Name: Usando Microarrays para interrogar o impacto microambiental em phenotypes celulares no cancro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprenda a fabricar microarrays de microambiente (MEMA) para estudar fenótipos celulares em câncer usando impressoras de pinos. Esta plataforma simplifica a identificação de fatores que influenciam o comportamento tumoral.

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Este trabalho foi apoiado pela biblioteca de fundos comuns da NIH de assinaturas de rede celular (LINCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H., e J. E. K).

Nota: Uma visão geral de todo o processo MEMA, incluindo o tempo estimado, é descrita no diagrama de fluxo mostrado na Figura 1. Este protocolo detalha a fabricação de MEMAs em placas de 8 poços. O protocolo pode ser adaptado para outras placas ou lâminas.
1. preparação de buffers de proteína, diluente e coloração
<ol><li>Equilibrar frascos de ECMs, ligantes e citocinas à temperatura ambiente (RT) e centrifugar brevemente. Adicione o volume apropriado do buffer RT apropriado, conforme indicado na folha de dados do produto. Siga a recomendação do fabricante para concentrações de ações. Nota: Uma lista completa dos ligantes e ECMs com suas ações e concentrações finais são fornecidas na tabela 1 e na tabela 2. Os ligantes e os ECMs são usados tipicamente na concentração a mais elevada da escala recomendada pelo fabricante que provoca um efeito biológico em ensaios padrão da cultura de 2 dias. Manuseie as proteínas suavemente e em armários de biossegurança fluxo laminar para evitar a contaminação.</li>
	<li>Incubar frascos com balanço suave em RT para 1 h. Não vórtice proteínas como isso pode causar-lhes a desnaturar.</li>
	<li>Proteínas alíquotas para armazenamento de longo prazo para que todas as alíquotas sejam de uso único apenas para evitar a degradação com ciclos repetidos de congelamento/descongelação. Armazene as proteínas liofilizadas a-80 ° c (salvo indicação em contrário) até que seja necessário. Tome cuidado para coletar todos os metadados para referência futura, tais como: (i) nome da proteína, (II) data preparada, (III) número lote/lote, (IV) fornecedor, (v) número do catálogo, (vi) concentração, (VII) volume, e (VIII) preparador.</li>
	<li>Prepare o tampão diluente contendo 20% (v/v) glicerol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7,2 e esterilizar filtro. Mantenha este tampão estéril e armazene em RT.</li>
	<li>Prepare o tampão de coloração contendo 2% (p/v) BSA, 1 mM MgCl2e 0, 2% Nan3 em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Filtrar e armazenar a 4 ° c.</li>
</ol>2. preparação de uma placa de origem ECM
<ol><li>Remova estoques aliquotados de proteínas ECM a serem impressos e descongelar no gelo. Registre todos os números de lote para rastreamento de metadados.</li>
	<li>Flick tubos de proteínas descongelados suavemente para garantir a ressuspensão adequada e girar para baixo em uma centrífuga.</li>
	<li>
Faça misturas de impressão ECM (EPMs) e uma fonte fluorescente para ser usada por um robô de manuseio de líquidos que criará as placas de origem 384-well aleatórias. Nota: as placas de fonte 384-well serão usadas por uma impressora da disposição do pino do toque para criar as matrizes impressas em 8 placas do poço.<ol>
<li>Rotule tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada EPM e o</li>
		<li>Prepare cada EPM combinando 125 μL de tampão diluente (ver passo 1,4) com o volume adequado de estoque de ECM e leve a mistura até um volume total de 250 μL com PBS. As concentrações finais em cada tubo EPM serão 1x proteína ECM, 5 mM EDTA, 10% glicerol, e 100 mM Tris.</li>
		<li>Prepare uma solução fluorescente, dissolvendo-a no tampão apropriado especificado pelo fabricante e transfira 250 μL para um tubo de transmissão rotulado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. criação da placa de origem usando um manipulador de líquidos
<ol><li>Projete um layout de placa 384-well que randomize as posições dos ECMs e seja otimizado para a cabeça do pino da impressora matriz que está sendo usada. Projete a colocação do material de forma que ele será impresso na linha 1, coluna 1 posição de cada poço para auxiliar na orientação da matriz. Nota: Um total de 14 − 15 repetições de cada ECM é usado para assegurar dados robustos. Inclua réplicas adicionais de colágeno ou outro ECM que produz um acessório robusto para avaliação da uniformidade de ligação. O layout pode precisar utilizar várias placas 384-well, dependendo do número de ECMs de interesse.</li>
	<li>Transfira tubos EPM para um manipulador líquido, mantendo os tubos a 4 ° c com um rack de tubo resfriado ou usando um robô de manuseio de líquidos localizado em uma sala fria.</li>
	<li>Usando o software do manipulador de líquidos, execute um programa para transferir 15 μL de cada EPM e a base para os poços pré-designados dentro da placa de origem 384-well (s).</li>
	<li>Pipet PBS em qualquer poços não utilizados para aumentar a umidade e proteção contra a dessecação durante o processo de impressão. Nota: Consulte a Figura 2 para obter um exemplo de um conjunto de placas de origem 384 bem otimizado para uma cabeça de pino de 4 x 7 e inclui um bloco de colágeno I e PBS.</li>
	<li>Placa (s) de vedação e mantenha a 4 ° c até estar pronto para imprimir.</li>
