Name: Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprenda o método de pulso-perseguição radioativo para analisar síntese, transporte e degradação de proteínas em células vivas usando metionina e cisteína marcadas com 35S. Esta técnica sensível permite estudar a dinâmica proteica ao longo do tempo.

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Os autores agradecer todos os membros do laboratório Braakman, passado e presente, para suas discussões frutuosos e ajudam a desenvolver os métodos apresentados neste artigo. Este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito sétimo programa-quadro (FP7/2007-2013) N ° da União Europeia 235649 e Holanda organização de científico pesquisa (NWO) sob o eco-programa N ° 711.012.008.

Todos os reagentes radioativos e procedimentos foram tratados em conformidade com os regulamentos e regras locais de radiação de Universidade de Utrecht.
1. pulso Chase
<ol><li>
Perseguição de pulso para células aderentes Nota: Os volumes dados aqui baseiam-se em pratos de cultura de células de 60 mm. Para 35mm ou pratos de 100 milímetros, multiplique os volumes por 1/2 ou 2, respectivamente. Este protocolo usa um tempo de pulso de 10 min e chase vezes de 0, 15, 30, 60, 120 e 240 min. Estas podem ser variadas dependendo as proteínas específicas estudadas (discutidas abaixo).<ol>
<li>Semente células aderentes (por exemplo, HEK 293, HeLa, CHO) em seis pratos de cultura de células de 60 mm, para que eles sejam subconfluent (80-90%), no dia da perseguição pulso. Use pelo menos um prato por ponto de tempo e/ou condição.</li>
		<li>Se necessário, transfect as células com reagentes de transfecção comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante; ou, Viralmente transduce8 células 1 dia antes do pulso-perseguição experimentarem com a construção adequada para a expressão.</li>
		<li>Lavar a louça com 2 mL de tampão de lavagem (Hank está equilibrada solução salina [HBSS]), adicione 2 mL do meio de inanição (normal meio de cultura falta de metionina e cisteína e soro bovino fetal [FBS], como meio essencial mínimo [MEM] sem metionina e cisteína Mas com 10 mM HEPES, pH 7,4) e colocar os pratos numa incubadora umidificado de 37 ° C com 5% de CO2 por 15 min.</li>
		<li>Transferi os pratos para as prateleiras em um banho de água escaldadas 37 ° C para que eles estejam em contacto com água, mas não flutuar. Inicie um timer.</li>
		<li>Em 40 s, Aspire o meio de inanição, elaborar 600 µ l da solução de pulso (fome media + 55 prato µCi/35 milímetros rótulo, consulte a observação anterior etapa 1.1.1) dentro da pipeta e adicioná-lo suavemente para o centro do prato em exatamente 1 min. Repita este passo em intervalos de 1 min para t pratos restantes. Comece com a amostra de perseguição mais longa para economizar tempo durante seu experimento. Nota: Ao manusear material radioativo, é essencial seguir as precauções apropriadas e regras locais e regulamentos para prevenir exposição acidental e/ou contaminação.</li>
		<li>A exatamente 11 min e para todos os seguintes pratos, exceto para a amostra de perseguição min 0, adicionar 2 mL do meio de perseguição diretamente ao prato, Aspire- e novamente, adicionar 2 mL do meio de perseguição. Repita este passo em intervalos de 1 min para os pratos restantes. Transferi todos os pratos para uma incubadora de 37 ° C.</li>
		<li>A exatamente 16 min, adicione 2 mL do meio de perseguição (meio de cultura normal + 10 mM HEPES [pH 7,4], cisteína de 5 mM e 5 mM metionina) diretamente para o prato de amostra 0 min em cima o meio de pulso para impedir a rotulagem; em seguida, Aspire imediatamente, transferir a cápsula para uma placa de alumínio refrigerado e adicionar 2 mL de tampão de parada gelada (HBSS + 20 mM N- proteÃ [NEM]). Nota: Esta é a amostra de perseguição 0 min. Para este exemplo, vá direto ao passo 1.1.9.</li>
