar-se de que não há bolhas permanecem presas sob os poços. Use a solução de poliacrilamida sobra para rastrear o progresso da reação de polimerização. Quando a poliacrilamida no tubo completamente solidificada, a reação é completa (~ 10 min).</li>
	<li>Remova cuidadosamente o pente e a fita na parte de trás da fita gel.</li>
</ol>5. preparação de amostras biológicas para eletroforese
<ol><li>Prepare a mídia celular condicionado, lisados celulares, tecido homogenates e padrões MMP conforme descrito em outro lugar sob condições de não-redução2. Não aqueça as amostras.</li>
	<li>Por exemplo, prepare a mídia celular condicionado como segue:<ol>
<li>Placa 40.000 células/cm2 células em uma placa de 6 em 10% de soro fetal bovino (FBS) meios de cultura. Incubar as células em uma câmara umidificada (5% CO2 a 37 ° C) por 24 horas e permitir que alcancem a confluência de 70-80%. Nota: Se as células não tem atingido a confluência desejada após 24 horas, permita-lhes a crescer em meios de cultura FBS de 10% para um adicional de 24 horas.</li>
		<li>Lavar as células duas vezes com PBS e adicionar 2 mL de soro livre de meios de cultura. Incube as células em uma câmara umidificada (5% CO2 a 37 ° C) por um adicional de 24 horas.</li>
		<li>Usando uma pipeta sorológica, colete os meios condicionados de cada poço. Centrifugue a mídia a 1200 rpm por 3 minutos remover os detritos de células. Leve o sobrenadante e concentrar-se usando um 15ml, kDa 10 unidade de filtro centrífugo corte de peso molecular. Centrifugar as unidades de filtro em 4.000 x g durante 15 minutos em um rotor de balde oscilante ou 5.000 x g, durante 15 min em um rotor de ângulo fixo. Nota: Este passo é opcional, mas pode aumentar a intensidade das bandas proteolíticas os géis de zimografia de peptídeo.</li>
		<li>Transferi o filtrado concentrado para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Alíquota e armazenamento de amostras a-80 ° C por até três ciclos de congelamento e descongelamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificar o teor de proteínas usando um ensaio de quantificação de proteína padrão (por exemplo, BCA, ensaio de Bradford, etc.).</li>
</ol>6. eletroforese de biológico amostras em peptídeo zimografia géis
<ol><li>Dissolver amostras no amortecedor da amostra zimografia convencional (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25% de glicerol, SDS de 4%, 0,01% bromofenol). Para as amostras de células e tecidos, recomenda-se ~ 30 µ g de proteína total por bem e 50-100 ng de proteína para padrões MMP.</li>
	<li>Adicione 400 mL de 1 x Tris-glicina SDS executando o Buffer para o aparelho de gel. Carrega até 35 µ l de amostra por bem. Execute os exemplos em 120 V a 4 ° C por 1,5 horas ou até que os padrões de peso molecular indicam que as proteases de interesse dentro do peptide resolver a camada de gel (que tem uma cor laranja visível). Nota: a maioria das MMPs e suas variantes abrangidos pela faixa de 35-100 kDa. Quando os padrões de peso molecular indicam que os pesos são dentro do peptide resolver a camada de gel, electroforese pode ser parada. O mesmo princípio pode ser aplicado a outras classes de proteases com conhecidos pesos moleculares. Se houver interesse na detecção de várias proteases sobre uma maior gama de pesos moleculares, reduzir o tamanho da camada de gel de resolução e aumentar o tamanho da camada de gel de resolução de peptídeo.</li>
	<li>Após eletroforese, remover os géis de fita plástica e lave géis três vezes por 10 min cada à temperatura sob agitação suave em tampão de renaturing contendo 2,5% Triton X-100, 1 µM ZnCl2e 5 mM CaCl2 em 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.</li>
	<li>Géis de transferência para uma solução-tampão em desenvolvimento contendo 1% Triton X-100, 1 µM ZnCl2 e 5 mM CaCl2 em 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 15 min. substituir com fresco desenvolvendo solução de buffer e incubar gel a 37 ° C, sob agitação suave durante 24 horas , certificando-se que os geles são totalmente submersas na solução.</li>
</ol>7. imagem latente do peptídeo zimografia geles
<ol><li>Após 24 horas, géis de imagem usando uma fluorescente de gel scanner/imager usando os filtros apropriados de excitação e emissão. Por exemplo, os géis de peptídeo mostrados nos resultados representativos são conjugados com fluoresceína e foi fotografados usando um filtro de excitação de 488 nm e um filtro de emissão de 521 nm. Usar os filtros adequados para seu fluoróforo irá maximizar a detecção de atividade proteolítica. Nota: Imagens também podem ser tomadas com um gel de tonalizador equipado com um transiluminador de UV, muitas vezes usado para o tratamento de imagens de DNA géis corados com brometo de etídio. Imagem do gel usando o transiluminador UV (365 nm) configuração e um filtro de emissão de 590 nm.</li>
	<li>Conduzir a avaliação densitométricos das intensidades de banda usando o ImageJ conforme descrito em outro lugar13.</li>
</ol>