</ol>4. imprimindo MEMAs usando um robô de impressão de matriz
Nota: A parte seguinte do protocolo descreve especificamente a preparação e o uso de MEMA para investigar o impacto de diferentes proteínas do microambiente no crescimento e proliferação de células MCF7. No entanto, o protocolo pode ser facilmente adaptado para usar diferentes ligantes, ECMs e células para estudar outras linhas celulares e pontos de extremidade de interesse.
<ol><li>
Usando uma impressora de pinos de toque, imprima EPMs e pontos de identificação em 8 placas de poços. Imprima várias repetições de cada condição de ECM para garantir a reprodutibilidade. Nota: outros formatos de chapa ou lâminas podem ser usados para impressão, mas a otimização de buffer pode ser necessária para alcançar a formação ideal do ponto.<ol>
<li>Imprima os ECMs para o MEMA usando pinos do diâmetro de 350 μm arranjados em uma configuração da cabeça de cópia 4 x 7. Imprima as matrizes nas placas de 8 poços como 20 colunas por 35 linhas, para um total de ~ 700 pontos. As matrizes maiores são possíveis nestas placas mas vêm com um trade-off de efeitos aumentados da borda na ligação e na mancha da pilha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a impressão, guarde as chapas num dessecador durante um período mínimo de 3 dias antes da utilização.</li>
</ol>5. criação de placas de tratamento de ligantes
<ol><li>Projete uma disposição da placa do 96-well que inclui ligantes do interesse. Para facilitar o tratamento de muitas placas MEMA ao mesmo tempo, projetar esta placa com espaçamento que permite o uso de um Pipet multi-canal com 4 pontas espaçadas para transferir líquidos entre os poços de 8-bem MEMAs e uma placa 96-well. Nota: Neste protocolo, são utilizados o conjunto completo de ligandos listados na tabela 2 .</li>
	<li>Thaw ligantes no gelo. Momentaneamente Flick e gire para baixo cada tubo.</li>
	<li>Diluir os ligantes para um estoque de trabalho de 200x usando o buffer recomendado pelo fabricante (tipicamente PBS).</li>
	<li>Pipet 10 μL de cada estoque do ligante 200x no poço correspondente dentro da placa 96-well.</li>
	<li>Selar e armazenar chapas a-20 ° c. Nota: Faça placas de tratamento de ligantes em lotes, capturando todos os metadados para análise a jusante.</li>
</ol>6. cultivando células em MEMAs
<ol><li>Bloco MEMAs por 20 min com 2 mL por poço de tampão de bloqueio não incrustante contendo 1% de agente de bloqueio não incrustante (tabela de materiais) em água destilada dupla (DDH2O).</li>
	<li>Aspirar o tampão de obstrução e os poços triplos da enxaguadura com PBS. Para evitar a dessecação, deixe o volume final de PBS em poços até estar pronto para a plaqueamento celular. Nota: É extremamente útil ter dois trabalhadores do banco para etapas da cultura da pilha em MEMAs. Um trabalhador do banco pode executar etapas da aspiração, quando o segundo executar etapas da adição. Recomenda-se usar um Pipet multicanal de 1 mL com pontas espaçadas para coincidir com a placa de 8 poços para pipetagem e um divisor de Y com duas pipetas Pasteur para aspirar vários poços de uma só vez.</li>
	<li>Sementes 2 x 105 MCF7 células por poço em 2 ml de Dulbecco ' s modificado médio de Eagle ' s médio (DMEM) contendo 10% soro fetal bovino (FBS). Nota: Antes de um experimento MEMA completo, realize uma experiência de titulação de célula para otimizar números de células, de forma que os pontos MEMA tenham números de células altas (mas não são confluentes) no final da duração experimental desejada.</li>
	<li>Após 2 − 18 h de adesão, aspirado a meio e substituir com 2 mL de meio de crescimento reduzido (DMEM com 0,1% FBS). Nota: Soro reduzido (por exemplo, 0,1% FBS) ou condições de fator de crescimento empobrecido podem ser usados neste momento para isolar o impacto estimulatório de ligantes específicos.</li>
	<li>Descongelar uma placa de tratamento de ligantes no gelo. Placa de centrifugação descongelada a 200 x g durante 1 min.</li>
	<li>Transferir 200 μL de meio de cada poço na placa de cultura para o poço adequado na placa de tratamento. Pipet para cima e para baixo para misturar o volume do ligante com o meio e para transferir esta mistura de volta ao poço apropriado na placa de Mema.</li>
	<li>Levemente rocha à mão e devolva as placas MEMA à incubadora. Cultura para a duração do experimento na presença da combinação ligand/ECM a 37 ° c e 5% CO2. Nota: Um experimento MEMA típico é executado por 72 h; os experimentos de longa duração podem requerer a reposição de meio e retratamento com ligantes.</li>
	<li>Os poços MEMA do pulso em 71 h com 100x 5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU) para uma concentração final de 10 μM. Incubar em condições experimentais com EdU para 1 h em 37 ° c e 5% CO2. Nota: Outros tratamentos de células ao vivo também podem ser usados neste momento.</li>
</ol>7. fixação e coloração MEMAs
<ol><li>Após 72 h e quaisquer tratamentos de células ao vivo, aspiram poços. Fix MEMAs em 2 mL por poço de 2% paraformaldeído (PFA) por 15 min em RT.</li>
	<li>Aspirar a PFA. Permeabilize com 2 mL por o poço do surfactante nonionic de 0,1% por 15 minutos.</li>
	<li>Aspirar o surfactante não iônico e lavar com 2 mL por poço de PBS. Aspirar PBS. Lave com 2 mL de PBS com 0, 5% de polissorbato 20 (PBS-T). Nota: A superfície de MEMA é hidrofóbica, e a falha lavar com PBS-T antes que a incubação da mancha e do anticorpo conduzirá à formação de vazios nos poços durante etapas da incubação e dê origem aos artefatos de coloração.</li>
