Name: Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda ensaios in vitro para avaliar migração, invasão e proliferação de células trofoblásticas humanas imortalizadas. Estes métodos fornecem análise visual e quantitativa de fatores que influenciam a invasão trofoblástica.

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Os autores agradecer Dr. Gil Mor para fornecer as células Sw.71. Esta pesquisa foi apoiada por um Albert McKern Scholar Award para S.W.

1. preparação da pilha
<ol><li>Manter as células em frascos de T-75 em meios de crescimento padrão em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade. Nota: As células utilizadas nesses experimentos foram o imortalizado linhas de células do trofoblasto primeiro trimestre Swan.71 (Sw.71) e HTR-8/SVneo9,10. As células de Sw.71 foram mantidas em DMEM/F-12, suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS), piruvato de sódio 1,0 mM, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM não aminoácidos essenciais, 100 unidades/mL penicilina e 100 estreptomicina µ g/mL. As HTR-8/SVneo células foram mantidas em RPMI-1640 suplementado com 5% inactivadas pelo calor FBS.</li>
	<li>Permitir que as células replicar até atingirem a confluência de 90-100%. Usando um capuz de fluxo de cultura de tecidos estéreis, Aspire os meios de comunicação de pilhas do balão e lavagem com 10 mL de estéril 1x tampão fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Aspire a PBS e adicionar 5 mL de 1x (0.05%) tripsina-EDTA para o balão, certificando-se que as células estão cobertas por tripsina. Coloque o frasco na incubadora laboratório mantida a 37 ° C, umidade de 95% e 5% CO2até que todas as células têm destacado do fundo do frasco (aproximadamente 5-10 min).</li>
	<li>Adicione 10 mL de mídia de crescimento previamente aquecido no balão para desativar o tripsina-EDTA.</li>
</ol>2. Raspe ensaio
<ol><li>A seguir passo 1.4, semente o número adequado de células em uma placa de 24 para alcançar a confluência de 100% em 48 h. Nota: É possível realizar o ensaio de risco com uma variedade de layouts de placa diferente. O número máximo de permitido pela ferramenta criador de ferida de poços é um formato de 96 poços.</li>
	<li>No dia seguinte (dia antes do ensaio zero), mudar de mídia para mídia livre-vermelho de fenol complementada, se necessário, incluindo inactivados por calor, carvão FBS dextran-despojado. Nota: Outros estudos têm recomendado o uso de mídia com baixa concentração FBS (por exemplo, 1%) para minimizar a proliferação celular, que pode ser usada como uma alternativa no presente protocolo11.</li>
	<li>No dia do ensaio do zero, pré-tratamento células por 30 min, adicionando o tratamento desejado para a mídia em cada poço. As experiências descritas utilizaram veículo (1X PBS) e 100 nM dexametasona, que diluído em 1X PBS.</li>
	<li>
Para criar feridas uniformes, coloque estéril 10 pontas de pipetas µ l nos pinos da ferramenta do fabricante a ferida. Abaixar as dicas para a primeira linha de poços e mova a placa ao longo da trilha do maker ferida até que as pontas de pipeta chegar ao outro lado do poço.
	<ol>
<li>Mova a placa de volta para a posição inicial, permitindo que as pontas de pipeta continuamente tocar o fundo do prato para garantir uma constante ferida através do diâmetro do poço. Remover e substituir as pontas de pipeta estéril 10 µ l e abaixar as pontas para a próxima linha de poços.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita a etapa 2.4 até que todos os poços estão arranhados. Nota: Se não houver uma ferramenta de fabricante de ferida, feridas podem ser criadas manualmente raspando o centro dos poços com uma ponta de pipeta de 10 µ l.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente com mídia e lave suavemente células duas vezes com 1X PBS. Após uma lavagem final, adicione complementado-vermelho de fenol livre, despojado ou baixa-FBS mídia com tratamento desejado ou veículo (conforme indicado no passo 2.3). Nota: HTR-8/SVneo células devem ser lavadas com mídia de vermelho de fenol completadas, como lavar com 1X PBS fará com que as células desanexar.</li>
