Um sistema de indução de estomas agrupado por tratamento de imersão de solução de açúcar em plântulas de Arabidopsis thaliana
15 de fevereiro de 2019
O objetivo do presente protocolo é demonstrar como induzir estomas clusterizadas em cotilédones de plântulas de Arabidopsis thaliana por tratamento de imersão com uma solução de médio contendo açúcar e como observar estruturas intracelulares como cloroplastos e microtúbulos nas células guarda clusterizados usando confocal laser microscopia.
Este método respondeu a uma questão-chave da biologia do desenvolvimento vegetal. Ou seja, qual é a importância da distribuição espacial de stomata? Nosso sistema de indução para stomata agrupada usando solução de sacarose é bastante fácil e diretamente aplicável a linhas transgênicas ou mutantes de Arabidopsis thaliana.
Para começar, adicione 1,1 gramas de sais médios Murashige-Skoog e 15 gramas de sacarose a um béquer. Adicione 490 mililitros de água destilada ao béquer e misture com a barra de mexida. Use hidróxido de potássio para ajustar o pH para 5,8.
Em seguida, dilua a solução com 500 mililitros de água destilada e transfira a solução diluída para uma garrafa média. Depois disso, autoclave a solução. Prepare a solução de esterilização de acordo com o protocolo de texto.
Em seguida, trabalhando sob condições assépticas, coloque cerca de 50 sementes transgênicas de A.thaliana carregando um marcador fluorescente em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione um mililitro de 70% de etanol ao tubo e misture invertendo o tubo cinco vezes. Depois de permitir que as sementes afundem no fundo do tubo, remova suavemente o etanol com uma micropipette.
Adicione um mililitro de solução de esterilização às sementes e inverta o tubo cinco vezes para misturar. Remova suavemente a solução de esterilização das sementes com uma micropipette. Em seguida, adicione um mililitro de água estéril.
Adicione 1,5 mililitros da solução Murashige-Skoog a cada poço de uma placa de 24 poços. Em seguida, adicione duas sementes esterilizadas a cada poço. Usando duas camadas de parafilm, fita a tampa na placa.
Em seguida, transfira a placa para uma câmara de crescimento para incubar por 14 dias. Primeiro, transfira 30 microliters da solução Murashige-Skoog da placa de 24 poços para o centro de um escorregador de vidro. Usando uma tesoura dissecando, remova o cotilledon de uma muda de 14 dias.
Flutue o cotyledon com o lado de observação voltado para a queda da solução Murashige-Skoog. Prepare o cotyledon de acordo com os métodos descritos anteriormente no Journal of Visualized Experiments. Coloque o espécime no estágio de um microscópio laser confocal.
Finalmente, use iluminação de campo brilhante para selecionar células de guarda agrupadas para observação. Neste protocolo, o agrupamento estomatal foi induzido em mudas de A.thaliana. As células de guarda agrupadas cultivadas na sacarose contendo meio com cloroplastos maiores do que células de guarda cultivadas em condições livres de sacarose.
O alargamento dos cloroplastos foi confirmado com um marcador de estroma cloroplasto e autofluorescentes de clorofila, sugerindo que o tratamento da sacarose resultou no acúmulo de grãos de amido nos cloroplastos. Além disso, a observação confocal da banheira GFP-6 revelou que os microtúbulos corticais eram radialmente orientados nas células tratadas com sacarose, assim como nas células de proteção livre de sacarose. Na verdade, descobrimos esse método por acidente.
Após o achado, examinamos a resposta ambiental de stomata agrupada. Acreditamos que nosso sistema poderia ajudar a examinar o significado da distribuição de stomata.
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Visão Geral
Este protocolo demonstra como induzir estômatos agrupados em cotilédones de plântulas de Arabidopsis thaliana utilizando um meio contendo açúcar. Também descreve a observação de estruturas intracelulares, como cloroplastos e microtúbulos, em células-guarda por meio de microscopia a laser confocal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do Desenvolvimento Vegetal
- Função Estomática
- Técnicas de Microscopia
Contexto
- Os estômatos desempenham um papel crucial na troca gasosa e na regulação hídrica em plantas.
- A distribuição espacial dos estômatos afeta a fisiologia e o desenvolvimento da planta.
- Arabidopsis thaliana é um organismo modelo para o estudo da biologia vegetal.
- A microscopia confocal a laser permite a observação detalhada de estruturas celulares.
Objetivo do Estudo
- Induzir estômatos agrupados em plântulas de Arabidopsis thaliana.