	<li>Aspirar PBS-T. Adicionar reagentes de reação de detecção EdU. Incubar por 1 h em RT, balançando e protegido da luz. Após 1 h incubação, saciar a reação com o tampão de têmmata comercial fornecido. Nota: A deteção de EdU e as etapas da mancha/anticorpo podem ser executadas em 1,5 mL por o poço para reduzir o custo.</li>
	<li>Aspirar o tampão de têmmata e lavar com PBS-T antes de incubação com manchas ou anticorpos.</li>
	<li>Incubar os poços de MEMA com anticorpos contra a histona H3K9me3 (1:1000) e fibrillarina (1:400) em tampão de coloração contendo 2% (p/v) de albumina sérica bovina (BSA), 1 mM MgCl2 e 0, 2% Nan3 durante a noite a 4 ° c. Nota: Realize titulações de anticorpos para determinar as concentrações ideais antes de usá-las em um conjunto MEMA completo.</li>
	<li>Após a incubação preliminar do anticorpo ou da mancha, lave os poços 2x com PBS e uma vez com PBS-T.</li>
	<li>Adicionar anticorpos secundários (asno anti-rato IgG e asno anti-coelho IgG, ambos 1:300) e 0,5 μg/mL 4 ′ 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ phenylindole (DAPI). Incubar por 1 h na RT no escuro.</li>
	<li>Lave os poços 2x com 2 mL por poço de PBS, deixando-os no final 2 mL PBS.</li>
	<li>Proceda à imagem ou armazene MEMAs manchadas para a imagem latente mais atrasada no PBS em 4 ° c protegido da luz.</li>
</ol>8. imagem latente de MEMAs
<ol><li>Imagem MEMA em um sistema automatizado da imagem latente com os canais de deteção fluorescentes apropriados.</li>
	<li>Saída de dados de imagem resultante para um sistema de gerenciamento de imagem. Segmentar células e calcular níveis de intensidade usando o CellProfiler8.</li>
</ol>9. análise de dados
Nota: A análise de dados consiste em normalização, correção de variação e compactação dos dados brutos do CellProfiler. Nesta instância, o R-Environment com código personalizado é usado para executar todas as etapas. No entanto, qualquer ambiente estatístico ou programa de software pode ser utilizado para executar as ações equivalentes. Um exemplo do código personalizado de fonte aberta para o ambiente de R para análise está disponível em: https://www.Synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
<ol><li>Pré-processar e normalizar os dados de imagem segmentada.</li>
	<li>Determine a contagem de células Spot usando os núcleos corados DAPI.</li>
	<li>Intensidade de EdU de porta automática para rotular células como EdU+. Medir a proliferação usando a proporção de células EdU+ em cada local.</li>
	<li>A mediana resume as manchas citoplasmáticas e as medições da morfologia nuclear no nível Spot.</li>
	<li>Realize a remoção da normalização indesejada de variação (RUV) nos dados para melhorar a qualidade dos dados9. Nota: Essa abordagem é aplicada a cada sinal de intensidade e morfologia independentemente como uma matriz com matrizes usando as linhas e pontos como as colunas como descrito anteriormente9.</li>
	<li>Aplique a normalização de loess bivariada aos resíduos normalizados RUV usando a linha de matriz e a coluna de matriz como as variáveis independentes para corrigir efeitos espaciais ou de intensidade relacionados.</li>
	<li>Uma vez que a normalização é terminada, a mediana resume as repetições para cada condição do microambiente para relatar e uma análise mais aprofundada.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
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<li>Allan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMERO%3A+flexible%2C+model-driven+data+management+for+experimental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).</li>
<li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li>
<li>Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiated+state+of+normal+and+malignant+cells+or+how+to+define+a+%22normal%22+cell+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture.</a> International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).</li>
<li>Serban, M. A., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+extracellular+matrices%3A+solutions+for+the+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle.</a> Methods. 45 (1), 93-98 (2008).</li>
<li>Kaylan, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+lung+tumor+cell+drug+responses+as+a+function+of+matrix+context+and+genotype+using+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays.</a> Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).</li>
<li>Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Microenvironments+Impose+a+Continuum+of+Cellular+Responses+to+a+Single+Pathway-Targeted+Anti-cancer+Compound%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound.</a> Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A importância da "dimensionalidade" e do contexto tem sido um fator motivador no desenvolvimento de sistemas de cultura in vitro como ferramentas na caracterização de células cancerosas através de sua interação com o microambiente11, e a capacidade de in vitro sistemas de cultura para imitar o ambiente in vivo é uma força motriz por trás da busca para melhorar esses sistemas de cultura. No entanto, os sistemas in vitro continuam a ser instrumentos significativos de investigação do cancro precisame...

