Name: Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprenda a purificar e analisar anticorpos monoclonais de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado. Este método permite determinar atributos críticos de qualidade com volumes mínimos de amostra.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer a Scott lute pelo apoio analítico que ele forneceu. O financiamento interno parcial e o suporte para este trabalho são fornecidos pelo programa de caminho crítico CDER (CA #1-13). Este projeto é apoiado em parte por uma nomeação para o estágio/programa de participação de pesquisa no escritório de produtos de biotecnologia, E.U. alimentos e administração de drogas, administrado pelo Oak Ridge Institute for Science and Education através de um acordo interinstitucional entre o departamento de energia dos EUA e a FDA.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pharmaceutical+cGMPs+for+the+21st+Century%3A+A+Risk-Based+Approach%22">Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach</a>. , (2004).</li>
<li>New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm">https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm</a> (2015).</li>
<li>Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+Emergence+of+Therapeutic+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies.</a> Circulation. 127, 2222-2230 (2013).</li>
<li>Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+clone+selection+using+high-throughput+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Advances in clone selection using high-throughput bioreactors.</a> Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).</li>
<li>Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+structural+modifications+of+immunoglobulin+G+and+their+effect+on+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+%26+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity.</a> Analytical & Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).</li>
<li>Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roadmap+for+implementation+of+quality+by+design+%28QbD%29+for+biotechnology+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products.</a> Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).</li>
<li>International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ICH%22">ICH</a>. , ed specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products Q6B (1999).</li>
<li>Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+tools+for+characterizing+biopharmaceuticals+and+the+implications+for+biosimilars%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).</li>
<li>Velugula-Yellela, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+high-throughput+automated+microbioreactor+system+for+production+of+model+IgG1+in+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li>
<li>Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+liquid+chromatography-mass+spectrometry+methods+for+the+comprehensive+characterization+of+therapeutic+glycoproteins%2C+from+released+glycans+to+intact+protein+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).</li>
<li>Yang, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+correlation+between+charge+and+glycosylation+of+IgG1+variants+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).</li>
<li>Agarabi, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Process+Parameter+Screening+Utilizing+a+Plackett-Burman+Design+for+a+Model+Monoclonal+Antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).</li>
<li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Exclusion+Chromatography+with+On-Line+Light-Scattering%2C+Absorbance%2C+and+Refractive+Index+Detectors+for+Studying+Proteins+and+Their+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions.</a> Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).</li>
<li>Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+ranibizumab+%28Lucentis%29+or+bevacizumab+%28Avastin%29+with+dexamethasone+and+triamcinolone+acetonide%3A+An+in+vitro+stability+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).</li>
<li>Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+high-molecular-weight+nonnative+aggregates+and+aggregation+kinetics+by+size+exclusion+chromatography+with+inline+multi-angle+laser+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).</li>
<li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li>
<li>Han, H., Livingston, E., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+profiling+of+charge+heterogeneity+in+antibodies+by+microchip+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).</li>
<li>Wheeler, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microchip+zone+electrophoresis+for+high-throughput+analysis+of+monoclonal+antibody+charge+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants.</a> Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).</li>
<li>Carrillo-Cocom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+consumption+in+naive+and+recombinant+CHO+cell+cultures%3A+producers+of+a+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody.</a> Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).</li>
<li>Chen, P., Harcum, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+amino+acid+additions+on+ammonium+stressed+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells.</a> Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).</li>
<li>Xing, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+amino+acid+composition+of+CHO+cell+culture+media+for+a+fusion+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production.</a> Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+and+glucose+metabolism+in+fed-batch+CHO+cell+culture+affects+antibody+production+and+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).</li>
<li>Read, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermentanomics+informed+amino+acid+supplementation+of+an+antibody+producing+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture.</a> Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).</li>
<li>Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+A+chromatography+increases+monoclonal+antibody+aggregation+rate+during+subsequent+low+pH+virus+inactivation+hold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold.</a> Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).</li>
<li>Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+analysis+of+therapeutic+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Glycan analysis of therapeutic glycoproteins.</a> MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).</li>
<li>Wahl, O., Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+analysis+for+pharmacopoeial+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes.</a> Talanta. 154, 150-163 (2016).</li>
<li>Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+sensitive+method+for+quantitative+analysis+of+underivatized+amino+acids+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+%28LC-MS%2FMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).</a> Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).</li>
</ol>

Esta publicação reflete os pontos de vista do autor e não deve ser interpretado para representar as visões ou políticas da FDA.