		<li>Cada prato de perseguição de transferência para o banho de água a 2 min antes de cada tempo de perseguição (por exemplo, 24 min. para uma perseguição de 15 min) e, no assunto exato momento (por exemplo, 26 min. para uma perseguição de 15 min), aspirar a mídia de perseguição (ou transferi-lo para um tubo de microcentrifugadora se seguindo pr secreção de otein) e transferir a cápsula para uma placa de alumínio refrigerado. Adicione 2 mL de tampão de parada gelada.</li>
		<li>Incubar os pratos no gelo no buffer de paragem para ≥ 5 min; em seguida, Aspire a solução stop e lave-a com 2 mL de solução de paragem gelada. Aspire a lavagem e lyse pratos com 600 µ l de tampão de lise (tampão fosfato salino [PBS] + detergente nondenaturing [ver Tabela de materiais] + inibidores da protease + 20 mM NEM). Use um raspador de célula para garantir que os pratos lysed quantitativamente.</li>
		<li>Transfira o lisado no tubo de 1,5 mL microcentrifuga e centrifugação por 10min a 15.000-20.000 x g e 4 ° C para os núcleos de Pelotas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Perseguição de pulso para suspensão de células Nota: Para garantir a eficiente rotulação, células devem ser pulsadas em uma concentração de 3 x 106 a 5 x 106 células/mL, e volumes de perseguição devem ser 4 vezes o volume do pulso. No exemplo a seguir, nós pulsada 5 x 106 células em um volume de 1 mL para 10 min, para produzir cinco chase tempo pontos (0, 15, 30, 60 e 120 min) de 1 mL, contendo 1 x 106 células por ponto de tempo. Todas as soluções são as mesmas do ponto 1.1.<ol>
<li>Cultura das células de suspensão (por exemplo, 3T3, Jurkat) de acordo com um protocolo previamente publicado9 para que haja um número suficiente de células no momento da experiência, pelo menos, 1 x 106 células por tempo apontam e/ou condição.</li>
		<li>Se necessário, transfect células com reagentes de transfecção comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante, ou transduce Viralmente8 células 1 dia antes do pulso-perseguição experimentarem com a construção adequada para a expressão.</li>
		<li>5 x 106 células por condição em um tubo de 50 mL durante 5 min à x 250 g à temperatura de Pelotas, lavá-los 1 x 5 ml de mídia de fome, de pelotas-los novamente e ressuspendê-los em 1 mL de mídia de fome.</li>
		<li>Transferir as células para banho maria a 37 ° C e incube-os para 10-25 min. agitar os tubos de cada 10-15 min para impedir que as células fixando-se na parte inferior.</li>
		<li>Inicie o temporizador. Em exatamente 1 minuto, adicionar µCi 275 (55 µCi/1 x 106 células) do rótulo não diluído diretamente para o tubo contendo células e agitar. Nota: Ao manusear material radioativo, é essencial seguir as precauções apropriadas e regras locais e regulamentos para prevenir exposição acidental e/ou contaminação.</li>
		<li>Exatamente 11 min, pare de rotulagem adicionando 4 mL de mídia de perseguição. Misturar a amostra e imediatamente transfira 1 mL para um tubo de 15 mL no gelo, contendo 9 mL de solução de paragem gelada. Nota: Esta é a amostra de perseguição 0 min.</li>
		<li>Repita essas etapas para cada ponto de tempo sucessivos. Uma vez que todos os pontos de tempo são coletados, pelota as células por 5 min a 250 x g a 4 ° C. Aspire o meio (ou transferi-lo para um novo tubo de 15 mL se você seguir a secreção de proteínas). Lavar as células com 5 mL de solução de paragem e de pelotas as células por 5 min a 250 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Aspirar a solução stop, completamente lisar as células com 300 µ l de tampão de Lise gelada e incube-os por 20 min no gelo para garantir uma lise completa. Transfira o lisado para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e centrifugar durante 10 minutos a 15.000-20.000 x g a 4 ° C para os núcleos de Pelotas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. a imunoprecipitação
<ol><li>Combinar o anticorpo (veja a discussão) e 50 µ l de grânulos imunoprecipitação (por exemplo, a proteína um Sepharose) (suspensão de 10% [v/v] em lise + 0,25% albumina de soro bovino [BSA]) numa microcentrifuga tubo e incube-os a 4 ° C ~ 30 min em uma coqueteleira.</li>