<ol><li>Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+methods+for+visualizing+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes.</a> Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).</li>
<li>Toth, M., Fridman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Gelatinases+%28MMP-2+and+MMP-9%29+by+Gelatin+Zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography.</a> Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).</li>
<li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).</li>
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<li>Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+bioscaffolds+for+3D+culture+of+melanoma+cells+reveal+increased+MMP+activity+and+migration+with+BRAF+kinase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).</li>
<li>Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+as+a+Research+Tool+in+the+Study+of+Matrix+Metalloproteinase+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).</li>
<li>Nagase, H., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+matrix+metalloproteinase+specificity+studies+using+collagen+sequence-based+synthetic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide.</a> Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).</li>
<li>Mucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Type-1+Matrix+Metalloprotease+and+Stromelysin-3+Cleave+More+Efficiently+Synthetic+Substrates+Containing+Unusual+Amino+Acids+in+Their+P1%E2%80%B2+Positions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).</li>
<li>Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-+and+two-dimensional+SDS-PAGE+zymography+with+quenched+fluorogenic+substrates+provides+identification+of+biological+fluid+proteases+by+direct+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).</li>
<li>Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+mass+spectrometric+characterization+of+proteases+and+inhibitors+in+human+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics.+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva.</a> Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).</li>
<li>Yu, W., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-Enhanced+Zymographic+Detection+of+Matrilysin+and+Collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases.</a> Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

As técnicas atuais de zymographic contam com a incorporação de substratos nativos em gel de poliacrilamida para a detecção de proteólise. Enquanto estas técnicas têm alcançado uso generalizado, eles ainda são limitados no número de proteases podem detectar. Aqui, um protocolo foi descrito em quais peptídeos fluorescentes, protease-degradáveis são incorporados a resolução de gel de poliacrilamida. Ligações covalentes acoplamento usando uma molécula de vinculador azido-PEG3-maleimide permite a separação e a detecção de uma...

Zimografia gel é uma técnica biológica usada para medir a atividade proteolítica dentro de amostras biológicas, tais como fluidos corporais ou meios de cultura de células a1,2,3. As amostras são separadas por seus pesos moleculares com a eletroforese através de um gel de polyacrylamide incorporado com um substrato degradável. Substratos degradáveis comuns incluem gelatina, caseína, colágeno e elastina, que foram utilizados para medir a atividade de metaloproteinases de matriz (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -9 e -11, além de uma variedade de cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. após eletroforese, as enzimas são renatured e permitido para degradar a proteína dentro do gel. Em zimografia tradicional gel, o gel está manchado com uma tintura de proteína, tais como o azul de Coomassie, e atividade de protease é detectada como uma perda de sinal, ou seja, branco de bandas (degradação da proteína) em um fundo azul escuro.
Aqui, descrevemos um protocolo para um método alternativo de zimografia de gel, em que o substrato degradável é um curto-circuito, fluorogenic peptídeo covalentemente incorporado o gel de poliacrilamida (Figura 1). A substituição de peptídeos sintéticos como os substratos degradáveis permite a detecção de uma gama maior de proteases em comparação com o tradicional gel zimografia com proteínas nativas9. Ligação covalente do peptide fluorogenic impede a difusão do peptide e migração durante a electroforese do gel observado com anteriores métodos9,10. Além disso, o uso de um substrato fluorogenic permite detecção direta de atividade de protease sem coloração adicionais e passos de coloração. O objectivo geral deste método é a detecção de atividade de protease em amostras biológicas através a incorporação covalente de peptídeos fluorogenic em géis de zymogram.