HCCF contem os restos e as grandes partículas que podem obstruir e destruir a instrumentação cara, assim o esclarecimento da cultura é necessário antes do processamento mais adicional do downstream. A centrifugação é geralmente a primeira aproximação às pilhas separadas e às outras partículas insolúveis das proteínas seguidas pela filtração. Este HCCF filtrado é submetido então à cromatografia líquida da proteína rápida (FPLC) para a purificação. A purificação de HCCF de microbioreatores automatizados para obter o produto é um passo importante no processamento a jusante. Aqui, um sistema FPLC de bancada com uma coluna de proteína a é usado para obter anticorpos monoclonais do HCCF. O Analytics para processos upstream pode fornecer insights úteis sobre o comportamento da célula e orientar o design de Bioprocessos, ajudando a obter um produto de qualidade consistente e confiável. O Analytics também nos permite vincular os atributos de qualidade crítica (CQAs) aos processos upstream e downstream. São apresentados aqui quatro ensaios que são comumente usados na caracterização de anticorpos monoclonais. Essas técnicas são robustas, confiáveis e prontamente destacáveis para análise de processos e produtos a partir de uma variedade de fontes upstream que são apenas parcialmente purificadas e ainda podem conter níveis residuais de DNA e HCP.
Ao limpar amostras para análise, um importante equilíbrio deve ser atingido entre a criação de uma amostra que está suficientemente limpa para análise, preservando a variabilidade presente no biorreator. Os dois contaminantes mais comuns que afetam o produto são o DNA e o HCP, que podem ser verificados medindo-se a absorbância da razão em 260/280 nm e através de SDS-PAGE ou μCE-SDS. Os ensaios aqui apresentados não são sensíveis a níveis baixos de conteúdo de DNA. A pureza do produto é > 95% puro, como determinado pelo μCE-SDS.
A análise de variante de carga com um sistema de eletroforese microcapilar fornece um método de alta taxa de transferência para identificar variantes de carga, com chips e reagentes que são relativamente fáceis de implementar. A natureza da técnica e a química do reagente de rotulagem são sensíveis a excipientes e outras aminas primárias, exigindo assim uma etapa de dessalinagem para a maioria das matrizes de amostras. Da experiência, os baixos níveis de DNA comigram com o livre-corante da reação de rotulagem e não impactam a qualidade dos resultados. Embora a variabilidade da quantificação de pico básico, principal e ácido seja tipicamente < 1%, níveis mais elevados de DNA e outros contaminantes podem aumentar a variabilidade do ensaio. É extremamente importante ser consistente com a rotulagem da proteína e assegurar o uso alerta do DMF após a remoção da garrafa e de ser misturado com o corante. Os padrões de lisina e/ou histidina são recomendados como controles de rotulagem. Ao longo do tempo e dependendo da qualidade da amostra, os cavacos podem perder o revestimento nos canais de microfluílicos, levando a um maior ruído, a presença de picos fantasmas e maior variação amostral-amostra. Para identificar esta ocorrência, os espaços em branco e um padrão da adequação do sistema (isto é NISTmAb) foram analisados simultaneamente com as amostras em intervalos regulares. Quando surgem problemas de chip, os chips podem ser lavados com a solução de armazenamento ou substituídos.
Os métodos utilizados para a análise glicônica de glicoproteínas terapêuticas envolvem principalmente cromatografia líquida (LC) e/ou espectrometria de massas (MS), com análise de Microarray de lectina ganhando popularidade como terceira opção25. O método descrito neste artigo usa LC e MS, que tem benefícios e desvantagens. Os métodos espectrométricos de massa têm a vantagem da verificação em massa dos glicanos analisados, o que não é possível com métodos baseados em LC usando uma saída de detecção fluorescente ou Microarrays de lectina. Este método usa a deteção do LC e da fluorescência para atribuir identidades do glicana usando a comparação do tempo de retenção a um padrão da escada do dextrano. A monitoração da fluorescência permite o aumento da sensibilidade e da quantificação devido à facilidade de sua deteção, onde o MS sozinho não pôde poder quantificar a baixa espécie da abundância devido à eficiência pobre da ionização dos oligosaccharides. As informações de massa do MS são usadas para confirmar as identidades do glicana, mas o software de processamento não usa informações de massa como os critérios de atribuição primária. Assim, sem cromatografia reprodutível e picos facilmente resolvíveis, este método pode sofrer em relação a atribuições de glicéis. Felizmente, as informações de massa podem ajudar com as atribuições de glicina mesmo em situações em que a cromatografia é subpar, como turnos no tempo de retenção que dificultam as atribuições de glicina reprodutíveis. Se este método é usado sem MS, a cromatografia deve estar ao mais alto nível desde que a informação de massa não pode ser usada para corrigir para a deriva do tempo de residência.
O método de análise de aminoácidos descrito aqui utiliza LC-MS para quantificação rápida de aminoácidos underivatized em meios de cultura de células brutas. Métodos alternativos de análise de aminoácidos requerem agentes de derivação de aminoácidos para permitir a detecção de UV26. O método LC-MS oferece vantagens importantes sobre o método LC-UV: permite a identificação com base no tempo de retenção e na massa de íons em oposição ao método LC-UV, que é limitado pela falta de caracterização em massa. Além disso, o método LC-MS oferece vantagens de tempo e reprodutibilidade, pois o método LC-UV requer uma reação de derivação demorada, o que pode transmitir a variabilidade da amostra27. No entanto, a injeção de meios de cultura de células brutas no método LC-MS pode causar efeitos prejudiciais no sinal de SM devido à incrustagem de escumadeira de íons. Uma escada de calibração é injetada freqüentemente como uma verificação de adequação do sistema, e a ordem da amostra é randomizada para evitar viés nos dados.
O processo de cultura celular para produção de anticorpos utilizando microbioreatores é descrito anteriormente9. Neste estudo, protocolos detalhados para métodos de caracterização de anticorpos monoclonais que maximizam os dados adquiridos de volumes de amostra limitados são bem definidos. Quantidades limitadas de fluido de cultura de células colhidas podem às vezes restringir as informações do produto adquiridas e a seleção dos procedimentos analíticos certos para obter dados de qualidade do produto é essencial. As análises são importantes para vincular os parâmetros de processo upstream às alterações na qualidade do produto. Aqui, um Guideline é fornecido para que os usuários caracterizem mAbs ao trabalhar com microbioreactors.