	<li>Os grânulos por 1 min a 12.000 x g , à temperatura de pelotas e aspirar o sobrenadante. Adicionar 200 µ l de lisado para a mistura de anticorpo-grânulo e incubar a 4 ° C em uma coqueteleira para 1h ou cabeça-sobrecabeça se requer a imunoprecipitação > 1 h.</li>
	<li>Granule os grânulos por 1 min a 12.000 x g , à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e adicionar 1 mL de tampão de lavagem da imunoprecipitação. Coloca a amostra em um shaker em temperatura ambiente por 5 min.</li>
	<li>Os grânulos de Pelotas, conforme descrito na etapa 2.3 e repita a lavagem 1X. Em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender as contas em 20 µ l de tampão TE, pH 6,8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). A amostra de vórtice.</li>
	<li>Adicionar 20 µ l de 2x do amortecedor da amostra sem o agente redutor, vórtice, aqueça-a durante 5 min à 95 ° C e o vórtice novamente. Nota: se apenas preparar amostras redutoras, 2 µ l de 500 mM DTT deve ser adicionado neste ponto. Em seguida, prossiga para a etapa 2.7.</li>
	<li>Conforme descrito na etapa 2.3, Granule os grânulos. Transferir a 19 µ l do sobrenadante nonreduced para um tubo de microcentrifugadora fresco contendo 1 µ l de 500 mM DTT, centrifugar a amostra e o vórtice antes aquecendo-a novamente por 5 min a 95 ° C.</li>
	<li>Girar a amostra por 1 min a 12.000 x g; Esta é a amostra reduzida. Resfriá-lo até a temperatura ambiente e adicionar 1.1 µ l de 1 M, NEM para a redução e a amostra nonreduced. Vórtice e spin-down as amostras.</li>
</ol>3. SDS-PAGE
<ol><li>Primeiro, determine a SDS-PAGE resolução gel de percentagem adequada para a proteína de interesse. Por exemplo, o HIV-1 gp120, quando deglycosylated, é executado em ~ 60 kDa e é analisado em um gel de 7,5%.</li>
	<li>Prepare a mistura de gel de resolução sem TEMED de acordo com as instruções do fabricante (x % do acrilamido, 375 mM Tris-HCl [pH 8.8,] 0,1% SDS [w/v] e 0,05% persulfato de amónio [APS] [w/v]) e desgaseificar sob vácuo para > 15 min. Enquanto a mistura de gel é a desgaseificação, cuidadosamente Limpe as placas de vidro de gel com 70% de etanol e fiapos de tecidos e colocá-los em um aparelho de fundição.</li>
	<li>Adicionar TEMED para a mistura de gel de resolução (em uma concentração final de 0.005% [v/v]), homogeneizar e pipetar entre placas de vidro, deixando espaço de ~1.5 cm para o gel de empilhamento. Cuidadosamente, sobrepor o gel com desionizada H2O ou isopropanol e deixá-lo para polimerizar.</li>
	<li>Uma vez que o gel de resolução tem polimerizado, preparar a mistura de gel de empilhamento (4% acrilamida, 125 mM Tris-HCl [pH 6,8], 0,1% SDS [w/v] e 0.025% APS [w/v]).</li>
	<li>Lave a parte superior do gel resolvendo com desionizada H2O e, em seguida, remova toda a água. Nota: Utilize papel de filtro para remover as últimas gotas.</li>
	<li>Adicionar TEMED para a mistura de gel de empilhamento (0.005% [v/v]), misture bem e o gel de resolução com gel de empilhamento de sobreposição e inserir um pente 15-bem. Uma vez que o gel de empilhamento tem polimerizado, transferi-lo para uma câmara de execução e encher as câmaras superiores e inferiores com executando o tampão (25 mM Tris-HCl, glicina 192mm [pH 8.3] e 0,1% SDS [w/v]).</li>
	<li>Carrega 10 µ l de amostra por lane em um minigel 15 faixas. Evitar carregar as amostras na primeira e a última pista no gel e carregar o amortecedor da amostra os em todas as faixas vazias para evitar que o sorriso de bandas. Execute o gel constante um 25 mA/gel até a frente do corante é na parte inferior do gel.</li>
	<li>Retire o gel as chapas de vidro, manchar o gel com solução de proteína-coloração (ácido acético a 10% e 30% de metanol em H2O + 0,25% brilhante azul R250 [w/v]) por 5 min com agitação e em seguida, destain por 30 min com descoloração (coloração de solução solução sem R250 azul brilhante).</li>
	<li>Organize os géis de face para baixo sobre um plástico enrole e, em seguida, coloque o papel de cromatografia de 0.4 mm em cima deles. Coloque o gel de sanduíche cromatografia em papel-lado para baixo em um gel secador. Seguindo as instruções do fabricante, secar o gel para 2 h a 80 ° C.</li>