A cultura de linhagens de células cancerosas em plástico em monocamadas bidimensional (2D) continua sendo um dos principais cavalos de trabalho para pesquisadores de câncer. No entanto, o microambiente está sendo cada vez mais reconhecido por sua capacidade de impactar os fenótipos celulares. No câncer, o microambiente tumoral é conhecido por influenciar múltiplos comportamentos celulares, incluindo crescimento, sobrevida, invasão e resposta à terapia1,2. As culturas tradicionais da pilha do monocamada faltam tipicamente influências do microambiente, que conduziu ao desenvolvimento de uns ensaios tridimensionais (3D) mais complexos para crescer pilhas, incluindo extratos purificados comercialmente disponíveis da membrana do porão. No entanto, essas matrizes purificadas são tipicamente complicadas de usar e sofrem de problemas técnicos, como a variabilidade do lote3 e composições complexas3. Como resultado, pode ser difícil atribuir a função a proteínas específicas que podem estar afetando os fenótipos celulares3.
Para abordar essas limitações, desenvolvemos a tecnologia microarray (Mema), que reduz o microambiente até combinações simples de matriz extracelular (ECM) e proteínas de fator de crescimento solúvel4,5 . A plataforma MEMA possibilita a identificação de fatores microambientais dominantes que impactam o comportamento das células. Usando um formato de matriz, milhares de combinações de fatores de microambiente podem ser testadas em um único experimento. O MEMA descrito aqui interroates ~ 2.500 diferentes condições únicas de microambiente. As proteínas ECM impressas em placas de poço formam almofadas de crescimento sobre as quais as células podem ser cultivadas. Os ligantes solúveis são adicionados aos poços individuais, criando os microambientes combinatória originais (ECM + ligand) em cada ponto diferente a que as pilhas são expostas. As células são cultivadas por vários dias, em seguida, fixo, manchado, e imaged para avaliar fenótipos celulares como resultado da exposição a estas combinações específicas de microambiente. Desde que os microambientes são combinações simples, é direto identificar as proteínas que conduzem mudanças fenotípicas principais nas pilhas. As memas têm sido utilizadas com sucesso para identificar fatores que influenciam vários fenótipos celulares, incluindo aqueles que impulsionam as decisões de destino da célula e a resposta à terapia4,5,6,7. Essas respostas podem ser validadas em experimentos 2D simples e, em seguida, podem ser avaliadas em condições que recapitulam mais plenamente a complexidade do microambiente tumoral. A plataforma MEMA é altamente adaptável a uma variedade de tipos de células e endpoints, desde que estejam disponíveis bons biomarcadores fenotípicos.