A terapêutica proteica está sendo usada para tratar uma variedade crescente de condições médicas, incluindo complicações de transplante tecidual, distúrbios auto-imunes e cânceres1. Desde 2004, a administração de alimentos e drogas dos Estados Unidos (USFDA) documentou uma proporção crescente de aplicações de licença biológica (BLAs) de todas as aprovações reguladas pelo centro de avaliação e pesquisa de drogas (CDER), com BLAs representando mais de 25% em 2014 e 20152.
Considerando este mercado em expansão, os fabricantes biofarmacêuticos são desafiados com rapidamente entregando mais produto com qualidade consistente. Os esforços para aumentar o rendimento do produto concentraram-se na engenharia de células CHO e na triagem da linha de produção, embora as melhorias mais significativas sejam devidas aos avanços na otimização da estratégia de mídia/feed e controles ambientais da cultura celular1, 3. º , 4. º , 5 durante o processo de fabricação.
Desde que os mAbs são produzidos em um sistema biológico, pode haver uma variabilidade inerente da proteína. A composição do anticorpo pode ser alterada pós-translacionalmente, como a glicosilação ou impactada pela degradação ou reações enzimáticas. Estas variações estruturais podem provocar reações imunes perigosas ou alterar a ligação do anticorpo, que por sua vez pode reduzir ou eliminar a função terapêutica pretendida5. Assim, os atributos críticos da qualidade (CQAs) de anticorpos monoclonais-perfil de N-glycan, distribuição da variação da carga, e a porcentagem do anticorpo na forma monomérica-são monitorados e controlados regularmente como parte de uma aproximação da qualidade pelo projeto (QbD) durante processosdefabricação1,6. Em um ambiente de produção regulamentado, as proteínas terapêuticas devem atender aos critérios de aceitação a serem licenciados como um produto comercial aprovado de drogas7. Os métodos aqui apresentados seriam tipicamente parte do processo de caracterização da qualidade de um anticorpo7,8, e qualquer cientista protéico estará familiarizado com o seu uso.
No trabalho prévio9, a aplicação e a operação dos microbioreactors para a seleção elevada da produção de condições da cultura de pilha no Bioprocessamento ascendente foram descritas. O produto purificado obtido a partir das diferentes condições de mídia é submetido à análise de N-glycan usando LC-MS. os padrões de glicosilação de proteínas terapêuticas podem ser detectados e caracterizados usando técnicas de LC-MS10,11, e o a presença de várias espécies de glicanos tem sido associada a parâmetros Bioprocessos como estratégia alimentar, pH e temperatura12. O efeito das diferentes condições de mídia sobre a qualidade do produto, indicado pela porcentagem da IgG resultante na forma monomérica, também é avaliado com cromatografia de exclusão de tamanho-espalhamento de luz multiangulares (SEC-mals)13,14 , o perfil Variant da carga 15. The representa um número de modificações16 que poderiam impactar a função de um produto. A electroforese da zona microcapilar (mcze) é uma técnica que ofereça um tempo consideravelmente mais rápido da análise comparada à cromatografia tradicional da troca catiónica (CEx) e aos métodos de focalização isoelétrico capilares (CIEF) usados para a análise variante da carga17 ,18. A mídia de biorreator gasto foi analisada para rastrear o consumo de aminoácidos durante a produção protéica, pois relaciona-se com alterações nos atributos de identificação do anticorpo19,20,21,22 , a 23.
A análise protéica nos permite identificar os parâmetros críticos do processo (CPPs) com base nas relações entre as entradas do processo e as mudanças nas CQAs. Durante o desenvolvimento de Bioprocessos, identificar e medir CPPs demonstra fundamentalmente o controle do processo e assegura que o produto não tenha mudado, o que é essencial em ambientes de manufatura altamente regulamentados. Neste trabalho são apresentadas técnicas analíticas para mensurar algumas das características bioquímicas da proteína mais pertinente ao produto CQAs (perfil N-glycan, variantes de carga e homogeneidade de tamanho).