	<li>Transferir os géis secos para uma gaveta e sobrepô-los com tela de cinema ou fósforo autoradiografia. Se usando a película de autoradiografia, esta etapa deve ser realizada em um quarto escuro.</li>
</ol>

<ol><li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li>
<li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+Questions+%28with+their+Answers%29+on+ER-Associated+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li>
<li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System%3A+The+Calnexin+Binding+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067(2017).</li>
<li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li>
<li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li>
<li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698(2016).</li>
<li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li>
<li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li>
<li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li>
<li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Hsp47%2C+Grp78%2C+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li>
<li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458(2010).</li>
<li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li>
<li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li>
<li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Pulso-perseguição métodos têm sido essenciais para o desenvolvimento da compreensão dos cientistas de proteína nas células intactas de dobramento. Enquanto tentamos fornecer um método que é tão geral quanto possível, esta abordagem tem o potencial para variações quase ilimitadas estudar vários processos que ocorrem durante o dobramento, o transporte e a vida das proteínas dentro da célula.
Ao realizar uma perseguição de pulso usando células aderentes em pratos, é essencial para tratar cada pra...

A dobradura do mesmo relativamente simples proteínas envolve muitas enzimas diferentes de dobramento moleculares chaperones e modificações covalentes1. Uma reconstituição completa destes processos em vitro é praticamente impossível, dado o vasto número de diferentes componentes envolvidos. Portanto, é altamente desejável, para estudar a proteína dobra na vivo, em células vivas. Técnicas de pulso-perseguição radioativo provam uma poderosa ferramenta para estudar a síntese, dobradura, transporte e degradação de proteínas em seu ambiente natural.
A metabólica rotulagem de proteínas durante um curto pulso com 35S-rotulado metionina/cisteína, seguido de uma perseguição na ausência de um marcador radioativo, permite o acompanhamento específico de uma população de proteínas recém sintetizadas no meio de uma maior celular. Em seguida, proteínas alvo podem ser isolado através de imunoprecipitação e analisaram através de SDS-PAGE ou outras técnicas. Para muitas proteínas, sua viagem através da célula é marcada por modificações visíveis no gel de SDS-PAGE. Por exemplo, o transporte de proteínas glicosilados de retículo endoplasmático (ER) para o complexo de Golgi é muitas vezes acompanhado por modificações de N-ligados os glicanos ou a adição de O-ligados os glicanos2,3. Essas modificações causam grandes aumentos na massa molecular aparente, que pode ser vista por alterações de mobilidade em SDS-PAGE. Maturação também pode ser marcada por clivagens proteolíticas, tais como o peptídeo sinal clivagem ou a remoção de pro-peptídeos, resultando em mudanças na massa molecular aparente que possa ser seguido facilmente em gel de SDS-PAGE4. Radioactividade tem consideráveis vantagens sobre técnicas comparáveis como perseguições de cicloheximida, onde síntese proteica romance é impedida, como tratamentos mais longos são tóxicos para as células e não excluem a maioria das proteínas mais velhas, de estado estacionário do análise, como algumas proteínas têm meias-vidas de dias. A comparação de proteínas sob ambos os e reduzir as condições permite a análise da formação de ligação dissulfeto, um passo importante para a dobradura de muitas proteínas secretoras4,5,6, 7.