<table><tbody><tr><td>Aushon 2470</td><td>Aushon BioSystems</td><td></td><td>Sistema de robô Arrayer usado no protocolo</td></tr><tr><td>Nikon HCA</td><td>Sistema</td><td></td><td>de imagem de alto conteúdo Nikon projetado em torno do microscópio invertido Nikon Eclipse Ti</td></tr><tr><td>Manipulador de líquidos BioTek Precision XS Robô</td><td>de manuseio de líquidos BioTek</td><td></td><td></td> usado no protocolo</tr><tr><td>Solução tampão de cloridrato de trizma</td><td>Sigma</td><td>T2069</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Kolliphor P338</td><td>BASF</td><td>50424591</td><td></td></tr><tr><td>placa de microarray de 384 poços, poço cilíndrico</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab1055</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 8 bem prato</td><td>Thermo Fisher</td><td>267062</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído 16% solução</td><td>Microscopia Eletrônica Ciência</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP-1600</td><td></td></tr><tr><td>Azida de Sódio</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Máscara de Célula</td><td>Sondas Moleculares</td><td>H32713</td><td></td></tr><tr><td>Click-iTEdU Alexa Fluor</td><td>Sondas Moleculares</td><td>C10357</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Promo</td><td>Kine PK-CA70740043</td><td></td></tr><tr><td>ALCAM</td><td>R & D Systems</td><td>656-AL</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Cadherin-20 (CDH20)</td><td>R & D Systems</td><td>5604-CA</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Caderina-6 (CDH6)</td><td>R & D Systems</td><td>2715-CA</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Cadherin-8 (CDH8)</td><td>R & D Systems</td><td>188-C8</td><td>ECM</td></tr><tr><td>CD44</td><td>R & D Systems</td><td>3660-CD</td><td>ECM</td></tr><tr><td>CEACAM6</td><td>R & D Systems</td><td>3934-CM</td><td></td></tr><tr><td>ECM Colágeno I</td><td>Cultrex</td><td>3442-050-01</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Colágeno Tipo II</td><td>Millipore</td><td>CC052</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Colágeno Tipo III</td><td>Millipore</td><td>CC054</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Colágeno Tipo IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Colágeno Tipo V</td><td>Millipore</td><td>CC077</td><td>ECM</td></tr><tr><td>COL23A1</td><td>R & D Systems</td><td>4165-CL</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Desmoglein 2</td><td>R & D Systems</td><td>947-DM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>E-caderina (CDH1)</td><td>R & D Systems</td><td>648-EC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ECM1</td><td>R & D Systems</td><td>3937-EC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>R & D Systems</td><td>1918-FN</td><td>ECM</td></tr><tr><td>GAP43</td><td>Abcam</td><td>ab114188</td><td>ECM</td></tr><tr><td>HyA-500K</td><td>R & D Systems</td><td>GLR002</td><td>ECM</td></tr><tr><td>HyA-50K</td><td>R & D Systems</td><td>GLR001</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R & D Systems</td><td>720-IC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L6274</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Laminin-5</td><td>Abcam</td><td>ab42326</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Lumican</td><td>R & D Systems</td><td>2846-LU</td><td>ECM</td></tr><tr><td>M-Cad (CDH15)</td><td>R & D Systems</td><td>4096-MC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Nidogen-1</td><td>R & D Systems</td><td>2570-ND</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Osteoadherina/OSAD</td><td>R & D Systems</td><td>2884-AD</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Osteopontina (SPP)</td><td>R & D Systems</td><td>1433-OP</td><td>ECM</td></tr><tr><td>P-Caderina (CDH3)</td><td>R & D Systems</td><td>861-PC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>PECAM1</td><td>R & D Systems</td><td>ADP6</td><td></td></tr><tr><td>ECM Tenascina C</td><td>R & D Systems</td><td>3358-TC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>VCAM1</td><td>R & D Systems</td><td>ADP5</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>R & D Systems</td><td>2308-VN</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Biglycan</td><td>R & D Systems</td><td>2667-CM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Decorin</td><td>R & D Systems</td><td>143-DE</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Periostin</td><td>R & D Systems</td><td>3548-F2</td><td>ECM</td></tr><tr><td>SPARC/osteonectina</td><td>R & D Systems</td><td>941-SP</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Trombospondina-1/2</td><td>R & D Systems</td><td>3074-TH</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Brevican</td><td>R & D Systems</td><td>4009-BC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Elastina</td><td>BioMatrix</td><td>5052</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Fibrilina</td><td>Lynn Sakai Lab OHSU</td><td>N/A</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ANGPT2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>623-AN-025</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>IL1B</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>201-LB-005</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>CXCL8</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>208-IL-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>IGF1</td><td>RnD_Systems_Own</td> TNFRSF11B <td>de ligante</td><td>291-G1-200</td></tr><tr><td></td><td>RnD_Systems_Own</td><td>185-OS</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>BMP6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>507-BP-020</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>FLT3LG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>308-FK-005</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>CXCL1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>275-GR-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>DLL4</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1506-D4-050</td><td>ligante</td></tr><tr><td>HGF</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>294-HGN-005</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>Wnt5a</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>645-WN-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>CTGF</td><td>Life_Technologies_Own</td><td>PHG0286</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>LEP</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>398-LP-01M</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma_Aldrich_Own</td><td>SRP4037-50UG</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>FGF6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>238-F6</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>IL7</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>207-IL-005</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>TGFB1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>246-LP-025</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>PDGFB</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>220-BB-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>WNT10A</td><td>Genemed_Own</td><td>90009</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>PTN</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>252-PL-050</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>BMP3</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>113-BP-100</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>314-BP-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>TNFSF11</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>390-TN-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>CSF2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>215-GM-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>BMP5</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>615-BMC-020</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>DLL1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1818-DL-050</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>NRG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>296-HR-050</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>KNG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1569-PI-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>GPNMB</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>2550-AC-050</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>CXCL12</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>350-NS-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>IL15</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>247-ILB-005</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>TNF</td><td>RnD_ Systems_Own</td><td>210-TA-020</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>IGFBP3</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>675-B3-025</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>WNT3A</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>5036-WNP-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>PDGFAB</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>222-AB</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>AREG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>262-AR-100</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>JAG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1277-JG-050</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>BMP7</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>354-BP-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>TGFB2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>302-B2-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>VEGFA</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>293-VE-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>IL6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>206-IL-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>CXCL12</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>351-FS-010</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>NRG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>Ligante 378-SM</td><td></td></tr><tr><td>IGFBP2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>674-B2-025</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>SHH</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1314-SH-025</td><td>Ligante</td></tr><tr><td>FASLG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>126-FL-010</td><td>Ligante</td></tr></tbody></table>