	<li>Coloque a placa de 24 poços riscados contendo no tonalizador automatizado, lapso de tempo (veja a Tabela de materiais) alojados numa incubadora laboratório mantida a 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade. Poços de imagem a intervalos regulares, conforme necessário para permitir que as células completar a cicatrização de feridas (por exemplo, cada 2h para 72 h).</li>
	<li>Calcular a densidade de ferida e largura pelo software associado com o tonalizador automatizado, lapso de tempo (veja a Tabela de materiais). Para calcular o tamanho da ferida em relação ao tamanho do ferimento inicial de variação percentual, defina a largura de ferida ao tempo 0 igual a 100%. Divida o tamanho da ferida em cada commit subsequente pelo tamanho do ferimento no tempo 0 e multiplicar por 100 para obter o percentual (Figura 1).</li>
</ol>3. invasão ensaio
<ol><li>Etapa seguinte 1.4, semente o número adequado de células em placas de 6 boas para permitir que as células alcançar a confluência de 90% em 48 h. manter as células em uma incubadora de laboratório conjunto para 37 ° C, umidade de 95% e 5% CO2.</li>
	<li>No dia seguinte, mude de mídia para mídia livre-vermelho de fenol complementada, se necessário, incluindo inactivados por calor, carvão FBS dextran-despojado. Nota: As células podem ser pré-tratados neste momento dependendo do delineamento experimental.</li>
	<li>Neste momento, coloque o frasco da matriz extracelular de 10 mg/mL (ver Tabela de materiais) em gelo e deixe-a descongelar no frigorífico durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, ensaio pre-cool invasão fontes colocando placas de 24 poços, cultura de célula insere, microcentrifuga tubos e pontas de pipetas no frigorífico (4 ° C) pelo menos 2 h antes de trabalhar com a matriz extracelular.</li>
	<li>Uso de fontes de refrigerados do capuz de cultura de tecidos, matriz extracelular de 10 mg/mL diluído 1:1 com mídia fenol-vermelho-livre, livre de soro a uma concentração final de 5 mg/mL. Nota: Sempre manter o estoque e a matriz extracelular diluída no gelo. A relação da matriz extracelular, a mídia pode ser ajustada com base nas propriedades da linha celular utilizada no ensaio.</li>
	<li>Uso de fontes de refrigerados do capuz de cultura de tecidos, adicione 100 μL de matriz extracelular diluída para as inserções (ver Tabela de materiais) que tenham sido colocadas na placa de 24. Certifique-se que a matriz é nível sem quaisquer bolhas. Coloque a placa de 24 poços contendo inserções matriz revestidos em incubação a 37 ° C, para permitir que a matriz a endurecer.</li>
	<li>Para preparar células para o ensaio da invasão, lavam-se células com 1 mL de 1X PBS, Aspire a PBS e adicione 500 µ l de tripsina-EDTA de 1x a cada poço. Coloque a placa de 6 na incubadora laboratório mantida a 37 ° C, umidade de 95% e 5% CO2até que todas as células têm destacado da parte inferior da placa.</li>
	<li>Uma vez que as células têm destacado, adicione 500 µ l de mídia fenol-vermelho-livre, livre de soro a cada poço das células trypsinized.</li>
	<li>Transferência de 1.000 µ l de células desanexadas microcentrifuga tubo e spin-down por 5 min a 400 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Aspirar a mídia e ressuspender as células em mídia fenol-vermelho-livre, sem soro (volume dependerá concentração de células). Contagem de células usando uma célula automatizada counter (consulte Tabela de materiais) e ajustar o volume da suspensão de células para uma concentração final de 5 x 105 células por mL. Nota: Um hemocytometer e microscópio também podem ser usados para contar as células.</li>
	<li>Adicione 600 μL de mídia completo crescimento aos poços da placa de 24 poços que será usado para o ensaio de invasão. Nota: Quimioatraentes adicionais ou tratamentos podem ser adicionados ao meio de crescimento completo no poço (câmara baixa). As experiências descritas adicionado veículo (1X PBS) ou 100 dexametasona nM, diluído em 1X PBS para a câmara baixa.</li>