Aqui nós descrevemos um método geral para a análise de proteínas e transporte nas células intactas, usando uma abordagem de pulso-perseguição radioativo. Enquanto nós ter mirado para fornecer o método como detalhada quanto possível, o protocolo tem um potencial quase ilimitado para adaptabilidade e permitirá otimização estudar proteínas específicas de cada leitor.
São fornecidos dois protocolos alternativos de pulso-perseguição, um para as células aderentes (etapa 1.1 do protocolo aqui apresentado) e outra para células de suspensão (etapa 1.2 do protocolo aqui apresentado). As condições fornecidas aqui são suficientes para visualizar uma proteína expressada com níveis de médio a alto-expressão. Se o leitor está trabalhando com proteínas mal expressas ou várias condições pós-tratamento, como moleculas múltiplas, é necessário aumentar o tamanho do prato ou número de células adequadamente.
Para perseguição de pulso de suspensão, as amostras de perseguição em cada ponto de tempo são todos retiradas um único tubo de células. As etapas de lavagem após o pulso são omitidos; em vez disso, mais incorporação de 35S é evitada pela diluição com um elevado excesso de sem rótulo de metionina e cisteína.
Os protocolos apresentados usam radioativo 35S-rotulado cisteína e metionina para acompanhar os processos de enrolamento de proteínas celulares. Todas as operações com reagentes radioativos devem ser realizadas utilizando medidas de proteção adequadas para minimizar a exposição do operador e o ambiente de radiação radioativa e ser realizada em um laboratório designado. Como o pulso-chase rotulando técnica é relativamente ineficaz em momentos de pulso curto (< 15min), menos de 1% do montante inicial da radioatividade é incorporado em proteínas recém sintetizadas. Após o enriquecimento da proteína do alvo através da imunoprecipitação, a amostra para SDS-PAGE contém menos de 0,05% do montante inicial da radioactividade.
Embora a 35S metionina e cisteína, mistura de rotulagem é estabilizado, uma decomposição, produzindo compostos voláteis radioactivos, ocorrerá. Para proteger o pesquisador e o aparelho, devem ser tomadas algumas precauções. O pesquisador deve sempre obedecer as regras de segurança de radiação local e pode usar um carvão enfermagem máscara, além de um jaleco e luvas (duplas). Frascos de estoque com 35S metionina e cisteína sempre devem ser abertos em uma coifa, ou sob um ponto de aspiração local. Pontos de contaminação do laboratório conhecidos são centrífugas, pipetas, banhos de água, incubadoras e agitadores. A contaminação destas áreas é reduzida pelo uso de pontas de pipetas com um filtro de carvão, positivo-selo microcentrifuga tubos (ver Tabela de materiais), esponjas de aquário carvão em papéis de filtro água banhos, carvão colados nos pratos, pulso-perseguição guarda do carvão vegetal no sistema de aspiração e o posicionamento dos pratos contendo grãos de carvão em incubadoras e recipientes de armazenamento.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga safeseal de 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.400</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td>glacial ácido acético</td></tr><tr><td>BAS Tela de fósforo de armazenamento 20x25 cm</td><td>GE Life Sciences</td><td>28956475</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td>Grau de biologia molecular</td></tr><tr><td>Carestream Biomax MR filmes</td><td>Kodak</td><td>Z350370-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Meios de cultura celular</td><td>Vários</td><td>N/A</td><td>Meios de cultura de células normais para linhagens celulares específicas utilizadas</td></tr><tr><td>Meios de cultura celular, sem metionina/cisteína</td><td>Vários</td><td>N/A</td><td>Mesma formulação de meios que os meios de cultura normais, por exemplo, DMEM/MEM/RPMI, sem metionina e cisteína</td></tr><tr><td>Papel de filtro de carvão</td><td>O que é</td><td>1872047</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta filtradas com carvão</td><td>Molecular bioproducts</td><td>5069B</td><td></td></tr><tr><td>Carvão vacu-guard</td><td>Whatman</td><td>67221001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Sigma</td><td>112,553</td><td>para eletroforese</td></tr><tr><td>Cisteína</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td>Grau