<table><tbody><tr><td>Linha Celular CHO DG44</td><td>Invitrogen</td><td>A1100001</td><td></td></tr><tr><td>Akta Avant 25</td><td>General Electric Life Sciences</td><td>28930842</td><td></td></tr><tr><td>Pro Sep vA Ultra Cromatografia Resina</td><td>Millipore Sigma</td><td>115115830</td><td>Purificação Fase Estacionária</td></tr><tr><td>Omnifit 10cm Coluna</td><td>Diba Inteligência Fluida</td><td>006EZ-06-10-AA</td><td>Habitação para Fase Estacionária Base</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Superloop 10 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1113-81</td><td></td></tr><tr><td>&micro; Detector de Dispersão de Luz Multi Ângulo Dawn</td><td>Wyatt</td><td>WUDAWN-01</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Unidade de Filtro Millex GV Membrana PVDF</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>10X Tampão com Fosfato Salino</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 12 mL</td><td>Covidien</td><td>8881512878</td><td></td></tr><tr><td>1290 Bomba Binária</td><td>Infinity Agilent Technologies</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity DAD&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Sampler</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Termostato Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Termostato Compartimento de Coluna</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo Falcon</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>150 uL Inserções de Vidro com Pés de Polímero&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2088</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Falcon de 50 mL</td><td>Corning Inc.</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Bio-Rad</td><td>127737</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695072</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Fisher Chemical</td><td>BPA996-4</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY I-Class UPLC BSM</td><td>Waters Corporation</td><td>18601504612</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager</td><td>Waters Corporation</td><td>186015000</td><td></td></tr><tr><td>Detector ACQUITY UPLC FLR Waters</td><td>Corporation</td><td>176015029</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Filtros centrífugos de 100 kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC810096</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácido Padrão, 1 nmol/&micro; L&nbsp;</td>Suplemento de Aminoácidos <td>Agilent Technologies</td><td>5061-3330</td><td></td></tr> Solução de Formato de Amônio <tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td>5062-2478</td><td></td></tr><tr><td>- Análise de Glicanos</td><td>Waters Corporation</td><td>186007081</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de Rosca Azuis com Septos</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0717</td><td></td></tr><tr><td>CD OptiCHO AGT Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1122205</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Charge Variant Chip</td><td>Kit de Reagentes Variante de Carga 760435</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Perkin Elmer Perkin Elmer</td><td>CLS760670</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia Água (Grau MS)</td><td>Fisher Chemical</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Thermo Scientific</td><td>20673</td><td></td></tr><tr><td>Coletor de Placa de Extração para Placas de 96 Poços</td><td>Oasis Waters Corporation</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Fórmico</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 Amostras</td><td>Waters Corporation</td><td>176003712</td><td></td></tr><tr><td>GXII Buffer Tubes</td><td>E& K Scientific</td><td>697075- NC</td><td></td></tr><tr><td>GXII Pano de limpeza de janelas de detecção</td><td>VWR</td><td>21912-046</td><td></td></tr><tr><td>GXII HT Touch</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS138160</td><td></td></tr><tr><td>GXII Tubos de escada</td><td>Genemate</td><td>C-3258-1</td><td></td></tr><tr><td>GXII Cotonete sem fiapos</td><td>ITW Texwipe</td><td>TX758B</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Verificação de Massa de mAb Intacta Standard</td><td>Waters Corporation</td><td>186006552</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de Aminoácidos Intrada 150 x 2 mm</td><td>Imtakt</td><td>WAA25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Espectrofotômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840274100</td><td></td></tr><tr><td>Optilab UT-rEX Detector de Índice de Refração Diferencial</td><td>Wyatt</td><td>WTREX-11</td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>perclóricoAldrich Chemistry</td><td>311421</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta com Microcapilar para Carregamento de Géis</td><td>Microplaca de Polipropileno Labcon</td><td>1034-960-008</td><td></td></tr><tr><td>de 96 Poços, Fundo F, Estilo Chaminé, Preta</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>RapiFlour-MS Calibração de Dextrano Ladder</td><td>Waters Corporation</td><td>186007982</td> Frasco Transparente com Tampa de <td></td></tr><tr><td>Rosca 2mL</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0715</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de Sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383112</td><td></td></tr><tr><td>TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L</td><td>Tosoh Biosciences</td><td>003449</td><td></td></tr><tr><td>UNIFI Sistema de Informação</td><td>Científica Waters Corporation</td><td>667005138</td><td></td></tr><tr><td>Calços de Coletor de Vácuo</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td>Bomba de</tr><tr><td>Vácuo</td> 186007986 <td>Waters Corporation</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-ToF</td><td>Waters Corporation</td><td>186005597</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de Dessalinização Spin Zeba, 0.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>89883</td><td></td></tr></tbody></table>

purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de microbioreator automatizado

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Os anticorpos monoclonais (mAbs) são um dos produtos biológicos mais populares e bem caracterizados fabricados hoje. Mais comumente produzidos usando células de ovário de hamster chinês (CHO), cultura e condições de processo devem ser otimizados para maximizar os títulos de anticorpos e alcançar perfis de qualidade alvo. Normalmente, essa otimização usa biorreatores de microescala automatizados (15 mL) para a tela de várias condições de processo em paralelo. Os critérios de otimização incluem o desempenho da cultura e os atributos críticos de qualidade (CQAs) do produto anticorpo monoclonal (mAb), que pode impactar sua eficácia e segurança. As métricas de desempenho da cultura incluem crescimento celular e consumo de nutrientes, enquanto as CQAs incluem os perfis de N-glicosilação e agregação do mAb, variantes de carga e peso molecular. Este protocolo detalhado descreve como purificar e analisar subseqüentemente amostras de HCCF produzidas por um sistema automatizado do microbioreactor para ganhar métricas e saídas valiosas do desempenho. Primeiramente, uma proteína automatizada um método rápido da cromatografia líquida da proteína (FPLC) é usada para purificar o MAB das amostras colhidas da cultura de pilha. Uma vez concentrados, os perfis glicados são analisados por espectrometria de massas utilizando uma plataforma específica (consulte a tabela de materiais). Os pesos moleculares do anticorpo e os perfis da agregação são determinados usando a cromatografia da exclusão do tamanho-espalhamento claro do ângulo múltiplo (SEC-MALS), quando as variações da carga forem analisadas usando a electroforese da zona capilar do microchip (mCZE). Além das métricas de desempenho da cultura capturadas durante o processo de biorreator (ou seja, viabilidade da cultura, contagens de células e metabólitos comuns, incluindo glutamina, glicose, lactato e amônia), a mídia gasta é analisada para identificar os nutrientes limitantes para melhorar as estratégias de alimentação e o design geral do processo. Portanto, um protocolo detalhado para a quantificação absoluta de aminoácidos por cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS) de meios gastos também é descrito. Os métodos usados neste protocolo aproveitam as plataformas de alta taxa de transferência que são compatíveis para um grande número de amostras de pequeno volume.