usando microarrays para interrogar o impacto microambiental em phenotypes celulares no cancro

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Compreender o impacto do microambiente no fenótipo das células é um problema difícil devido à complexa mistura de fatores de crescimento solúvel e proteínas associadas à matriz no microambiente in vivo. Além disso, os reagentes prontamente disponíveis para a modelagem de microambientes in vitro utilizam tipicamente misturas complexas das proteínas que são definidas incompletamente e sofrem da variabilidade do grupo à lote. A plataforma do microarray do microambiente (Mema) permite a avaliação de milhares de combinações simples de proteínas do microambiente para seu impacto em fenótipos celulares em um único ensaio. Os MEMAs são preparados em placas de poço, o que permite a adição de ligantes individuais para separar os poços contendo proteínas de matriz extracelular (ECM) dispostas. A combinação do ligante solúvel com cada ECM impresso dá forma a uma combinação original. Um ensaio típico MEMA contém mais de 2.500 microambientes combinatórios únicos que as células são expostas em um único ensaio. Como um caso de teste, a linha celular MCF7 do cancro da mama foi chapeada na plataforma de MEMA. A análise deste ensaio identificou fatores que aumentam e inibem o crescimento e a proliferação dessas células. A plataforma MEMA é altamente flexível e pode ser estendida para uso com outras questões biológicas além da pesquisa de câncer.

Para simplificar os impactos microambientais no crescimento e proliferação celular e identificar condições que promoveram ou inibiram o crescimento e proliferação celular, a linha celular de câncer de mama MCF7 foi semeada em um conjunto de oito MEMAs de 8 poços, conforme descrito no protocolo. Este ensaio expôs as células a 48 diferentes ECMs e 57 ligantes diferentes, para um total de 2736 condições microambientais combinatórias. Após 71 h na cultura, as pilhas foram pulsada com EdU, fixo, permeablized, e manchado com D...

O objetivo do método apresentado aqui é mostrar como Microarrays microambiente (MEMA) pode ser fabricado e usado para interrogar o impacto de milhares de microambientes combinatórios simples sobre o fenótipo de células cultivadas.

Usando Microarrays para interrogar o impacto microambiental em phenotypes celulares no cancro