	<li>Lugar do pré-revestida inserir em cada poço contendo meio de cultura completo que será usado para o ensaio de invasão. Em seguida, adicione 200 μL de células no topo de cada inserção de célula pré-revestidos (câmara superior) para um total de 1 x 105 células. Nota: Como um controle negativo para este ensaio, um volume igual de mídia fenol-vermelho-livre, livre de soro (sem pilhas) pode ser adicionado para a câmara superior.</li>
	<li>Coloque a placa de 24 na incubadora laboratório mantida a 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade por 24 h. Nota: O período de incubação de 24 h foi otimizado para as células do trofoblasto imortalizado do primeiro trimestre e ainda mais testes podem ser necessária para determinar o período de incubação necessário em outras linhas de célula.</li>
	<li>Após incubação durante a noite, sucção os restantes meios de comunicação da câmara superior e inferior sem perturbar a matriz extracelular. Em seguida, Retire cuidadosamente a matriz extracelular e células não-invadida de parte superior da inserção com um cotonete de algodão, esfregar-se tantas vezes quanto necessário para remover a matriz extracelular.</li>
	<li>Lavagem de cada inserir 3x com PBS 1x, adicionando PBS para ambas as câmaras superiores e inferiores do poço. Aspire PBS depois de cada lavagem.</li>
	<li>Consertar as células anexadas para as inserções, colocando inserções em 100% de metanol gelada por 30 min a 4 ° C. Lavagem insere 3x com 1X PBS e PBS remover depois de lavar o final. Manche as células anexadas para as inserções por 10 min com violeta de cristal de 0,2% em etanol a 20%.</li>
	<li>Lavar 3x com água desionizada e aspirar água desionizada após a lavagem final.</li>
	<li>Secar ao ar inserções por 1h à temperatura ambiente. Usando fórceps e uma lâmina de barbear, cuidadosamente, corte a membrana da parte inferior da inserção e montar sobre uma lâmina de vidro com o lado inferior voltada para cima. Permitir que a mídia de montagem secar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Obter pelo menos 4 imagens únicas de células invadidas por amostra, usando um microscópio de luz com um objectivo de 20 x. Conte o número total de células em cada imagem e normalizar o número de células para amostras de controlo e plotar dados (Figura 2).</li>
</ol>4. proliferação ensaio
<ol><li>Passo seguinte 1.4, contar as células trypsinized do recipiente usando um contador de célula automatizada e sementes em placas de 6-poços em uma densidade de 2 x 105 células por poço em mídia padrão de crescimento.</li>
	<li>Colocar as células em uma incubadora de laboratório mantida a 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade por 4 h ou até células aderiram.</li>
	<li>Mídia de mudança para o vermelho de fenol mídia completada, se necessário, incluindo inactivados por calor, carvão dextran-despojado FBS livre e adiciona tratamento desejado. As experiências descritas adicionado veículo (1X PBS) ou 100 dexametasona nM, diluído em 1X PBS. Coloca as placas 6-poços em uma incubadora de laboratório mantida a 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade.</li>
	<li>Remova a mídia e substitua com tratamento e novas mídias cada 48 h.</li>
	<li>Após 24, 48 ou 72 h tratamento, as células com 1 mL de 1X PBS de lavagem e adicionar 500 µ l de tripsina-EDTA para cada poço. Coloque placa de 6 na incubadora até células tem separada da placa.</li>
	<li>Uma vez que as células têm retirado a placa, adicione 500 µ l da mídia livre de vermelho de fenol complementada para desactivar a tripsina.</li>
	<li>Adicionar 5 µ l de células trypsinized a 5 µ l de Trypan azul em um tubo separado e misture por pipetagem.</li>
	<li>Contar as células de cada poço em duplicado usando um contador automatizado de células.</li>
	<li>Média do número de células por poço em cada ponto do tempo e a trama em função do tempo (Figura 3).</li>
</ol>