<table><tbody><tr><td>de gel vazios de 1,5 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2015</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mm, 10 poços Pentes de de gel vazios</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC3510</td><td></td></tr><tr><td>1x solução salina tamponada com fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>Solução SDS de 20%</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>3x Tampão de amostra de zimografia</td><td>Bio-Rad</td><td>1610764</td><td></td></tr><tr><td>40% (w/v) Acrilamida/Bis (19:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Tecidos de 6 Poços</td> Unidade de Filtro Centrífugo <td>ThermoFisher Scientific</td><td>087721B</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-2 (10 kDa MWCO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de Amunium</td><td>Kit Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Azido-PEG3-Maleimide Click</td><td>Chemistry Ferramentas</td><td>AZ107</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP510100</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Kit de Ensaio de Proteína</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>N N N' N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Fonte de Alimentação Básica Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas Hipodérmicas PrecisionGlide</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826</td><td></td></tr><tr><td>Balão de Fundo Redondo (100 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-873-144</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Borracha de Septo</td>Seringa de Ponta Deslizante Estéril <td>Fisher Scientific</td><td>50-872-546</td><td></td></tr><tr><td>(1 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochlroide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Molecular Imager</td><td>GE Amersham</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Zinco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>208086</tr></tbody></table>

deteção da atividade de protease por zimografia peptídeo fluorescente

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

A finalidade desse método é medir a atividade proteolítica de amostras biológicas complexas. As amostras são separadas por peso molecular usando electroforese através de um gel de resolução incorporado com um substrato degradável. Esse método difere zimografia tradicional gel, em que um peptídeo extinto fluorogenic covalentemente é incorporado o gel de resolução em vez de proteínas de comprimento total, tais como gelatina ou de caseína. Uso dos peptides fluorogenic permite a detecção direta de atividade proteolítica sem etapas adicionais de coloração. As enzimas dentro as amostras biológicas cleave o peptídeo fluorogenic temperada, resultando em um aumento na fluorescência. O sinal fluorescente no gel é então fotografada com um scanner padrão gel fluorescente e quantificados utilizando densitometria. O uso de peptídeos como substrato degradável grandemente expande as proteases possíveis detectáveis com técnicas de zymographic.

Usando o método descrito aqui, dois péptidos protease-degradáveis fluorescentes foram incorporados em géis de poliacrilamida: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abreviado como QGIW ao longo do texto e figuras) e GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abreviado como LACW ao longo do texto e figuras). ↓ indica o local de clivagem. QGIW é um colágeno-que derivei sequência projetada para detectar colagenases celular14. LACW é uma sequência que foi otimizada para ...

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para uma técnica modificada de zymographic na qual fluorescentes peptídeos são usados como substrato degradável no lugar de proteínas nativas. Eletroforese de amostras biológicas em Zimogramas peptídeo fluorescente permite a detecção de uma gama maior de proteases que as técnicas de zymographic anterior.