O fluido de cultura de células colhidas do biorreator automatizado de microescala é purificado usando cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC), como observado na Figura 1 e os atributos críticos de qualidade de proteínas purificadas (CQAs) foram caracterizados por vários métodos analíticos a jusante. Este é um benefício chave do sistema automatizado do microbioreactor; as diferenças nas CQAs podem ser rapidamente avaliadas através de uma vasta gama de condições. Dados de N-glycan de mAbs produzidos por CHO que são processados por espectrometria de massas devem aparecer como os cromatogramas mostrados na Figura 2. A figura retrata uma comparação entre dois cromatogramas mostrando que o pico de manose 5 (M5) de uma amostra é consideravelmente menor. Se apenas uma linha de base barulhenta for observada em vez de picos, isso pode significar que a configuração da cromatografia está defeituosa ou que o procedimento não é bem-sucedido. Usando controles, a solução de problemas pode ser simplificada. Primeiramente, avalie os picos de FLR da escada do dextrano; Estes picos indicam que o sistema cromatográfico está a funcionar correctamente. Em seguida, compare os picos obtidos experimentalmente com aqueles obtidos de um padrão de mAb intacto processado. Se os picos da norma estiverem visíveis, mas não forem identificados picos de amostra, as amostras de mAb não foram processadas corretamente. Isto pode ser devido ao SDS ou à presença nucleófilo no amortecedor que interfere com a rotulagem e a purificação do N-glycan.
SEC-MALS pode ser usado para avaliar mais duas CQAs: o perfil de agregação e o peso molecular do anticorpo. Um cromatograma representativo da SEC-MALS é comparável ao mostrado na Figura 3. A distribuição de massa molecular e o peso molecular absoluto foram determinados utilizando-se o software requerido com um coeficiente de extinção de 1,37 mL * (mg * cm)-1 e um DN/dc de 0,185 ml/g. Como a chamada de pico e definindo a linha de base no software é realizada manualmente, os resultados podem variar ligeiramente de usuário para usuário. O peso molecular absoluto do monomérico IgG1 da Figura 3 é 1,504 x 105 da ± 0,38% (azul) e o complexo de ordem superior é de 7,799 x 105 da ± 3,0% (vermelho). A polidispersão dos agregados é muito maior do que a do monómero, como indicado pela distribuição de massa molar vermelha do pico 1 (Figura 3). A pequena quantidade de amostra e a importância da agregação como CQA fazem desta técnica uma ferramenta analítica complementar altamente valiosa para o sistema automatizado de microbioreatores.
O resultado de mCZE é um electropherogram, tal como na Figura 4, que mostra o perfil da variação da carga para um anticorpo monoclonal. O perfil é uma assinatura única para a proteína que está sendo investigada e é altamente sensível ao pH de operação. Também visível é um pico de corante livre à esquerda do perfil variante de carga. Ao estabelecer um pH de funcionamento, há alguma discrição ao operador para equilibrar a resolução e o sinal; Além disso, o operador deve garantir uma boa separação do pico de corante livre que migra em ~ 30 s. A amostra pode ser dessalinada após a rotulagem para remover este pico, embora isso leva a uma perda significativa no sinal. Uma vez que um pH de funcionamento é estabelecido, os perfis da amostra podem ser comparados. Embora geralmente consistentes, mudanças na eficiência de rotulagem ou diferenças em excipientes podem levar a pequenas diferenças na migração de uma amostra e o perfil de variante de carga fazendo eletroferogramas difícil de comparar diretamente. Em vez disso, o método de comparação é geralmente baseado nas porcentagens de espécies básicas, principais e ácidas. Neste caso, as diferenças relativas tão pequenas quanto 1-2% podem ser identificadas usando mCZE.
O consumo de aminoácidos pode ser monitorado para determinar se a depleção está causando alterações nas CQAs. Os leituras do cromatograma do espectrómetro maciço podem ser usados para avaliar a criação bem sucedida de uma curva da calibração para a quantificação absoluta dos ácidos aminados em amostras cruas dos meios do biorreator. A Figura 5 retrata dois cromatogramas de íons totais (TIC) e um cromatograma íon extraído (xic) como resultados representativos durante este processo. Na Figura 5a, o TIC mostrado retrata o sinal de fundo do sistema de buffer como apenas um espaço em branco de água foi injetado. Figura 5 B RETRATA um TIC representativo do padrão de aminoácidos onde, quando comparado com a água em branco, pequenos picos que correspondem às espécies de aminoácidos individuais podem ser observados (como a lisina em 7,96 minutos). Para integrar o pico e facilitar a quantificação da área de pico (e, portanto, a concentração), o XIC é usado onde apenas o sinal de uma "janela de massa cromatograma" definida é exibida. Dependendo da sensibilidade do instrumento e da qualidade da separação cromatográfica, a janela de massa ideal terá que ser determinada pelo usuário. Neste exemplo (Figura 5C), o Xic de lisina (m/z = 147,1144) com uma janela de massa de 10 ppm é mostrado onde lisina no padrão de aminoácidos elutos fora da coluna em 8, 3 minutos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig1.jpg"> Figura 1 . Cromatograma representativo do esquema de purificação utilizando a técnica de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC). As fases do método de purificação correspondentes ao volume (mL) são rotuladas ao longo do eixo x. A absorvância UV a 280 nm (mAU eixo y, linha sólida) é monitorada durante todo o ciclo de purificação. As impurezas não especificamente ligadas são deslocadas pelo aumento da condutividade (mS/cm y-Axis, linha tracejada) durante a lavagem de sal alto. o anticorpo é eluído da coluna da proteína A com a introdução do amortecedor da eluição (conc B, linha pontilhada) quando o pH diminui a 4 (não mostrado). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig2.jpg"> Figura 2. Um cromatograma de fluorescência representativo obtido a partir de glicanos marcados que são verificados em massa. O eixo x é o tempo de retenção (minutos) enquanto o eixo y é a intensidade do sinal. O pico em 14,94 min representa a glicina mannose 5 (M5), onde uma grande diferença entre a força do sinal M5 pode ser observada entre as duas amostras que são sobrepostas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig3.jpg"> Figura 3. Distribuição de peso molecular do anticorpo monoclonal IgG1. Cromatograma de um anticorpo monoclonal IgG1 intacto separado por cromatografia de exclusão de tamanho em 1X PBS (pH 7,4). A absorvência é monitorada em 280 nm (preto; eixo esquerdo) e os detectores de espalhamento de luz e de índice de refração foram utilizados para calcular o peso molecular absoluto de cada pico (vermelho e azul; eixo direito). As espécies de alto peso molecular são indicadas com o pico rotulado como "HMW". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig4.jpg"> Figura 4 . Perfil variante de carga de um anticorpo monoclonal IgG1. Este electroferograma é gerado em uma plataforma de mcze. Um pico de corante livre migra em ~ 30 s e está bem separado do IgG1. Para a quantificação, os picos foram divididos em espécies básicas, principais e ácidas, utilizando software de análise de dados de instrumentos. A linha vermelha descreve as áreas de pico integradas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig5.jpg"> Figura 5. Resultados representativos dos cromatogramas de íon para a análise de aminoácidos de massa baseada em espectrometria de meios de biorreator brutos. O eixo x é o tempo (minutos), enquanto o eixo y é a intensidade do sinal (a) uma água em branco serve como o controle negativo e revela o sinal de fundo observado ao longo do gradiente de cromatografia líquida (B) o 225 pmol/μl aminoácido o padrão é usado aqui como um controle positivo, porque os picos individuais observados neste cromatograma do íon total representam os ácidos aminados diferentes da mistura padrão que está sendo resolvida cromatograficamente (C) um cromatograma extraído representativo do íon para m /z 147,1144, que é lisina. O pico de 7,96 min em B corresponde ao pico de 8, 3 em C de lisina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um protocolo detalhado para a purificação e a análise subseqüente de um anticorpo monoclonal do líquido de cultura de pilha colhido (HCCF) de microbioreactors automatizados foi descrito. O uso de análises para determinar os atributos críticos de qualidade (CQAs) e maximizar o volume de amostra limitado para extrair informações vitais também é apresentado.

Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Este protocolo aborda a análise de amostras limitadas obtidas de microbioreatores para extrair informações vitais sobre os atributos críticos de qualidade dos produtos. Outra vantagem dessas técnicas é que eles usam tempos mínimos de análise para determinar os principais atributos que ditam os parâmetros de qualidade do produto fabricado. O procedimento de demonstração será David Powers, Talia Faison e Phillip Angart, pesquisadores do meu laboratório.Comece abrindo o software ligado ao sistema de purificação e colocando tubos cônicos de 15 mililitros para coletar o eluato de anticorpos purificados e tubos cônicos de 50 mililitros para coletar o fluxo durante a lavagem de sal alto no coletor de frações. Em seguida, adicione 0,22 micrômetros filtrados fluido de cultura celular colhida a uma seringa vazia de 12 mililitros com um bocal tampado. Depois de remover a tampa, insira o bocal de seringa na porta de injeção manual do sistema de purificação.Torça a seringa para apertá-la no lugar e deprimir o êmbolo até que todo o volume da amostra tenha sido injetado e esteja visível no loop de amostra de grande volume de 10 mililitros. Selecione o método salvo e clique em Executar quando solicitado pelo software de instrumento. Quando todo o anticorpo tiver sido iludido, neutralize imediatamente a proteína purificada com uma base molar tris para um pH de cerca de 5,5.Para concentrar o anticorpo purificado por centrifugação, coloque 100 filtros kilodalton em tubos de coleta de filtrados. Lave os filtros com 500 microliters de água dupla destilada e, em seguida, centrífuga. Repita a lavagem do filtro duas vezes.Após a segunda lavagem, descarte o filtrado e transfira os filtros enxaguados para novos tubos de centrífuga. Em seguida, adicione 500 microliters de amostra a cada filtro para centrifugação. No final do giro, inverta o filtro em um novo tubo de coleta para obter a amostra concentrada com uma centrifugação final.Para rotulagem e isolamento n-glicano, diluir 7,5 microliters de cada amostra de anticorpos concentrados. Com 15,3 microliters de espectrometria de massa cromatografia líquida ou água de grau LCMS em tubos de um mililitro do kit, e desnaturação dos anticorpos com seis microlitadores de uma solução de 5% de um surfactante amigável à espectrometria e espectrometria de massa a 90 graus Celsius por três minutos. No final da desnaturação, permita que as amostras esfriem até a temperatura ambiente por três minutos antes de adicionar 1,2 microliters de peptídeo N-glicosidase F para uma incubação de cinco minutos a 50 graus Celsius.Após o resfriamento das amostras por três minutos à temperatura ambiente, rotule as amostras com 12 microliters de reagente fluorescente de marcação dissolvido em dimetilaformamida anidro por cinco minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, diluir a mistura n-glica rotulada com 358 microliters de acetonitrilo e colocar uma placa de cromatografia de interação hidrofílica em um coletor de vácuo com calços e bandeja de resíduos. Condicionar os poços com 200 microliters de água com o vácuo ajustado para 10 a 15 quilopascals para garantir que o líquido leve de 15 a 30 segundos para passar pela resina de cromatografia de interação hidrofílica.Equilibre os poços com 200 microlitres de 85% de acetonitrilo por 15 a 30 segundos antes de carregar 400 microliters de cada mistura de gliccano rotulado em cada poço, aplicando o vácuo após cada novo líquido ser adicionado. Quando todas as amostras tiverem sido adicionadas, lave a resina duas vezes com 600 microlitadores de ácido fórmico de 1% e 90% de acetonitrilo por lavagem e substitua a bandeja de resíduos por tubos de coleta de 600 microliteres. Em seguida, iluda os N-glicacanos rotulados com três volumes de 30 microliteres de tampão de elução de espectrometria e diluir as diluições da piscina com 310 microlitrais de dimetilformamida em eluente amostrado de acetonitrilo.Para analisar as amostras de elução N-glycan rotuladas em um sistema de cromatografia líquida ultraperformance acoplado a um detector de fluorescência e tempo quádruplo de espectrômetro de massa de voo, use 50 milimônios formato e acetonitrila de grau 100% LCMS para as fases móveis. Defina a taxa de fluxo inicial