<ol><li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+trophoblast+cell+differentiation%3A+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li>
<li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester%3A+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li>
<li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+implantation+and+placentation%3A+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li>
<li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li>
<li>Knöfler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li>
<li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8%2FSVneo+Trophoblast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li>
<li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li>
<li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+%28MMP%29-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li>
<li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line%2C+Swan+71%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li>
<li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974(2018).</li>
<li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen%3A+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este procedimento baseia-se na utilização de migração e invasão ensaios para incluir a taxa de proliferação celular, como um contribuinte potencial medidos diferenças no movimento de células do trofoblasto. Usados em conjunto, estes ensaios in vitro são métodos simples e eficazes que podem ser usados para identificar os caminhos celulares que regulam a migração do trofoblasto. Conforme descrito acima, as células do trofoblasto podem ser tratadas com hormonas, citocinas, fatores de crescimento ou outras moléculas para det...

Desenvolvimento da placenta é um passo crucial no estabelecimento da gravidez, impactando a saúde materna e fetal. No entanto, a base mecanicista, pelo qual este processo ocorre não é totalmente compreendida. Migração celular é um importante processo biológico que contribui para a criação e funções da placenta durante a gravidez. Após a implantação do blastocisto, a trofectoderma diferencia em trophoblasts das vilosidades, que cobrem a superfície das vilosidades coriônica e estão envolvidos em gás e troca de nutrientes, e extravillous trophoblasts (eventos), que migram para fora das vilosidades e invadem a decídua e a vasculatura materna1. Migração dos eventos é essencial para a remodelação artérias espiral materna e o estabelecimento de circulação uteroplacentária para apoiar o crescimento fetal2. Invasão do trofoblasto inadequada durante a gravidez, resulta em um desenvolvimento anormal da placenta e pode contribuir para complicações da gravidez como pré-eclâmpsia, hipertensão gestacional, restrição de crescimento intra-uterino e parto prematuro3, 4. Portanto, compreender os fatores que afetam a motilidade do trofoblasto é essencial para determinar os caminhos necessários para placentação normal.
Migração do trofoblasto é controlada por uma complexa rede de sinalização moléculas, incluindo fatores de crescimento, citocinas, hormônios e fatores de angiogênico5. Devido às limitações do estudo in vivo da placenta, ensaios in vitro utilizando imortalizadas células do trofoblasto humano linhas foram cruciais para a identificação dos factores que contribuem para a mobilidade do trofoblasto. Zero e invasão de ensaios têm sido amplamente utilizados para avaliar quantitativamente o papel das moléculas individuais no trofoblasto celular migração6,7,8. No entanto, embora útil em tandem para investigar como mudanças na migração podem ser causadas por alterações na capacidade de invasão celular, estes dois ensaios não representam mecanismos adicionais que podem contribuir para as taxas alteradas de migração celular. Por exemplo, reduções para a taxa de proliferação celular podem resultar em menos células disponíveis para migrar.
Aqui, descrevemos quantitativos métodos in vitro para avaliar a migração do trofoblasto usando zero, proliferação celular e ensaios de invasão celular. No ensaio de zero, uma ferida uniforme é criada em uma monocamada de células, e a migração de células para preencher a lacuna é medida pela imagem automatizada, lapso de tempo do tamanho da ferida e densidade de células dentro da ferida. O ensaio de proliferação celular é baseado no cálculo do rácio de células em cada ponto de tempo em comparação com uma quantidade conhecida de partida de células. No ensaio de invasão celular, células são semeadas no topo de uma câmara de inserção de cultura celular revestido de matriz extracelular (por exemplo, Transwell), e o número de células que invadem através da matriz extracelular em resposta a quimioterapia-attractant é contado.
O risco é uma ferramenta simples e eficaz que pode ser usada para determinar como diferentes condições ambientais afetam a migração celular. Os ensaios de proliferação e invasão posteriormente podem ser usados para determinar a contribuição da proliferação celular e invasividade para mudanças globais na migração celular. Coletivamente, estes ensaios fornecem medidas robustas de processos biológicos que podem contribuir para a motilidade celular. Duas linhas de célula imortalizado primeiro trimestre trofoblasto foram utilizadas nos ensaios descritos, Swan.71 (Sw.71) e HTR-8/SVneo9,10. No entanto, estes ensaios também podem ser otimizados para uso em outros tipos de células para identificar a chaves moduladores de migração celular e invasão.

