Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase
12 de fevereiro de 2019
Aqui descrevemos um protocolo para um método de pulso-perseguição geral que permite a análise cinética de dobramento, transporte e degradação de proteínas a serem seguidos em células vivas.
A perseguição radioativa de pulso usando 35 methionina e cistíne ainda é o único método bioquímico para investigar a biossíntese proteica com o tempo em células vivas. A biosíntese proteica abrange tanto a tradução, a dobra e a montagem, quanto o tráfico e a degradação. A combinação da perseguição de pulso radioativo com a análise de modificações proteicas de co-e pós-tradução, como a formação de vínculos de dissulfeto e acetilação fornece um ensaio sensível e quantitativo para investigar a fé da proteína com o tempo.
Um bom foco e manuseio experimental são necessários para este procedimento. Uma boa preparação é crucial, como tampões, seu espaço de trabalho radioativo e um cronograma claro. Este vídeo fornece uma visão clara sobre a visão do ombro do protocolo de perseguição de pulso radioativo.
Demonstrando o procedimento será Hui Ying Yeoh, um candidato a pHd do nosso laboratório. Para iniciar esse procedimento, transfeto de sementes e células culturais como descrito no protocolo de texto. Antes da perseguição de pulso, inspecione suas células através do microscópio.
Em seguida, lave os pratos com dois mililitros de tampão de lavagem. E dois mililitros de fome médio para as células e colocar os pratos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 15 minutos. Certifique-se de que sua perseguição de pulso está em ordem.
Transfira os pratos para os racks no banho de água, pré-aquecidos a 37 graus Celsius. Certifique-se de que os pratos estão em contato com a água, mas não flutue. Então, comece um temporizador.
Em 40 segundos, aspire o meio de fome. Usando uma micro pipeta, elave 600 microlitros de solução de pulso. Em exatamente um minuto, adicione suavemente a solução de pulso ao centro do prato.
Repita este processo de remoção do meio de fome e adicionar a solução de pulso para os pratos restantes em intervalos de um minuto. Exatamente em 11 minutos e para todos os pratos seguintes, de acordo com o esquema de perseguição de pulso, exceto para a amostra de perseguição de zero minuto, adicione dois mililitros de perseguição diretamente ao prato. Aspire o meio de perseguição e substitua-o por dois mililitros de meio de perseguição fresco.
Repita este processo para todos os pratos restantes em intervalos de um minuto. Quando o temporizador ler exatamente 16 minutos, adicione dois milicianos de meio de perseguição diretamente ao prato de perseguição de zero minuto, em cima do meio de pulso, para parar de rotular. Aspire imediatamente o meio.
Transfira o prato para uma placa de alumínio resfriado e adicione dois milicianos de tampão de parada gelada. Transfira todos os outros pratos para uma incubadora a 37 graus Celsius. Transfira cada prato de perseguição de volta da incubadora para o banho de água dois minutos antes do fim de cada tempo de perseguição.
Na hora exata de perseguição para cada prato, aspire o meio de perseguição e transfira o prato para uma placa de alumínio resfriado. Adicione dois mililitros de tampão de parada gelada. Deixe todos os pratos no gelo e pare o tampão até que haja tempo para lise as células.
Em seguida, aspire a solução stop e lave todos os pratos. Três ao mesmo tempo com dois mililitros de solução de parada gelada. Aspire completamente a solução stop e adicione 600 microliters de tampão de lise a dois pratos de cada vez.
Usando um raspador de célula, raspe bem a superfície do prato, mas delicadamente para misturar o lise. Transfira lysate de cada prato para um tubo fresco de micro centrífuga de 1,5 mililitro. Centrífuga a 15.000 a 20.000 G a 4 graus Celsius por 10 minutos para pelotar os núcleos.
Para a perseguição de pulso em células de suspensão, a coleta de 5 milhões de células por ponto de tempo em um tubo de 50 mililitros. Realize o procedimento de fome conforme descrito no texto. Após o procedimento de fome no banho de água por 15 minutos, inicie o temporizador.
Em exatamente um minuto, adicione 275 microcuries de etiqueta não diluída diretamente ao tubo contendo células e redemoinho para misturar. Em exatamente 11 minutos, adicione quatro mililitros de mídia de perseguição para parar a rotulagem. E transfira imediatamente um mililitro para um tubo de 15 mililitros no gelo que contém nove mililitros de solução de parada gelada para parar de rotular.
