Name: Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a produzir e purificar vetores AAV de alta pureza usando células HEK e ultracentrifugação. Este protocolo permite obter altos títulos para aplicações in vitro e in vivo em terapia gênica.

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M.R. é suportado por um Fonds voor bolsa de pós-doutorado Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) (133722/1204517N) e reconhece o apoio contínuo da Fundação Cardiovascular da Colômbia e do departamento de ciências administrativas, Tecnologia e inovação (Grant CT-FP44842-307-2016, código de projeto 656671250485). M.M. é apoiado por uma bolsa de PD FWO (1S48018N). M.G.H. foi apoiado por um VIB institucional grant e o apoio externo do Thierry Latran Foundation (SOD-VIP), Fundação para pesquisa de Alzheimer (SAO-FRA) (P #14006), o FWO (Grant 1513616N) e o Conselho Europeu de investigação (CEI) (começando Grant 281961 - AstroFunc; Prova de conceito Grant 713755 - AD-VIP). Os autores reconhecem Jeason Haughton por sua ajuda com a criação do mouse, Stephanie Castaldo pela ajuda realizando as injeções de veia de cauda e Caroline Eykens por fornecer as imagens das células transfectadas de HEK293T. M.G.H. reconhece Michael Dunlop, Peter Hickman e Dean Harrison.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A produção de vetores AAV recombinantes descrito aqui usa materiais e equipamentos comuns à maioria dos laboratórios de biologia molecular e instalações de cultura de células. Permite ao usuário obter vetores AAV puro, pré-clínicos da classe que podem ser usados para vários tipos de células e tecidos-alvo através de uma gama de aplicações in vitro e in vivo . Uma das maiores vantagens do presente protocolo, em relação aos outros (ou seja, com base em CsCl purificação), é o mais curto tempo de trabalho necessário. Vetores AAV Ready-to-use são obtidos em um máximo de 6 dias úteis após a inicial transfecção de células HEK293T.
Vários fatores podem influenciar negativamente o rendimento final ou a qualidade do vetor AAV. Pobre do transfection eficiência é uma das principais razões para um baixo rendimento viral33. Uma recomendação importante é a utilização de células HEK293T isso não ter sido passado mais de 20 vezes e não têm uma confluência de célula superior a 90% no momento da transfecção21. Além disso, o método de transfeccao selecionado tem um grande impacto sobre os resultados. Este protocolo baseia-se na utilização de PEI. PEI é um polímero catiônico, com a capacidade para entregar o DNA exógeno para o núcleo da célula através da geração de complexos de polímero e de ácidos nucleicos, conhecido como polyplexes, que são aceites pelo celular e traficadas através de endossomos34. PEI-baseado transfection é fácil e rápido de executar, em contraste com outros métodos amplamente utilizados, tais como a co-precipitação de DNA com fosfato de cálcio35. Também, o PEI-baseado transfection é muito mais barato quando comparado a outros métodos recentemente introduzidos, tais como o uso de lipídios catiônicos e mediada por ímã transfeccao36.
A estratégia de purificação desempenha um papel fundamental no protocolo. Em comparação com outros métodos, baseados em iodixanol purificações tendem a conter uma percentagem mais elevada de partículas virais vazio (20%)20. Isso é compensado, até certo ponto, pelo fato de que a purificação baseada em iodixanol rotineiramente resulta em preparações de vetor de vírus adeno-associados com um rácio de partícula-para-infectividade de menos de 100. Isto representa uma melhoria significativa em comparação com procedimentos convencionais baseados em CsCl, substancial perda de infecciosidade partícula for relatado37. Outro método alternativo comum para purificar vetores AAV é baseado em cromatografia de purificação. No entanto, este método tem a grande desvantagem que uma coluna específica é necessária para cada capsídeo de vetor usado: por exemplo, enquanto AAV2 é classicamente isolado usando colunas de heparina, esta metodologia não funciona com AAV4 e AAV5, que não possuem ligação de heparina sites sobre seus capsids38. Considerando que a purificação de cromatografia também é cara, baseada em iodixanol purificação é geralmente mais apropriada para laboratórios que desejam produzir lotes de alta qualidade de vetores AAV em uma pequena escala33,39, 40. no entanto, para maximizar o rendimento final e a pureza do vetor, extremo cuidado é necessário quando fazendo do iodixanol. As várias fracções iodixanol devem ser transferidas para o tubo de ultracentrifugação usando uma pipeta Pasteur estéril, cuja ponta é tocar a parede do tubo: iodixanol devia ser expulso da pipeta lentamente e continuamente. Como as partículas do vetor se acumulam na camada de iodixanol 40%, cuidado deve ser tomado para garantir que não se misturam as interfaces gradientes20. Finalmente, a fração que contém o vetor deve ser recuperada através da inserção de uma agulha em aço inoxidável com um calibre não superior a 20 G. Para maximizar a recuperação de vetor, a fração clara deve ser recuperada na sua totalidade. Durante esta etapa, o tempo é crítico. Para evitar comprometer a pureza da preparação, é essencial para parar a coleção antes de outras fases (contaminantes) do gradiente são coletados.