Deteção da atividade de Protease por zimografia peptídeo fluorescente

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

As técnicas zymográficas atuais detectam um número limitado de proteases. A zymografia fluorescente do peptídeo usa peptídeos fluorescentes como o substrato degradável que permite a medição de uma maior gama de proteases. A principal vantagem deste método é seu design modular.A sequência do peptídeo fluorescente determina quais proteases são detectadas e o peptídeo fluorescente pode ser facilmente trocado por um peptídeo de uma sequência diferente, uma capacidade de detectar outros proteases. Esta técnica pode ajudar a informar o design do uso de peptídeos como cruz-linkers degradáveis em biomateriais projetados, como os usados para entrega de medicamentos ou aplicações de engenharia de tecidos. A incorporação desse peptídeo nesta técnica pode identificar proteases secretas teciduais responsáveis pela degradação do biomamaterial.A demonstração dessa técnica é importante para visualizar a abordagem multicamadas que é única em comparação com outras técnicas de zymografia. Demonstrando essa técnica, Ameya Deshmukh, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, prepare uma solução de gel de resolução de 10%poliacrilamida, conforme descrito na tabela um do protocolo de texto.Imediatamente antes de derramar o gel, adicione o TEMED e o APS. Em seguida, encha e esvazie o de 1,5 milímetros mini gel no meio do caminho com a solução de gel de resolução. Adicione uma fina camada de isopropanol ao topo do gel de poliacrilamida para produzir um gel nivelado e evitar bolhas.Use a solução de poliacrilamida restante para acompanhar o progresso da reação de polimerização. Quando o poliacrilamida no tubo se solidificou completamente, a reação está completa. Enquanto a primeira camada de gel de resolução é polimerizadora, recupere o kit Azido-PEG3-Maleimide do armazenamento a 20 graus Celsius e permita que os componentes atinjam a temperatura ambiente.Em seguida, dissolva os componentes do frasco dois no volume recomendado pelo fabricante de DMSO. E vórtice por 30 segundos para garantir que os líquidos estejam bem misturados. Transfira o conteúdo do frasco um em um frasco fundo redondo limpo e seco de 100 miluletos que contenha uma barra de mexida.Insira imediatamente uma rolha de septo de borracha com um diafragma que pode ser perfurado com uma seringa na boca do frasco. Em seguida, insira duas agulhas de seringa de calibre 18 no diafragma. Conecte uma das agulhas de seringa a um tanque de gás inerte e deixe o gás encher o frasco fundo redondo por três minutos.Em seguida, desligue o gás inerte e desprende-o da agulha. Usando uma seringa, injete o conteúdo completo do frasco dois no frasco. Remova as agulhas e a seringa.Deixe os componentes se misturarem por 30 minutos à temperatura ambiente enquanto mexem. Depois disso, remova a rolha de septo de borracha e transfira o conteúdo para um tubo de centrífuga de cinco mililitros limpos. Uma vez que a primeira camada de gel de resolução tenha polimerizado despeje a camada isopropanol.Pipet um mililitro de água desionizada em cima do gel e, em seguida, despeje a água para enxaguar o gel. Recupere o peptídeo fluorescente funcionalizado de tiol do armazenamento a 80 graus Celsius. Deixe descongelar à temperatura ambiente.Prepare uma solução de gel 10% resoluta contendo a molécula de linker Azido-PEG3-Maleimide e o peptídeo fluorescente conforme descrito na tabela um do protocolo de texto. Imediatamente antes de derramar o gel adicione o TMED e o APS. Em seguida, encha metade da parte restante do de gel com a solução de gel de resolução de peptídeos.Adicione uma fina camada de isopropanol ao topo do gel de poliacrilamida para produzir um gel nivelado e evitar bolhas. Use a solução de poliacrilamida restante para acompanhar o progresso da reação de polimerização. Depois que