de biologia molecular, Faça estoque de 500 mM, armazene a -20&nbsp;</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>Grau de biologia molecular</td></tr><tr><td>EasyTag Express35S Mistura de rotulagem de proteínas</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772014MC</td><td>Outros lotes de tamanho de rótulo estão disponíveis dependendo do uso</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E1644</td><td>Grau de biologia molecular</td></tr><tr><td>Equipamento de secagem em gel</td><td>Vários</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Papel</td></tr> para <tr><td>cromatografia</td> de grau 3 de biologia molecular <td>GE Life Sciences</td><td>3003-917</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes lenços delicados</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M3671</td><td>Grau de biologia molecular</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>MX0490&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metionina</td><td>Sigma</td><td>M5308</td><td>Grau de biologia molecular, Faça estoque de 250 mM, armazene em -20</td></tr><tr><td>Minigel equipamento de fundição / funcionamento</td><td>Vários</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Grau de biologia molecular</td></tr><tr><td>N-etilmaleimida</td><td>Sigma</td><td>E3876</td><td>Grau de biologia molecular, Faça estoque de 1M em 100% etanol, armazene em -20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td>Proteína de grau</td></tr> de biologia molecular A <tr><td>Sepharose fastflow grânulos</td><td>GE cuidados de saúde 17-5280-04</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)</td> <td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Grau de biologia molecular</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Grau de biologia molecular</td></tr><tr><td>Base Trizma (Tris)</td> <td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Grau de biologia molecular</td></tr><tr><td>Typhoon IP Gerador de imagens biomolecular</td><td>Amersham</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>Unwire Rack de tubos de ensaio 20 mm para banho-maria</td><td>Nalgene</td><td>5970-0320PK</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo chase

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Pulso-perseguição radioativo rotulagem é uma poderosa ferramenta para estudar a maturação conformacional, o transporte para sua localização celular funcional e a degradação de proteínas do alvo em células vivas. Com curto (pulso) radioativos vezes (< 30 min) e rigidamente controlado tempos de perseguição, é possível rotular apenas uma pequena fração da piscina proteína total e siga sua dobradura. Quando combinado com os/redução electroforese do gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e imunoprecipitação com anticorpos (conformação específicos), processos de dobramento pode ser examinado em grande detalhe. Este sistema tem sido usado para analisar o dobramento de proteínas com uma enorme variação nas propriedades, tais como proteínas solúveis, proteínas transmembrana única e multi-pass, fortemente glicosilados N - e O proteínas e proteínas com e sem bissulfeto de extensivo criar laços. Pulso-perseguição métodos são a base de estudos cinéticos em uma gama de recursos adicionais, incluindo co - e modificações do posttranslational oligomerização e polimerização, essencialmente, permitindo a análise de uma proteína desde o nascimento até a morte. Estudos de pulso-perseguição no enrolamento de proteínas são complementares com outros métodos de bioquímicos e biofísicos para estudar proteínas em vitro , fornecendo informações fisiológicas e maior resolução temporal. Os métodos descritos dentro deste papel adaptam-se facilmente para estudar o dobramento de quase qualquer proteína que pode ser expressa em sistemas de mamíferos ou inseto-célula.

O dobramento e a secreção de HIV-1 gp120 de uma perseguição de pulso aderentes é mostrado na Figura 2. O gel os (NR de células na figura) mostra o dobramento oxidativo da gp120. Imediatamente após o pulso de rotulagem da gp120 5 min (0 min perseguição) aparece como uma banda difusa superior no gel, e no decorrer do assunto, a banda migra para baixo o gel através de ainda mais difundida dobradura intermediários (IT), até que se acumula na banda apertada (NT) I...