Diferenças do título obtidos vetor podem ser atribuídas também à capacidade intrínseca do vector para produzir partículas embaladas. Uma comparação entre diferentes sorotipos de vírus adeno-associados mostrou que alguns vetores AAV são mais difíceis de produzir em um título mais elevado do que outros (por exemplo, AAV2)41. Precipitação do vetor, durante a etapa do desalting, pode ser uma razão possível para um título inferior e facilmente prevenida evitando mais33. Além disso, também é possível que a eficiência da purificação de baseados em gradiente iodixanol difere ligeiramente entre sorotipos e, portanto, discrepâncias do título obtido com sorotipos diferentes podem ser observadas41.
Finalmente, ele precisa ser salientado que, apesar de qPCR é um método muito preciso para quantificação de DNA alguns variabilidade inerente a esta técnica pode ser observada. Precisão na titulação depende, principalmente, a pipetagem precisa e adequada utilização do Vortex de todas as soluções. Para garantir o título mais preciso ler, o qPCR pode ser repetido independentemente, e a média dos valores obtidos. A escolha das primeiras demão apresentado neste protocolo baseia-se na sequência do promotor CBA localizado no plasmídeo pTransgene usado em nosso laboratório. O promotor do CBA é um forte promotor sintético que é amplamente utilizado no campo vetor para expressão de carro em vários tipos de célula. Ele incorpora vários elementos, incluindo o elemento inicial do realçador citomegalovírus (CMV); o promotor, primeiro exon e o primeiro intron do gene da CBA; e o aceitador da tala do gene de β-globina do coelho. No entanto, as primeiras demão podem ser projetadas para praticamente qualquer elemento localizado dentro da gaveta de expressão (incluindo o promotor, transgene e dos elementos reguladores). A comparação do título através de lotes também é possível, desde que as primeiras demão são usadas contra regiões comuns para os vetores em questão.
Em conclusão, este protocolo pode ser usado para produzir vetores de vírus adeno-associados com uma variedade de capsids, configurações de genoma, tipos de promotor e cargas do transgene. Isto permitirá que os usuários facilmente adaptar as características finais de seus vetores para melhor atender as necessidades de experimentais. No exemplo apresentado nos resultados da representante, o uso do PHP. Capsídeo B, que eficientemente atravessa o BBB, deu expressão gênica altamente eficiente no SNC, seguir cauda veia injeção32. A administração sistémica de vetores penetrante CNS tem vantagens consideráveis em termos de possíveis efeitos colaterais de17,2,32. Uma possível alternativa à injeção periférica, evitando as advertências de técnicas invasivas, é entrega intratecal, que consiste em entrega do vetor AAV no fluido cerebrospinal. Esta rota de entrega é provada para ser eficaz, mostrando generalizada expressão do transgene através do CNS, menos efeitos fora do alvo em órgãos periféricos e baixos níveis de resposta imune42. No entanto, injeções intratecal são muito mais desafiador, que requerem habilidades técnicas mais elevadas do que a injeção de veia de cauda.
Desenvolvimento do capsídeo para refinar esta tecnologia será conduzido pelas oportunidades para o uso de vetor AAV em aplicações da terapia de gene. Tais abordagens oferecem possibilidades atraentes para tratar doenças do SNC atualmente incuráveis, tais como a esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth, a doença de Parkinson e a doença de Alzheimer18.