para 0,4 mililitros por minuto, com o gradiente LC fornecendo formato crescente de amônio durante a fase de eluição. Defina o detector de fluorescência para medir uma excitação de 265 nanômetros e uma emissão de 425 nanômetros com uma taxa de amostragem de dois hertz.Defina o tempo quádruplo de voo para o modo de sensibilidade de íons MS1 positivo com uma faixa de massa de 100 a 2.000 Daltons, um tempo de varredura de 0,25 segundos, e uma aquisição de dados contínuos. Em seguida, carregue as amostras no sampler automático definido a 10 graus Celsius e execute o método carregado. Para desalar uma amostra em preparação para a análise da variante de carga, tire a rolha inferior de uma coluna de desalagem de 0,5 mililitro, solte a rolha superior e coloque a coluna de desalagem em um tubo de centrífuga de 1,7 mililitro.Transfira a nova coluna para um novo tubo de microcentrifuuge e adicione 80 microliters de uma solução de anticorpos de 3,5 mililiteres para o topo da coluna. Alinhe a coluna à orientação original e centrifufique a coluna. Em seguida, descarte a coluna de desalagem e misture completamente a amostra concentrada.Diluir a amostra para uma concentração de dois miligramas por mililitro em 25 microliters de água ultrauso em um único poço de uma placa de 96 poços e adicionar cinco microliters de tampão de rotulagem e cinco microliters de reagente de rotulagem ao poço. Após uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente protegida da luz, misture 60 microliters de água de grau reagente com a amostra e cubra a placa com uma vedação de placa para centrifugação. Para preparar o chip da variante de carga, remova a solução de armazenamento e lave os poços um, três, quatro, sete, oito e 10 com água.Substitua a água por tampão de funcionamento pH 7.2 e adicione 750 microliters de tampão de corrida ao tubo tampão. Pressione a placa de descarga na interface do usuário do instrumento e remova o selo da placa de 96 poços. Insira a placa e o tubo tampão nos pontos indicados na bandeja de amostra GX2 e pressione a placa de carga.Coloque o chip na câmara do chip, feche a tampa da câmara do chip, selecione o ensaio da variante de carga de proteína HT quando solicitado e clique em Executar. A purificação da amostra de cultura celular colhida do bioreator de microescala automatizada por cromatografia líquida de proteína rápida permite a caracterização dos atributos críticos de qualidade das proteínas purificadas por vários métodos analíticos a jusante, como demonstrado. Os dados n-glycanos de anticorpos monoclonais produzidos pelo ovário chinês processados pela espectrometria de massa devem parecer semelhantes a esses cromatógramas representativos.A dispersão de luz de múltiplos ângulos de exclusão de tamanho pode ser usada para avaliar o perfil de agregação e o peso molecular do anticorpo. A pequena quantidade de amostra e a importância da agregação são atributos críticos de qualidade para tornar essa técnica uma ferramenta analítica complementar altamente valiosa para o sistema microbioreator automatizado. O resultado da eletroforese da zona micro capilar é um eletroferóico e pode ser usado para mostrar o perfil da variante de carga para um anticorpo monoclonal, uma assinatura única para a proteína que está sendo investigada que é altamente sensível ao pH operacional.O consumo de aminoácidos também pode ser monitorado para determinar se o esgotamento causa alterações nos atributos críticos de qualidade do anticorpo. É importante garantir uma purificação adequada e eficiente do produto fabricado, pois as etapas analíticas só podem ser realizadas com uma proteína devidamente purificada. O produto também pode ser submetido a testes de mapeamento de peptídeos e estabilidade.Mas uma vez que a proteína foi usada para um método de caracterização, ela normalmente não pode ser usada para outro. Essas técnicas permitem a análise de produtos produzidos a partir de pequenas plataformas de triagem de bioprocessamento de alto rendimento para entender a influência dos parâmetros de bioprocessamento na qualidade do produto. Algumas dessas técnicas utilizam ácido polelorico concentrado, ácido fórmico, N-dimetilformamida, todas perigosas e devem ser manuseadas cuidadosamente durante o uso do equipamento de proteção adequado.