Aqui descrevemos um protocolo para um método de pulso-perseguição geral que permite a análise cinética de dobramento, transporte e degradação de proteínas a serem seguidos em células vivas.

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

A perseguição radioativa de pulso usando 35 methionina e cistíne ainda é o único método bioquímico para investigar a biossíntese proteica com o tempo em células vivas. A biosíntese proteica abrange tanto a tradução, a dobra e a montagem, quanto o tráfico e a degradação. A combinação da perseguição de pulso radioativo com a análise de modificações proteicas de co-e pós-tradução, como a formação de vínculos de dissulfeto e acetilação fornece um ensaio sensível e quantitativo para investigar a fé da proteína com o tempo.Um bom foco e manuseio experimental são necessários para este procedimento. Uma boa preparação é crucial, como tampões, seu espaço de trabalho radioativo e um cronograma claro. Este vídeo fornece uma visão clara sobre a visão do ombro do protocolo de perseguição de pulso radioativo.Demonstrando o procedimento será Hui Ying Yeoh, um candidato a pHd do nosso laboratório. Para iniciar esse procedimento, transfeto de sementes e células culturais como descrito no protocolo de texto. Antes da perseguição de pulso, inspecione suas células através do microscópio.Em seguida, lave os pratos com dois mililitros de tampão de lavagem. E dois mililitros de fome médio para as células e colocar os pratos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 15 minutos. Certifique-se de que sua perseguição de pulso está em ordem.Transfira os pratos para os racks no banho de água, pré-aquecidos a 37 graus Celsius. Certifique-se de que os pratos estão em contato com a água, mas não flutue. Então, comece um temporizador.Em 40 segundos, aspire o meio de fome. Usando uma micro pipeta, elave 600 microlitros de solução de pulso. Em exatamente um minuto, adicione suavemente a solução de pulso ao centro do prato.Repita este processo de remoção do meio de fome e adicionar a solução de pulso para os pratos restantes em intervalos de um minuto. Exatamente em 11 minutos e para todos os pratos seguintes, de acordo com o esquema de perseguição de pulso, exceto para a amostra de perseguição de zero minuto, adicione dois mililitros de perseguição diretamente ao prato. Aspire o meio de perseguição e substitua-o por dois mililitros de meio de perseguição fresco.Repita este processo para todos os pratos restantes em intervalos de um minuto. Quando o temporizador ler exatamente 16 minutos, adicione dois milicianos de meio de perseguição diretamente ao prato de perseguição de zero minuto, em cima do meio de pulso, para parar de rotular. Aspire imediatamente o meio.Transfira o prato para uma placa de alumínio resfriado e adicione dois milicianos de tampão de parada gelada. Transfira todos os outros pratos para uma incubadora a 37 graus Celsius. Transfira cada prato de perseguição de volta da incubadora para o banho de água dois minutos antes do fim de cada tempo de perseguição.Na hora exata de perseguição para cada prato, aspire o meio de perseguição e transfira o prato para uma placa de alumínio resfriado. Adicione dois mililitros de tampão de parada gelada. Deixe todos os pratos no gelo e pare o tampão até que haja tempo para lise as células.Em seguida, aspire a solução stop e lave todos os pratos. Três ao mesmo tempo com dois mililitros de solução de parada gelada. Aspire completamente a solução stop e adicione 600 microliters de tampão de lise a dois pratos de cada vez.Usando um raspador de célula, raspe bem a superfície do prato, mas delicadamente para misturar o lise. Transfira lysate de cada prato para um tubo fresco de micro centrífuga de 1,5 mililitro. Centrífuga a 15.000 a 20.000 G a 4 graus Celsius por 10 minutos para pelotar os núcleos.Para a perseguição de pulso em células de suspensão, a coleta de 5 milhões de células por ponto de tempo em um tubo de 50 mililitros. Realize o procedimento de fome conforme descrito no texto. Após o procedimento de fome no banho de água por 15 minutos, inicie