Nos últimos 30 anos, selvagem-tipo AAVs tem sido projetados para criar vetores AAV recombinantes, que provaram para ser excepcionalmente úteis ferramentas para a transferência de genes para o CNS1,2,3,4, 5,6 e gene terapia aproxima-se a doença (incluindo aprovado pela FDA e EMA terapias)4,7. Sua adequação para uso no SNC em grande parte deriva de sua capacidade de infectar células não-dividindo, pós mitóticas, tipicamente encontrados no CNS8. No entanto, vectores baseados em vírus adeno-associados também têm a vantagem de permitir uma expressão a longo prazo de qualquer dado transgene terapêutica4,9 , suscitar uma resposta imune mais ameno, em comparação com outros vetores virais7, 8,10,11,12.
Os principais elementos de qualquer vetor de vírus adeno-associados são o genoma e o capsídeo. Selvagem-tipo AAVs são single-stranded (ss), vírus de DNA com um genoma de aproximadamente 5 kilobases (kb)13. Para a produção de vetores AAV recombinantes, os genes rep e cap (necessários para a replicação do genoma e a montagem do capsídeo viral) são excluídos do genoma do vírus adeno-associados do selvagem-tipo e fornecidos em trans, deixando espaço para uma gaveta de expressão contendo o transgene14,15. As invertido terminais repetir sequências (ITRs) do genoma viral original são os únicos elementos retidos em um vetor de vírus adeno-associados, como estas são essenciais para a replicação e empacotamento de10,3,14. Vetores AAV podem ser projetados para realçar a expressão do transgene; uma mutação em um dos ITRs leva à formação de um loop de grampo de cabelo que efetivamente permite a geração de uma vertente DNA complementar3,7,15. A principal vantagem desta configuração, denominado um genoma de autocomplementares (sc), é que ele ignora a necessidade de síntese do segundo-costa típico do ciclo de vida convencional de AAVs, aumentando consideravelmente a velocidade e os níveis de expressão do transgene 1., no entanto, usar um genoma scAAV reduz a capacidade de carga do vetor de aproximadamente 2,4 kb. Isso inclui sequências de transgene, bem como qualquer sequências reguladoras tais como promotores ou sites de microRNA-ligação, para limitar a expressão de tipos de célula específica16.
O capsídeo do vírus adeno-associados determina interação vetor-hospedeiro celular e confere um grau de tropismo de tipo ou tecido celular por um sorotipo de vírus adeno-associados, que também pode ser explorado para limitar a expressão do transgene para locais específicos. Vários sorotipos de vírus adeno-associados são encontrados na natureza, Considerando que os outros tenham sido produzidos em laboratórios através de abordagens recombinantes (i.e., PHP. B). Além disso, alguns capsids também conferem outras características úteis, tais como a capacidade de atravessar o BBB, resultando na entrega de transgenes em todo o SNC após administração sistémica. Isto foi mostrado para AAV9, bem como para o PHP recentemente descrita. B capsídeo17. Como consequência, estes sorotipos estão provando para ser particularmente relevante para novas abordagens de terapia do gene para1817,1,do doenças neurodegenerativas.
O objectivo do presente protocolo é descrever um método de baixo custo para a produção em pequena escala de vetores AAV com alta concentração e pureza. Embora os resultados apresentados aqui use o PHP. Capsídeo B e uma gaveta de expressão scAAV, o protocolo é apropriado para a produção de vários serótipos de vetor de vírus adeno-associados e configurações de genoma, permitindo a máxima flexibilidade experimental. No entanto, o rendimento de vetor e pureza final podem variar dependendo do serótipo escolhido.
O protocolo em si é uma variante do método de produção viral vector tri-transfecção clássica e incorpora o uso de um gradiente de iodixanol para vector limpar, que, em comparação com o clássico uso de gradientes (CsCl) de cloreto de césio, tem sido relatado para produzir vetores AAV de maior pureza em um tempo mais eficiente forma19,20,21.
As etapas de transfeccao, purificação e concentração destinam-se a ser realizada de acordo com boas práticas de laboratório (BPL) em um laboratório de cultura de tecido avaliado para trabalho de vetor viral. Cada tarefa deve ser executada em conformidade com a legislação pertinente de local e nacional relativas à produção de vetor viral e usar. Trabalho deve ser realizado sob uma capa de fluxo laminar e em condições estéreis. Dentro das instalações do vector, é aconselhável usar um avental de laboratório, além do jaleco de cultura de tecido normal. Além disso, um duplo par de luvas, bem como as galochas de plástico, deve ser usado em todos os momentos.