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Estudar o microambiente tumoral é difícil devido à sua complexidade. Desenvolvemos microarrays de microambiente que consistem em microambientes combinatórios simples que permitem a identificação de grandes condutores de fenótipos de células tumorais. A maior vantagem da plataforma MEMA é que, como as condições de microambiente são todas definidas, é simples identificar fatores de microambientes que impulsionam fenótipos de interesse.A plataforma MEMA é amplamente aplicável em outros sistemas não cancerígenos, incluindo cepas de células primárias e células-tronco. Há uma série de truques de engenharia e passos que desenvolvemos para acelerar o trabalho de banco molhado e simplificar o protocolo. Para começar, use uma impressora de pinos de toque para imprimir mistura de impressão de matriz extracelular em pontos fiduciários em placas de oito poços.Use pinos de diâmetro de 350 micrômetros dispostos em uma configuração de cabeça de impressão quatro vezes sete para imprimir a matriz extracelular para as microarrays de microambientes. O bloco de colágeno é impresso em MEMAs como uma grade. Os poços cheios de PBS fornecem umidade extra para evitar a secagem da placa de origem da mistura de impressão da matriz extracelular.Imprima as matrizes nas placas de oito poços e 20 colunas por 35 linhas, totalizando 700 pontos. Após a impressão, armazene as placas em um dessecador por um mínimo de três dias antes do uso. Primeiro, projete um layout de placa de 96 poços com espaçamento que permita o uso de uma pipeta multicanal com quatro pontas espaçadas, para que o tratamento de muitas placas MEMA possa ser feito de uma só vez.Em seguida, recupere os ligantes do congelador, e descongele no gelo em um capô de fluxo laminar. Gire brevemente e gire para baixo cada tubo. Use o buffer recomendado pelo fabricante para diluir os ligantes a um estoque de trabalho 200 vezes.Pipeta 10 microliters de cada estoque de ligantes 200 vezes no poço correspondente dentro da placa de 96 poços. Use filme de vedação para selar as placas e armazená-las a menos de 20 graus Celsius. Faça placas de tratamento de ligante em lotes e capture todos os metadados para análise a jusante.Antes de modelar as células, bloqueie os MEMAs com dois mililitros por poço de tampão de bloqueio não-insano por 20 minutos. Use um divisor Y com duas pipetas Pasteur para aspirar o buffer de bloqueio em vários poços ao mesmo tempo e, em seguida, lavar três vezes os poços com PBS. Para evitar a dessecação, deixe o volume final de PBS nos poços até ficar pronto para o revestimento celular.Antes de um experimento completo de MEMA, otimize a concentração de semeadura de células MCF7 realizando um experimento de titulação celular. Um ponto ideal, como mostrado aqui, tem números de células suficientes para extrair dados, mas não tantos que o local é excessivamente confluente. No MEMA, aspire as células de PBS e sementes restantes mcf7 em 30.000 a 35.000 células por poço em dois mililitros de meio de semeadura.Coloque o MEMA em uma incubadora a 37 graus Celsius. Após a adesão durante a noite na incubadora, aspire o meio e substitua por dois mililitros de meio de crescimento reduzido para isolar o impacto estimulativo de ligantes específicos. Em seguida, descongele uma placa de tratamento de ligantes previamente congelada no gelo.Placa desvalada centrífuga a 200 vezes g por um minuto. Transfira 200 microliters de meio de cada poço na placa de cultura MEMA para o poço apropriado na placa de tratamento de ligantes. Pipeta para cima e para baixo para misturar o ligante com o meio, e transferir essa mistura de volta para o poço apropriado na placa de cultura MEMA.Levemente balançar à mão e devolver as placas MEMA à incubadora para cultivar a combinação ligante-ECM a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 71 horas, adicione 100 vezes o EdU aos poços mema para uma concentração final de 10 micromolar. Incuba-o por mais uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Após a incubação final, aspire os poços. Fixar MEMAs em dois mililitros por poço de 2%PFA por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, aspire o PFA dos poços.Permeabilize com dois mililitros por poço de surfactante noniônico de 0,1% por 15 minutos. Aspire o surfactante e depois lave os poços com dois mililitros de PBS e PBS-T, sequencialmente. Depois disso, adicione 1,5 mililitros de reagentes de reação de detecção de EdU a cada poço.Incubar por uma hora em temperatura ambiente, balançando e protegido contra a luz. Em seguida, sacie a reação com 1,5 mililitro comercial saciar tampão por poço. Aspire novamente e lave com PBS-T antes de incubar com concentrações otimizadas de manchas ou anticorpos.Incubar poços MEMA com anticorpos primários no tampão de coloração, balançando a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação primária de anticorpos, lave poços com PBS seguidos de PBS-T. Adicione anticorpos secundários em 0,5 microgramas por DAPI mililitro, diluídos no tampão de coloração.Incubar, balançando por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Lave poços duas vezes com dois mililitros por poço de PBS, e deixe-os nos dois mililitros finais da PBS. Para a imagem manchada mema, coloque-o no estágio microscópio de um sistema de imagem automatizado com canais de detecção fluorescentes apropriados.Saída resultante de dados de imagem para um sistema de gerenciamento de imagem. Segmentar células e calcular níveis de intensidade usando CellProfiler. Neste protocolo, os perfis de ciclo celular de valores de intensidade de DAPI binned versus contagem celular de uma placa de oito poços indicam células na fase de ciclo de células G1 versus G2.Isso corresponde a dois teor de nDNA em células em fase inicial de crescimento, e quatro teor de nDNA em células prestes a sofrer mitose. O impacto do microambiente de ligantes e ECM no número de células e na incorporação da EdU é mostrado. Vermelho indica maior número de células, e azul é menor número de células.Muitos dos efeitos são orientados por ligantes, uma vez que a condição de ECM não impactou fortemente o número celular ou a positividade da EdU. Natagen 1 é uma clara exceção, pois a presença desta molécula de ECM inibe a ligação celular e o crescimento do MCF7. Ligantes como FGF6 e neuregulina-1 alfa aumentam o número celular e têm altas taxas de incorporação da EdU, enquanto ligantes como a anfiiregulina e neuregulina-1 SMDF inibem a ligação celular e o crescimento das células.Um exemplo de células MCF7 crescendo em um ponto MEMA tratado com neuregulina-1 alfa mostra altas taxas de incorporação de EdU, indicadas por núcleos cor-de-rosa. Nesta imagem, a mancha verde é máscara celular, e azul é DAPI. Como um experimento mema completo é caro, é muito importante realizar etapas de otimização, como titulações celulares e soros, antes de realizar o experimento completo.Uma vez identificadas condições microambientais de interesse usando a plataforma MEMA, os ligantes específicos e proteínas de matriz extracelular podem ser estudados com mais profundidade usando sistemas tradicionais de cultura celular 2D e 3D.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um método de triagem combinatória funcional para obtenção de conhecimentos sobre os impactos da composição molecular de microambientes sobre as funções celulares é descrito. O método tira partido de microarray existentes baseados em tecnologias para gerar matrizes de microambientes definidos combinatórias que suportam a adesão de células e análise funcional.