<table><tbody><tr><td>0,4% de mancha azul de tripano</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>0,5% de tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB06021-00100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Aminoácidos não essenciais MEM</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>100 mM piruvato de sódio</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de transwell de placa de 24 poços</td><td>Corning</td><td>3422</td><td>Contêm filtros de policarbonato com um 8 &mu; m tamanho dos poros</td></tr><tr><td>Carvão dextrano FBS</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-119</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado Countess II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cristal Violeta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona (Dex; 1, 4-pregnadien-9&alpha;-fluoro-16&alpha;-metil-11&beta;, 17, 21-triol-3, 20-diona; &ge; 98% TLC)</td> <td>Esteralóides</td><td>P0500-000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / Presunto ' s F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Placas ImageLock de 24 poços</td><td>Essen BioScience</td><td>4365</td><td>Se estiver usando o sistema de imagem IncuCyte Zoom, semeie as células nas placas IncuCyte ImageLock. Essas placas têm marcadores fiduciais na parte inferior da placa que são usados como referência para imagens repetidas em um campo de visão constante.</td></tr><tr><td>Software IncuCyte</td><td>Essen BioScience</td><td>2010A Rev2</td><td></td></tr><tr><td>Sistema IncuCyte ZOOM Essen</td><td>BioScience</td><td>N/A</td><td>As imagens do ensaio Scratch foram capturadas e analisadas usando a predefinição " Ferida de arranhão" parâmetros no sistema IncuCyte ZOOM. Outros microscópios de lapso de tempo também podem ser usados.</td></tr><tr><td>Matriz de Membrana Matrigel</td><td>Becton Dickinson</td><td>356231</td><td>Fator de crescimento reduzido, livre de vermelho de fenol</td></tr><tr><td>Micro Slides</td><td>VWR International, LLC</td><td>48311-7003</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura do microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido Olympus IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina (10.000 unidades/mL)/estreptomicina (10.000 &micro; g / mL)</td> <td>Life Technologies</td><td>151-40-122</td><td></td></tr><tr><td>Sem fenol vermelho DMEM / Ham's F12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta semiautomática para fabricação de feridas</td><td>Essen BioScience</td><td>N / A</td><td></td></tr></tbody></table>

em vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Movimento de célula é uma propriedade crítica de trophoblasts durante o desenvolvimento da placenta e gravidez precoce. O significado do trofoblasto adequada migração e invasão é demonstrado por distúrbios da gravidez, tais como restrição de crescimento intra-uterino e de pré-eclâmpsia, que são associados com a invasão do trofoblasto inadequada da vasculatura materna. Infelizmente, nossa compreensão dos mecanismos por que a placenta se desenvolve a partir de migração de trophoblasts é limitado. Análise in vitro da migração celular através de ensaio de risco é uma ferramenta útil na identificação de fatores que regulam a capacidade migratória trofoblasto. No entanto, este ensaio sozinho não define as alterações celulares que podem resultar em migração de célula alterada. Este protocolo descreve três diferentes ensaios in vitro são usados coletivamente para avaliar o movimento de células do trofoblasto: o risco do ensaio, o ensaio de invasão e o ensaio de proliferação. Os protocolos descritos aqui também podem ser modificados para uso em outras linhas de célula para quantificar o movimento de célula em resposta a estímulos. Estes métodos permitem que os investigadores identificar fatores individuais que contribuem para o movimento da célula e fornecem uma análise exaustiva dos potenciais mecanismos subjacentes alterações aparentes na migração celular.

As linhas de célula humana imortalizado primeiro trimestre trofoblasto Sw.71 e HTR-8/SVneo foram utilizadas nesses experimentos para determinar o papel de glicocorticoides no trofoblasto celular migração12. Os glicocorticoides foram utilizados nesses experimentos como eles recentemente foram mostrados para alterar funções de trofoblasto, embora tratamentos alternativos podem ser usados12. Ambas as linhas de célula foram tratadas com veículo ...

Aqui, apresentamos um protocolo altamente acessível para avaliar o movimento de célula em células do trofoblasto humana usando três ensaios in vitro: ensaio de zero, o ensaio de invasão transwell e o ensaio de proliferação celular.

Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Esses métodos podem ser utilizados para determinar fatores que influenciam a invasão do trophoblasto que pode fornecer insights sobre os principais desfechos obstétricos adversos. A vantagem dessa técnica é que ela fornece uma análise visual e quantitativa de vários fatores que podem influenciar a invasão do trophoblasto, incluindo a proliferação e a migração. Para iniciar o ensaio de arranhões, semear o número apropriado de células em uma placa de 24 poços para alcançar 100% de confluência em 48 horas.No dia seguinte, mude a mídia para fenol red free media complementada com calor inativado carvão dextran despojado FBS. No dia do arranhão, adicione o tratamento desejado à mídia em cada poço para pré-trar as células por 30 minutos. Para criar feridas uniformes, coloque as pontas de pipeta de 10 microliter estéreis nos pinos da ferramenta fabricante de feridas.Abaixe as pontas para a primeira linha de poços e mova a placa ao longo da pista do fabricante da ferida até que as pontas da pipeta cheguem ao outro lado do poço. Em seguida, mova a placa de volta para a posição inicial para garantir a ferida constante através do diâmetro do poço. Abaixe as pontas para a próxima linha de poços e repita até que todos os poços estejam riscados.Confirme se o arranhão cobre a largura do poço observando a placa sob um microscópio. Em seguida, aspire cuidadosamente a mídia e lave suavemente as células com 1x PBS duas vezes. Após uma lavagem final, adicione fenol vermelho complementado livre de strip ou baixa mídia FBS com um tratamento desejado.Em seguida, coloque a placa com os poços riscados em um imager timelapse automatizado alojado em uma incubadora que contém 37 graus Celsius de temperatura e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade. Imagem das células em intervalos regulares, conforme necessário, para permitir que as células completem a cicatrização da ferida. Para iniciar o ensaio de invasão, semeou o número apropriado de células em placas de seis poços em uma incubadora que mantém 37 graus Celsius de temperatura e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade.Permitir que as células atinjam 90% de confluência em 48 horas. No dia seguinte, mude a mídia para fenol red free media complementada com calor inativado carvão dextran despojado FBS. Coloque um frasco de 10 miligramas por matriz extracelular mililitro em uma geladeira no gelo e deixe descongelar durante a noite.No dia seguinte, use pontas de pipeta geladas para diluir 10 miligramas por mililitro da matriz extracelular com a mídia livre de soro vermelho fenol para uma concentração final de cinco miligramas por mililitro. Em seguida, adicione 100 mililitros da matriz extracelular diluída às pastilhas resfriadas que foram colocadas na placa de 24 poços refrigerados. Incubar a placa a 37 graus Celsius para permitir que a matriz endureça.Para preparar células para o ensaio de invasão, lave as células com um mililitro de 1x PBS. Em seguida, aspire o PBS e adicione 500 microliters de 1x Trypsin EDTA a cada poço. Coloque a placa de seis poços na incubadora que mantém 37 graus Celsius de temperatura e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade até que todas as células tenham se separado da parte inferior da placa.Uma vez que as células tenham se destacado, adicione 500 microliters da mídia livre de soro vermelho fenol a cada poço das células experimentadas. Em seguida, transfira 1.000 microliters de células separadas para um tubo de microcentrífuga e gire por cinco minutos a 400 vezes g a quatro graus Celsius. Em seguida, aspire a mídia e resuspend as células na mídia livre de soro vermelho fenol.Conte as células usando um contador celular automatizado e ajuste o volume da suspensão celular para uma concentração final de 0,5 milhões de células por mililitro. Adicione 600 microliters da mídia de crescimento completo a cada poço da placa de 24 poços e coloque a inserção pré-revestida nele. Em seguida, adicione 200 microliters de células em cima de cada inserção celular pré-revestida para um total de 0,1 milhões de células.Coloque a placa de 24 poços na incubadora que mantém temperatura de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade por 24 horas. Após a incubação durante a