o temporizador.Em exatamente um minuto, adicione 275 microcuries de etiqueta não diluída diretamente ao tubo contendo células e redemoinho para misturar. Em exatamente 11 minutos, adicione quatro mililitros de mídia de perseguição para parar a rotulagem. E transfira imediatamente um mililitro para um tubo de 15 mililitros no gelo que contém nove mililitros de solução de parada gelada para parar de rotular.Repita este processo de transferência de um mililitro de perseguição para um tubo no gelo contendo nove mililitros de solução de parada para cada ponto de tempo de perseguição sucessivo. Após a imunoprecipitação, aspire a última lavagem completamente. Suspenda as contas em 20 microliters de tampão de TE e vórtice.Adicione 20 microliters de dois buffer de amostra X sem o agente redutor. Vórtice as amostras e depois aquecê-las a 95 graus Celsius por cinco minutos. Vórtice as amostras novamente.Centrífuga a 12.000 vezes G à temperatura ambiente por um minuto. Transfira 19 microlitadores do supernatante não reduzido para um tubo de microcentrifuuge fresco que contém um microliter de 500 mililitros DDT. Se necessário, centrifufique a amostra rapidamente para que todos os líquidos estejam na parte inferior.E aqueça a 95 graus Celsius por cinco minutos. Deixe a amostra reduzida esfriar e, em seguida, vórtice. Centrifugar as amostras reduzidas e não reduzidas a 12.000 vezes G à temperatura ambiente por um minuto e, em seguida, adicionar 1,1 microliters de um BAfárário molar a todas as amostras.Neste estudo, uma abordagem de perseguição de pulso radioativa é usada para analisar a dobra de proteínas e o transporte em células intactas. A dobra e secreção do HIV 1 GP120 de uma perseguição de pulso aderente é mostrada aqui. O gel não redutor mostra o dobrável oxidativo de GP120.Imediatamente após a rotulagem de pulso, ele aparece como uma banda difusa mais alta no gel. À medida que a perseguição progride, a banda migra para baixo do gel através de intermediários dobráveis ainda mais difusos até que se acumula na faixa apertada que representa nativamente dobrada no GP120. Isso ocorre à medida que a formação de ligações de dissulfeto aumenta a compactação da proteína, fazendo com que ela migrem mais rápido do que a proteína totalmente reduzida.No gel redutor, as ligações de dissulfeto e todas as moléculas foram reduzidas e não afetam a mobiilty. Como tal, as diferenças de mobilidade são apenas o resultado de mudanças na massa molecular. A mudança ao longo do tempo da forma de peptídeo de sinal reduzido para a forma reduzida de peptídeo de sinal cleaved representa o decote de peptídeo de sinal pós-translacional de GP120.A mobilidade aumenta devido à perda do peptídeo de sinal que aumenta durante a perseguição à medida que mais proteínas atingem a dobra nativa e perdem seu peptídeo de sinal. Tanto no gel não redutor quanto na redução, o sinal começa a diminuir a partir de aproximadamente uma hora devido à secreção do GP120. Isso pode ser monitorado analisando a mídia.Este método é aplicável a qualquer linha celular, incluindo modelos de células organoides. Mas o sucesso depende muito do nível de expressão da proteína de interesse. Antes de iniciar este procedimento, marque seus pratos e mantenha esta ordem durante todo o experimento.Certifique-se de que tudo esteja preparado antes de adicionar meio de fome. Este é o começo do experimento. E seu tempo de laboratório é seu amigo, mas pode ser seu maior inimigo quando você não está preparado.A perseguição de Bill pode ser combinada com proteólise limitada para investigar toda a propriedade de proteínas com o tempo. Além disso, diferentes métodos de freezers eleitos permitirão a análise de enxágüe ou rigormorização ou diferenças de carga. Para proteger o pesquisador e o aparelho, todas as regras locais de segurança da radiação devem ser obedecidas.E medidas protetivas devem ser tomadas de acordo com o protocolo. Note que sua acrilamida, usada para sua página STH, é neurotóxica.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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