purification-analytics-monoclonal-antibody-from-chinese-hamster-ovary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

A alta taxa de transferência de plataforma, desenvolvimento, fabricação automatizada de células da linha para a produção de proteínas terapêuticas é descrito. Implementação de BD Sorter celular FACS Aria, CloneSelect Imager e TECAN Freedom EVO sistema de manipulação de líquidos tem demonstrado capacidade de processamento aumentou significativamente no desenvolvimento de linhagem de células com melhor qualidade de células de linha e alta reprodutibilidade.

Uma plataforma de alta capacidade automatizada para o Desenvolvimento de linhagens celulares para a fabricação de proteínas Therapeutics

Este vídeo demonstra uma técnica para estudar a localização in vivo de anticorpos específicos do tumor em um modelo de xenoenxerto de tumor de camundongo. Após a injeção subcutânea de células cancerígenas em camundongos para a formação de tumores, são injetados anticorpos marcados com fluorescência que se ligam a receptores específicos do tumor, permitindo a avaliação in vivo da localização do anticorpo por meio de imagens.

Uma técnica para avaliar a localização in vivo de anticorpos específicos do tumor

O vídeo explica o processo de produção de anticorpos em células hospedeiras de mamíferos, desde a expressão gênica até a secreção. Envolve transcrição, tradução, reconhecimento de sinal, dobramento correto e eventual liberação no meio extracelular por meio de vesículas secretoras.

Produção e purificação de anticorpos recombinantes de células de mamíferos

Este vídeo demonstra um ensaio para purificar anticorpos monoclonais de fluido de cultura de células colhidas de células ovarianas de hamster chinês. Ele emprega uma resina de vidro porosa com proteína A imobilizada, que se liga à região Fc dos anticorpos na amostra, separando-os efetivamente dos contaminantes. O uso de um tampão de eluição de baixo pH enfraquece a interação, facilitando a recuperação de anticorpos purificados.

Uma técnica para purificar anticorpos monoclonais produzidos por células de ovário de hamster chinês

Este vídeo demonstra uma técnica para purificar anticorpos monoclonais do sobrenadante de cultura obtido de uma cultura de células produtoras de anticorpos. O processo envolve o uso de uma matriz de grânulos de agarose reticulados com proteína A conjugada, que imobiliza os anticorpos no sobrenadante nos grânulos, permitindo uma separação eficaz dos contaminantes. Ao aplicar um tampão de eluição com pH baixo, a interação proteína-anticorpo A é afrouxada, facilitando a coleta de frações contendo...

Uma técnica de cromatografia de afinidade para a purificação de anticorpos monoclonais

Um protocolo otimizado é apresentado para a geração de anticorpos monoclonais baseados na tecnologia de hibridoma. Os camundongos foram imunizados com um imunoconjugado. As células do baço foram fundidas por PEG e um impulso elétrico com células de mieloma imortal. As células de hibridoma produtoras de anticorpos foram selecionadas por HAT e triagem ELISA antígeno-específica.

Geração de anticorpos monoclonais murinos pelo hibridoma Tecnologia

É apresentado um protocolo detalhado para a operação simultânea de 48 culturas de pilha paralela em variadas condições em um sistema de microbioreactor. Processo de cultura de células, colheita e análise de título de anticorpos subsequentes são descritos.

Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

Aqui, apresentamos um procedimento detalhado para executar um Projeto de Experimento em um micro-bioreator automatizado seguido de colheita celular e quantificação de proteínas usando uma coluna de Proteína A.

Otimização de processos usando micro-bioreatores automatizados de alto throughput no cultivo de células de ovário de hamster chinês

O padrão de glicosylation de um anticorpo determina seu desempenho clínico, assim persistem os esforços industriais e acadêmicos para controlar a glicosylation. Uma vez que as campanhas típicas de glicoengenia são tempo e trabalhoso, a geração de um protocolo rápido para caracterizar o impacto dos genes de glicosylação usando silenciamento transitório seria útil.

Glicoengenia de anticorpos rápidos em células de ovário de hamster chinês

Este protocolo descreve como usar o Sistema Ômico de Cultura de Microlitros de Célula Única (célula MISS) para realizar isolamento, cultivo e colheita monoclonal microbiana. A célula MISS alcança um fluxo de trabalho integrado baseado na tecnologia microfluídica de gotículas, que oferece excelente monodispersão de gotículas, alto cultivo paralelo e detecção de biomassa de alto rendimento.

Cultivo e colheita monoclonal microbiana automatizada e de alto rendimento usando o sistema ômico de cultura de gotículas de microlitro de célula única

Aprenda a purificar e analisar anticorpos monoclonais de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado. Este método permite determinar atributos críticos de qualidade com volumes mínimos de amostra.

Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado (Vídeo) | JoVE Journal

Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado

Explorar mais vídeos