noite, sucção a mídia restante das câmaras superior e inferior sem perturbar a matriz extracelular. Em seguida, remova cuidadosamente a matriz extracelular e as células não invadidas da porção superior das pastilhas com um cotonete.Lave cada inserção três vezes adicionando 1x PBS às câmaras superior e inferior do poço. Aspirar PBS após cada lavagem. Para fixar as células presas às pastilhas, coloque as pastilhas em metanol frio 100% gelado a quatro graus Celsius por 30 minutos.A lavagem insere três vezes com 1x PBS e remova o PBS após a lavagem final. Colorir as células presas às pastilhas com violeta 0,2% cristalina em 20% de etanol por 10 minutos. Enxágüe com água deionizada três vezes e aspirar água deionizada após a lavagem final.O ar seco se insere à temperatura ambiente por uma hora. Finalmente usando fórceps e uma lâmina de barbear, corte cuidadosamente a membrana inferior da inserção e monte-a em uma lâmina de vidro com o lado inferior voltado para cima. Usando um microscópio leve com um objetivo de 20X, obtenha pelo menos quatro imagens únicas das células invadidas por amostra.Para iniciar o ensaio de proliferação, use um contador automatizado de células para contar as células experimentadas do frasco. Células de sementes em placas de seis poços a uma densidade de 0,2 milhões de células por poço em mídia de crescimento padrão. Em seguida, coloque as células na incubadora que mantém 37 graus Celsius de temperatura e 5% de dióxido de carbono em atmosfera de 95% de umidade por quatro horas ou até que as células tenham aderido.Em seguida, mude a mídia para fenol red free free complementada com o dextran de carvão inativado de calor e tratamento desejado. Coloque a placa de seis poços na incubadora que mantém temperatura de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono a 95% da atmosfera de umidade. Em seguida, substitua a mídia pela mídia fresca complementada com o tratamento desejado a cada 48 horas.Após 24, 48 ou 72 horas de tratamento, lave as células com um mililitro de 1x PBS e adicione 500 microliters de Trypsin EDTA a cada poço. Coloque uma placa de seis poços na incubadora até que as células se despem da placa. Uma vez que as células tenham se separado da placa, adicione 500 microliters da mídia livre de fenol complementado para desativar a Trippsina.Finalmente adicione cinco microliters das células experimentadas a cinco microliters de Trypan Blue em um tubo separado e misture por pipetação. Use um contador automatizado de células para contar células de cada poço em duplicata. Imortalizado humano no primeiro trimestre trophoblast Cisne.Foram tratadas 71 células durante zero, oito e 18 horas com veículo 1x PBS ou 100 micromolar da dexametasona glicocorticoide sintética no ensaio de arranhões. Medição do tamanho da ferida e da densidade da ferida em Cisne. 71 e células HTR-8/SVneo tratadas com veículo ou 100 dex nanomolar mostraram que o tratamento dex reduziu a taxa de fechamento da ferida indicando que glicocorticoides poderiam inibir a migração celular.Após o ensaio de invasão, o tratamento glicocorticoide reduziu a invasividade celular, como mostra uma redução de 15% no número de cisnes invadidos. 71 e células HTR-8/SVneo tratadas com 100 dex nanomolar por 24 horas em comparação com células tratadas com veículo. Após o ensaio de proliferação celular, o tratamento glicocorticoide reduziu a proliferação celular, como indicado por menos Cisne.71 e células HTR-8/SVneo tratadas com 100 dex nanomolar em comparação com células tratadas com veículo. Métodos para avaliar a morte celular poderiam ser usados em conjunto com este procedimento para determinar se apoptose ou necrose contribuem para funções de trophoblasto alteradas. Adotamos exclusivamente o uso de técnicas padrão rotineiramente utilizadas na biologia do câncer para o estudo da função trophoblast.Não há riscos associados a esses métodos. A única precaução que os espectadores devem tomar é usar técnica estéril para cultura tecidual.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste protocolo, descreve-se a dissecção de placenta de rato sobre a gravidez d10.5, seguido de isolamento das células trofoblásticas, utilizando um gradiente de Percoll. Em seguida, demonstrar o uso de células isoladas, num ensaio de invasão de Matrigel.

Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

Tradicionais, duas técnicas de cultura de células dimensional muitas vezes resultam em características alteradas com relação a marcadores de diferenciação, citocinas e fatores de crescimento. Tridimensional de cultura de células no sistema de rotação de cultura de células (CCRs) restabelece a expressão de muitos destes fatores, como mostrado aqui com uma linha extravilosas trofoblasto celular.

Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

Comumente usado, são descritos métodos altamente acessíveis para analisar a migração celular e invasão in vitro. O primeiro método é o ensaio de encerramento de feridas de células que mede a mobilidade celular. O segundo método é o ensaio de migração e invasão transwell que avalia o quimiotáctica e capacidade invasiva de células.

Na migração celular in vitro e invasão Ensaios

Este protocolo descreve um método para eficazmente transfectar siARN em citotrofoblastos vilosidades humanos isolados de fresco utilizando formação de microporos e identificação de complexos de ADN-proteína nestas células. As células transfectadas pode ser monitorado por análises Western blot e EMSA durante o tempo de cultura de 4 dias.

As análises siRNA transfecção e EMSA sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos Humanos

Este manuscrito apresenta um modelo in vitro único de células citotrofoblásticas vilosas humanas imunopurificadas cultivadas sob hipóxia/reoxigenação. Este modelo é adequado para estudar os efeitos protetores de tratamentos promissores, como a melatonina, nas complicações da gravidez associadas ao aumento do estresse oxidativo e à alteração da função placentária.

Trophoblast primário humano Cultura celular modelo para estudar os efeitos protetores da melatonina contra a hipóxia / Disruption induzida pela reoxigenação

Aqui apresentamos um protocolo para a conversão direta de fibroblastos embrionários murinos em células-tronco trofoblásticas totalmente funcionais e estáveis por meio da superexpressão de dez dias de Tfap2c, Gata3, Eomes e Ets2.

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando proteína morfogênica óssea 4 e inibidores das vias Activina/Nodal. Este método é adequado para a diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas e pode gerar grandes quantidades de células para manipulação genética.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

Apresentado aqui é um protocolo para amostragem de tecido placentário humano das vilosidades seguido pelo isolamento de cytotrophoblasts para cultura de células primárias. Tratamento de trophoblasts com TNFa recapitula a inflamação no ambiente intra-uterino obeso e facilita a descoberta de alvos moleculares regulada pela inflamação na placenta com obesidade materna.

Um modelo de trofoblasto humano primário para estudar o efeito da inflamação associada com obesidade materna no Regulamento de autofagia na Placenta

Aqui, descrevemos um método para aquecer blastocistos humanos vitrificados, culminando-os através do período de implantação in vitro, digerindo-os em células únicas e coletando células trophoblastas precoces para uma investigação mais aprofundada.

Coleção celular única de células trophoblastos em embriões humanos de estágio de peri-implantação

O presente protocolo permite a recuperação de estruturas semelhantes a tubos formadas no ensaio clássico de formação de tubos de angiogênese in vitro , onde células, como células trofoblásticas, se organizam em estruturas semelhantes a capilares sobre uma camada de matriz de membrana basal extracelular. As estruturas recuperadas são usadas para isolamento de RNA e proteínas para várias análises bioquímicas.

Recuperação de células trofoblásticas do ensaio de formação de tubos de angiogênese para análise de expressão de marcadores de diferenciação

Esse protocolo permite a purificação, caracterização e cultivo de trofoblastos extravilosos primários HLA-G+ (EVT) a partir da decídua basal e da membrana coriônica das placentas humanas a termo. Culturas primárias de EVT mantêm a viabilidade por 96 horas, permitindo co-cultura com células imunes maternas comparadas por amostra e subsequente análise citométrica e molecular de fluxo de suas interações.

Purificação de Trofoblastos Extravillosos HLA-G+ de Tecidos Placentários Humanos para Fenotipagem e Análise Funcional

Aprenda ensaios in vitro para avaliar migração, invasão e proliferação de células trofoblásticas humanas imortalizadas. Estes métodos fornecem análise visual e quantitativa de fatores que influenciam a invasão trofoblástica.

Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto (Vídeo) | JoVE Journal

Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

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