Fabricação e uso de microarranjos microambiente (MEArrays)

Este vídeo descreve a técnica para estudar a expressão de proteínas em células de câncer de pulmão transfectadas com miRNA usando microarray de anticorpos para medir a expressão gênica específica. No protocolo apresentado, realizamos microarray de anticorpos para a identificação da atividade de um tratamento combinatório de miRNA na interrupção do ciclo celular e angiogênese.

Microarray de anticorpos: uma técnica para estudar a expressão proteica de células de câncer de pulmão tratadas com miRNA

Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Molecular sinalização através de estrogênio e microRNAs são fundamentais no desenvolvimento do câncer de mama e de crescimento. O estrogênio ativa os receptores de estrogênio, que são fatores de transcrição. Muitos fatores de transcrição pode regular a expressão de microRNAs e microRNAs regulados por estrogénios podem ser perfilado utilizando diferentes técnicas de larga escala.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

Adaptamos uma inserção de membrana microporosa permeável para mimetizar o microambiente tumoral (TME). O modelo consiste em uma cultura de células mistas, permite a geração simplificada de populações de células individuais altamente enriquecidas sem o uso de marcação fluorescente ou classificação de células e permite estudar a comunicação intercelular dentro do TME em condições normais ou de estresse.

A Mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e Investigando intercelular Comunicação

diferenciação celular é regulada por uma série de fatores do microambiente, incluindo ambas as propriedades da composição da matriz e material de substrato. Descrevemos aqui uma técnica utilizando microarrays de células em conjunto com microscopia de força de tracção para avaliar tanto a diferenciação de células e as interacções célula-substrato biomecânicas como uma função do contexto microambiental.

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

Aqui nós descrevemos um método para separar e enriquecer os componentes do microambiente de imune e não imune a tumor em tumores subcutâneos estabelecidas. Esta técnica permite a análise separada de infiltrar imune tumor e frações não imune tumor que podem permitir a caracterização abrangente do microambiente imune do tumor.

Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

Aqui, apresentamos um protocolo para matrizes de anticorpos identificar alterações nas vias de sinalização em vários modelos de celulares. Estas mudanças, causadas por drogas/hipóxia/ultra-violet luz/radiação ou superexpressão/downregulation/nocautes, são importantes para vários modelos da doença e podem indicar se uma terapia será eficaz ou pode identificar mecanismos de drogas resistência.

Avaliação da resistência aos inibidores de tirosina quinase por um interrogatório das vias de transdução de sinal por matrizes de anticorpo

miRNA terapêutica tem potencial significativo na regulamentação da progressão do câncer. Demonstrado aqui abordagens analíticas são usadas para a identificação da atividade de um tratamento de combinatória miRNA em travar o ciclo celular e a angiogênese.

Análise de combinatória miRNA tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese

Este manuscrito descreve o desenvolvimento de um modelo animal que permite testar diretamente os efeitos da hipóxia tumoral na metástase e decifrar os mecanismos de sua ação. Embora os experimentos descritos aqui se concentrem no sarcoma de Ewing, uma abordagem semelhante pode ser aplicada a outros tipos de tumores.

No modelo in vivo para o ensaio do efeito de hipoxia em metástase tumoral

Aprenda a fabricar microarrays de microambiente (MEMA) para estudar fenótipos celulares em câncer usando impressoras de pinos. Esta plataforma simplifica a identificação de fatores que influenciam o comportamento tumoral.

Usando Microarrays para interrogar o impacto microambiental em phenotypes celulares no cancro

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