- Investigar as estruturas intracelulares nas células-guarda.
- Fornecer um método aplicável a linhagens transgênicas ou mutantes.
Métodos Utilizados
- Preparação de um meio contendo açúcar utilizando sais de Murashige-Skoog e sacarose.
- Ajuste do pH para 5,8 usando hidróxido de potássio.
- Tratamento por imersão de plântulas no meio preparado.
- Observação de células-guarda utilizando microscopia a laser confocal.
Resultados Principais
- Indução bem-sucedida de estômatos agrupados nos cotilédones.
- Visualização de cloroplastos e microtúbulos nas células-guarda.
- Aplicabilidade demonstrada em diversas linhagens de Arabidopsis.
- Fornecimento de informações sobre a distribuição espacial dos estômatos.
Conclusões
- O método é eficaz para o estudo do desenvolvimento estomático.
- Ele aprimora a compreensão da função estomática em plantas.
- Pesquisas futuras podem se basear neste protocolo para obter mais insights.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O entendimento da distribuição espacial dos estômatos fornece subsídios para modelos preditivos de eficiência no uso da água pelas plantas e capacidade fotossintética, aspectos relevantes para a otimização da produtividade agrícola e resiliência ao estresse na biotecnologia agrícola. Este sistema de indução permite a investigação mecanicista da biologia das células-guarda sem modificação genética, apoiando a validação de alvos em vias de sinalização vegetal. O método oferece uma plataforma escalável e reprodutível para avaliar os efeitos de compostos no padrão e na função estomática em processos de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar os mecanismos de padronização espacial no desenvolvimento estomático para validar alvos nas vias de sinalização em plantas.
- Valor Operacional: Oferece um sistema não genético e indutível quimicamente, aplicável a linhagens transgênicas ou mutantes, para reduzir riscos associados aos alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas fenotípicas quantificáveis (estômatos agrupados, aumento do cloroplasto) para triagem de alto conteúdo de compostos bioativos.
- Valor Operacional: Utiliza meio MS com sacarose padronizado e leituras confocais para garantir a reprodutibilidade do ensaio entre laboratórios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona o agrupamento estomático a biomarcadores intracelulares (tamanho do cloroplasto, orientação dos microtúbulos) para redução de riscos mecanicistas em estudos de resposta ao estresse em plantas.
- Valor Operacional: Apoia a continuidade desde a descoberta de genes/destinos até a validação fenotípica em sistemas relevantes para doenças.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, nos quais a triagem fenotípica e a validação de alvos precedem a identificação de compostos líderes, especialmente em pipelines de desenvolvimento de agroquímicos e características de plantas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a importância do espaçamento estomático por meio do agrupamento induzível, sem alteração genética.
- Triagem: Permite sistemas prontos para ensaios com fenótipos quantificáveis de células-guarda para triagem de bibliotecas de compostos.
- Análises: Fornece leituras quantitativas por microscopia confocal (tamanho dos cloroplastos, orientação dos microtúbulos) para comparar os efeitos de tratamentos.
- Pesquisa Translacional: Conecta observações intracelulares à função estomática para modelagem preditiva na resposta ao estresse.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de indução reutilizável, aplicável a diferentes linhagens mutantes e transgênicas de Arabidopsis.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da redução de riscos fenotípicos dos mecanismos de padronização estomática.
- Valor Operacional: Padronização por meio do meio MS com sacarose definido e ajuste de pH garante reprodutibilidade.
- Valor Estratégico: Permite decisões precoces de prosseguir/não prosseguir quanto a compostos que afetam o desenvolvimento estomático, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco de alvos com base na validação fenotípica em sistemas de estômatos agrupados.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de tecidos vegetais, técnica estéril e microscopia confocal.
- Depende do acesso a autoclave, câmaras de crescimento e microscópios a laser.
- Necessita padronização da esterilização de sementes e preparação do meio com sacarose entre as equipes.
- A adaptação a outras espécies ou tipos de tecidos pode exigir otimização da concentração de sacarose e do tempo de exposição.
- Limitado a fenótipos observáveis nos cotilédones; a ampliação para ensaios com plantas inteiras pode necessitar validação adicional.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:31
Preparation of 3% Sucrose Containing 1/2 Murashige-Skoog Medium Solution
1:12
Induction of Clustered Stomata by Sucrose-containing Medium Solution Immersion Treatment
2:30
Microscopic Observation of Clustered Stomata
3:15
Stomata Clustering Induced in A. thaliana Seedlings
4:06
Conclusion