Repita este processo de transferência de um mililitro de perseguição para um tubo no gelo contendo nove mililitros de solução de parada para cada ponto de tempo de perseguição sucessivo. Após a imunoprecipitação, aspire a última lavagem completamente. Suspenda as contas em 20 microliters de tampão de TE e vórtice.
Adicione 20 microliters de dois buffer de amostra X sem o agente redutor. Vórtice as amostras e depois aquecê-las a 95 graus Celsius por cinco minutos. Vórtice as amostras novamente.
Centrífuga a 12.000 vezes G à temperatura ambiente por um minuto. Transfira 19 microlitadores do supernatante não reduzido para um tubo de microcentrifuuge fresco que contém um microliter de 500 mililitros DDT. Se necessário, centrifufique a amostra rapidamente para que todos os líquidos estejam na parte inferior.
E aqueça a 95 graus Celsius por cinco minutos. Deixe a amostra reduzida esfriar e, em seguida, vórtice. Centrifugar as amostras reduzidas e não reduzidas a 12.000 vezes G à temperatura ambiente por um minuto e, em seguida, adicionar 1,1 microliters de um BAfárário molar a todas as amostras.
Neste estudo, uma abordagem de perseguição de pulso radioativa é usada para analisar a dobra de proteínas e o transporte em células intactas. A dobra e secreção do HIV 1 GP120 de uma perseguição de pulso aderente é mostrada aqui. O gel não redutor mostra o dobrável oxidativo de GP120.
Imediatamente após a rotulagem de pulso, ele aparece como uma banda difusa mais alta no gel. À medida que a perseguição progride, a banda migra para baixo do gel através de intermediários dobráveis ainda mais difusos até que se acumula na faixa apertada que representa nativamente dobrada no GP120. Isso ocorre à medida que a formação de ligações de dissulfeto aumenta a compactação da proteína, fazendo com que ela migrem mais rápido do que a proteína totalmente reduzida.
No gel redutor, as ligações de dissulfeto e todas as moléculas foram reduzidas e não afetam a mobiilty. Como tal, as diferenças de mobilidade são apenas o resultado de mudanças na massa molecular. A mudança ao longo do tempo da forma de peptídeo de sinal reduzido para a forma reduzida de peptídeo de sinal cleaved representa o decote de peptídeo de sinal pós-translacional de GP120.
A mobilidade aumenta devido à perda do peptídeo de sinal que aumenta durante a perseguição à medida que mais proteínas atingem a dobra nativa e perdem seu peptídeo de sinal. Tanto no gel não redutor quanto na redução, o sinal começa a diminuir a partir de aproximadamente uma hora devido à secreção do GP120. Isso pode ser monitorado analisando a mídia.
Este método é aplicável a qualquer linha celular, incluindo modelos de células organoides. Mas o sucesso depende muito do nível de expressão da proteína de interesse. Antes de iniciar este procedimento, marque seus pratos e mantenha esta ordem durante todo o experimento.
Certifique-se de que tudo esteja preparado antes de adicionar meio de fome. Este é o começo do experimento. E seu tempo de laboratório é seu amigo, mas pode ser seu maior inimigo quando você não está preparado.
A perseguição de Bill pode ser combinada com proteólise limitada para investigar toda a propriedade de proteínas com o tempo. Além disso, diferentes métodos de freezers eleitos permitirão a análise de enxágüe ou rigormorização ou diferenças de carga. Para proteger o pesquisador e o aparelho, todas as regras locais de segurança da radiação devem ser obedecidas.
E medidas protetivas devem ser tomadas de acordo com o protocolo. Note que sua acrilamida, usada para sua página STH, é neurotóxica.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para um método de pulso e rastreamento radioativo utilizando metionina e cisteína marcadas com 35S para analisar a biossíntese de proteínas em células vivas. O método permite a análise cinética da dobragem, transporte e degradação de proteínas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Bioquímica
Antecedentes
- A biossíntese de proteínas envolve tradução, dobramento, montagem, tráfego e degradação.
- O método radioativo de pulso e chaser é um ensaio sensível e quantitativo.
- Modificações co e pós-traducionais, como a formação de ligações dissulfeto e acetilação, podem ser analisadas.