a reação estiver completa, despeje a camada isopropanol.Pipet um mililitro de água desionizada em cima do gel e, em seguida, despeje a água para enxaguar o gel. Se não usar os géis imediatamente, armazene-os imergindo-os em uma caixa de plástico cheia de 100 mililitros de 1x PBS a quatro graus Celsius. Enrole a caixa em papel alumínio para evitar fotobleaching.Primeiro, prepare uma solução de gel de empilhamento de 5%, conforme descrito na tabela um do protocolo de texto. Imediatamente antes de derramar o gel adicione o TMED e o APS. Encha a parte vazia restante do de gel com a solução de gel de empilhamento.Insira rapidamente um pente de gel de 1,5 milímetros na camada de gel de empilhamento, certificando-se de que nenhuma bolha permaneça presa sob os poços. Use a solução de poliacrilamida restante para acompanhar o progresso da reação de polimerização. Quando a reação estiver completa, remova suavemente o pente e a fita da parte de trás do de gel.Para começar, dissolva amostras no tampão de amostra de zimografia convencional. Adicione 400 mililitros os 1X tris glycene SDS executando buffer ao aparelho de gel. Carregue até 35 microliters de amostra por poço.Execute as amostras a 120 volts a quatro graus Celsius por uma hora e meia ou até que os padrões de peso molecular indiquem que os proteases de interesse estão dentro da camada de gel que resolve o peptídeo. Depois disso, remova os géis do de plástico. Lave os géis três vezes em tampão de re-naturing à temperatura ambiente sob agitação suave.A cada lavagem, com duração de 10 minutos. Transfira os géis para uma solução tampão em desenvolvimento por 15 minutos. Em seguida, substitua a solução por um novo tampão em desenvolvimento e incubar a 37 graus Celsius sob suave agitação por 24 horas.Depois disso, use um imager de scanner de gel fluorescente com os filtros de excitação e emissão apropriados para a imagem dos géis. Neste estudo, peptídeos fluorescentes são incorporados em géis de poliacrilamida. QGIW é uma sequência derivada de colágeno projetada para detectar colagem celular, enquanto LACW é uma sequência que foi otimizada para a detecção de MMP-14 e MMP-11.Imagens fluorescentes revelam numerosas bandas dentro dos géis de peptídeos LACW, enquanto apenas uma única banda é vista nos géis QGIW. Quando comparados à zymografia de gelatina, os géis LACW são capazes de detectar bandas mais proteolíticas, o que demonstra a capacidade da zymografia de peptídeos de detectar uma gama mais ampla de proteases presentes dentro de amostras biológicas do que os métodos tradicionais usando substratos nativos. As células de zymografia de peptídeos são então incubadas em tampão de desenvolvimento contendo GM6001, um inibidor de MMP de amplo espectro, ou E64, um inibidor geral de catepsina.O tratamento dos géis de peptídeo LACW com GM6001, diminui a intensidade das bandas. Enquanto o tratamento com E64 não tem efeito perceptível. O tratamento dos géis de peptídeos QGIQ com GM6001 resulta em ablação completa das bandas vistas anteriormente.Enquanto o E64 não tem efeito. A zymografia de gelatina é conduzida utilizando MMP-9 purificado e ativado para comparar a sensibilidade da zymografia de peptídeo com o padrão-ouro atual. Os géis LACW são capazes de detectar as menores concentrações de MMP-9.As proteases requerem condições específicas para re-natureza e se tornam ativadas. Prepare cuidadosamente as soluções de buffer para garantir que a composição e o PH estejam corretos. Este método pode ser complementado por técnicas existentes para verificar a identidade e realizar uma análise mais aprofundada das proteases medidas.Isso inclui manchas ocidentais, PCR em tempo real e espectrometria de massa. Tenha cuidado ao manusear poliacrilamida. A solução não despolmerizada é considerada uma neurotoxina potente e equipamentos de proteção individual adequados devem ser sempre usados ao manuseá-la.

detection-of-protease-activity-by-fluorescent-peptide-zymography

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

O Kit de Detecção de Protease fluorescente é projetado para a medição da atividade da protease usando fluorometria. Também é adequado para a detecção de vestígios de contaminação protease. O método é baseado no hydroysis proteolítica de uma formulação de um substrato de caseína FITC-rotulados.

Uso do Kit de Detecção de Protease Fluorescente para determinar a atividade de protease

Este protocolo descreve um ensaio baseado em atividades para a detecção de metaloproteinases de matriz em sobrenadante de cultura ou fluidos corporais.

Detecção de Metaloproteinases da Matriz Funcional por zimografia

Neste vídeo, realizamos zimografia, uma técnica eletroforética, para analisar a atividade proteolítica em amostras biológicas.

Zimografia de peptídeos fluorescentes: uma técnica modificada para detectar a atividade da protease usando substratos fluorogênicos em géis de zimograma

Este vídeo demonstra a técnica de eletroforese em gel de zimografia para avaliar a atividade das metaloproteinases da matriz (MMPs) presentes no sobrenadante da cultura de células. As MMPs ativas degradam o substrato específico da MMP incorporado em um gel de poliacrilamida, que aparece como faixas transparentes contra um fundo manchado escuro após a coloração.

Eletroforese em gel com zimografia: uma técnica eletroforética para detectar metaloproteinases da matriz avaliando a atividade enzimática

Este vídeo demonstra um ensaio para rastrear a atividade proteolítica de proteases usando peptídeos fluorogênicos. A protease reconhece seu local de clivagem no peptídeo, clivando-o e separando o supressor do fluoróforo, permitindo sua emissão de fluorescência. O sinal de fluorescência é detectado e analisado para verificar a eficiência de clivagem de diferentes variantes de peptídeos.

Um ensaio de clivagem de peptídeos fluorogênicos para rastrear a atividade proteolítica de proteases

Descrevemos um ensaio colorimétrico simples e quantitativo que mede especificamente a atividade proteolítica da Granzyme B (GzmB) humana, de camundongo ou de rato. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para determinar a atividade da protease de outras proteases de serina de grânulos pela hidrólise de outros substratos peptídicos sintéticos com uma sequência de reconhecimento apropriada.

Um ensaio colorimétrico que mede Especificamente granzima B Actividade proteolítica: Hidrólise de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a orientação e topologia de proteínas integrais de membrana em células vivas. Este protocolo simples baseia-se na sensibilidade seletiva da protease das quimeras entre a proteína de interesse e a GFP.

Determinando Membrane Topology Protein Usando Fluorescência Protease Protection (FPP)

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a especificidade da protease no tecido cru rato extratos usando espectrometria de MALDI-TOF.

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Aqui, apresentamos o procedimento detalhado de uma plataforma de ensaio de protease recentemente desenvolvido utilizando o N-terminal hexahistidine/maltose-proteína e fluorescentes substratos recombinantes da proteína-fundido, anexados à superfície do níquel-nitrilotriacético grânulos de agarose magnético ácido. Também é apresentada uma análise subsequente em-gel das amostras de ensaio separados por eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio.

Utilização de proteínas recombinantes de fusão em uma plataforma de ensaio de Protease fluorescente e sua renaturalização em-gel

Apresentamos um ensaio de clivagem de peptídeo de fluorogenic que permite uma análise rápida da atividade proteolítica de proteases em peptídeos que representa o local de clivagem de peptídeos de fusão viral. Esse método também pode ser usado em qualquer outro motivo de aminoácido dentro de uma sequência da proteína para testar a atividade da protease.

Um ensaio de clivagem de peptídeo Fluorogenic para triagem de atividade proteolítica: aplicações para coronavirus spike ativação de proteína

As proteinases são vitais para a patogênese bacteriana, permitindo a invasão e a evasão imunológica. A extração em uma única etapa de proteínas citoplasmáticas e de membrana de bactérias em sua forma ativa é angustiante. Este artigo em vídeo demonstra a extração de proteínas celulares inteiras de Leptospira para análise de zimografia para detectar e caracterizar gelatinases.

Extração em uma etapa e análise zimográfica de gelatinases bacterianas

Aprenda a técnica de zimografia com peptídeos fluorescentes para detecção de proteases em amostras biológicas. Este método modular permite personalizar sequências de peptídeos para identificar diferentes proteases em estudos de biomateriais.

Deteção da atividade de Protease por zimografia peptídeo fluorescente

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