- Um bom manuseio e preparação experimentais são cruciais para a execução bem-sucedida.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para o estudo da dinâmica de proteínas em células vivas.
- Aprimorar a compreensão da biossíntese proteica ao longo do tempo.
- Demonstrar a aplicação do método pulso-afastamento em pesquisas biológicas.
Métodos Utilizados
- Marcação radioativa de proteínas utilizando metionina e cisteína com 35S.
- Técnica de pulso-afunilamento para rastrear a síntese e degradação de proteínas.
- Análise de modificações proteicas durante a biossíntese.
- Configuração experimental incluindo preparo de tampões e do ambiente de trabalho com materiais radioativos.
Principais Resultados
- Rastreamento bem-sucedido da dobragem e degradação de proteínas em células vivas.
- Demonstração da sensibilidade do método para detectar modificações proteicas.
- Visualização clara do protocolo de pulso-encerramento por meio de demonstração em vídeo.
- Informações sobre a cinética dos processos de biossíntese proteica.
Conclusões
- O método radioativo de pulso e chaser é eficaz para estudar a dinâmica de proteínas.
- Preparo e foco são essenciais para resultados experimentais bem-sucedidos.
- Este protocolo pode ser uma ferramenta valiosa para pesquisadores em biologia celular e bioquímica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise radioativa de pulso e marcação permite que equipes de biofármacos desvendem a cinética de dobramento, tráfego e degradação de proteínas em células vivas, fornecendo informações essenciais sobre a maturação e estabilidade proteica. Este método reforça a confiança preditiva na validação de alvos ao revelar a sequência temporal de modificações pós-traducionais e mudanças conformacionais. Sua adaptabilidade entre diferentes classes proteicas e sistemas celulares o posiciona como uma ferramenta fundamental para a descoberta inicial e a redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento de biológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação cinética da dobragem e maturação de proteínas em sistemas fisiologicamente relevantes.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao mapear modificações co- e pós-traducionais ao longo do tempo.
- Facilita a validação funcional de alvos ao acompanhar o destino da proteína desde a síntese até a degradação.
- Fornece dados quantitativos para orientar a confiança preditiva e o triagem de alvos candidatos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas celulares validados para triagem subsequente de moduladores de dobramento, tráfego ou degradação.
- Fornece leituras reprodutíveis e resolvidas no tempo para padronização e otimização de ensaios.
- Permite avaliação quantitativa do processamento proteico adequada para adaptação em triagem de alto conteúdo.
- Permite reutilização da plataforma em diversas classes proteicas e modelos celulares.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha dados de dobramento e modificação in vitro com a cinética em células para o desenvolvimento de biomarcadores traducionais.
- Proporciona continuidade desde estudos mecanicistas em fase de descoberta até a validação pré-clínica da estabilidade e processamento de proteínas.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco ao revelar vias de degradação e perfis de secreção.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se na interface entre a fase inicial de descoberta e a identificação de compostos líderes, conectando estudos mecanicistas com a validação em modelos pré-clínicos para terapêuticas baseadas em proteínas.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre mecanismos de maturação, tráfego e degradação de proteínas.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Oferece medições com resolução temporal de intermediários de dobramento e modificações pós-traducionais.
- Pesquisa Translacional: Permite alinhar dados de processamento celular com modelos relevantes para doenças, quando apoiado por sistemas de expressão.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a uma ampla gama de proteínas e tipos celulares, apoiando estudos mecanicistas em toda a carteira.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e reduz a ambiguidade mecanicista na maturação proteica.
- Valor Operacional: Padroniza a análise cinética do processamento proteico com alta reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção e reduz riscos biológicos em estágios avançados para terapêuticos proteicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos biológicos com base em perfis de dobramento e degradação.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em marcação com radioisótopos, cultura celular e bioquímica de proteínas.
- Exige acesso a infraestrutura para manipulação de materiais radioativos e conformidade com protocolos de segurança.
- Necessita de preparação experimental rigorosa e controle temporal para reprodutibilidade.
- Adaptável a diversas linhagens celulares, incluindo modelos de organoides, mas dependente dos níveis de expressão proteica.
- Limitado pela necessidade de anticorpos específicos para conformações proteicas e sistemas de detecção apropriados.