Antes de iniciar a produção de vetor, certifique-se de todos os equipamentos necessários e plasmídeos estão disponíveis. 1) pCapsid plasmídeo contém o rep o gene que codifica a quatro proteínas não estruturais necessárias para a replicação, nomeadamente Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40 e o cap gene que codifica a três proteínas estruturais do capsídeo, nomeadamente VP1, VP2 e VP3. 2) plasmídeo pHelper contém os genes E4 E2Ae VA de adenovírus, que facilitam a produção de AAV nas células HEK293T. 3) plasmídeo pTransgene contém a fita de expressão do transgene, ladeada por dois ITRs. Estes plasmídeos podem ser sintetizados de novo no laboratório usando sequências disponíveis on-line22. Para plasmídeos feitos de novo, especialmente aqueles que contêm transgenes romance, sequenciamento é necessário, para certificar-se de que o transgene e ITRs estão corretas. Como alternativa, do premade plasmídeos podem ser adquiridos directamente através de repositórios on-line do plasmídeo. Quando necessário, plasmídeos podem ser amplificados e purificada usando kits de padrão, de acordo com instruções23 as indicações do fabricante.
Título de vetor e pureza podem afectar negativamente a capacidade de transdução do vetor. Protocolos adicionais são fornecidos para avaliar a qualidade do vetor produzido. Os vetores finais serão úteis para estudos da função de célula CNS em aplicações tanto in vitro e in vivo .

<table><tbody><tr><td>Produção de plasmídeo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pPlasmídeo transgênico</td><td>De novo design ou obtido de um repositório de plasmídeo</td><td>N/A</td><td>Consulte a etapa 1 do protocolo principal para obter mais detalhes</td></tr><tr><td>pCapsid</td><td>De novo design ou obtido de um repositório de plasmídeo</td><td>N/A</td><td>Consulte a etapa 1 do protocolo principal para obter mais detalhes</td></tr><tr><td>pHelper</td><td>Agilent</td><td>240071</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Plus maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR kit de purificação</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>AAV Helper-Free System</td><td>Agilent</td><td>240071</td><td></td></tr><tr><td>Cultura celular e transfecção </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM), glicose alta, sem glutamina</td><td>Life technologies</td><td>11960-044</td><td>Suplemente DMEM com FBS (1% ou 10% v/v) e GlutaMAX 200 mM (1% v/v) e depois filtre esterilize o meio usando um 0.22 &micro; m filtro</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX suplemento</td><td>GIBCO</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>(200 mM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning sistema de filtro a vácuo de garrafa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (DPBS) sem cálcio e sem magnésio</td><td>GIBCO</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T células</td><td>Coleta Americana de Cultura de Tecidos</td><td>CRL3216</td><td>Após o recebimento, descongele as células e a cultura conforme descrito no protocolo. Após um número mínimo de passagens, congele uma subfração para o futuro em alíquotas. Sempre use células abaixo do número de passagem 20. Depois de as células cultivadas terem sido passadas mais de 20 vezes, reinicie uma cultura a partir das alíquotas armazenadas Placas de</td></tr><tr><td>cultura de células</td><td>Greiner Cellstar</td><td>639160</td><td>Placas de cultura de 15 cm de diâmetro</td></tr><tr><td>Raspadores de células</td><td>VWR</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966-2</td><td>PEI em pó é dissolvido em 1 &micro; g/&micro; L em água deionizada (ddágua) em pH=2 (usar HCl). Prepare em um copo e mexa por 2-3 h. Quando dissolvido, traga o pH de volta para 7 com NaOH. Filtrar, esterilizar e conservar a solução-mãe ressuspensa em alíquotas de 1 ml a -20 graus C. As alíquotas PEI podem 
 ser congelado/descongelado várias vezes.</td></tr><tr><td>Solução Virkon</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9821357</td><td>Desinfete qualquer material que tenha estado em contato com partículas vetoriais montadas com solução Virkon</td></tr><tr><td>Aventais de manga comprida Mutexi</td><td>Fisher Scientific</td><td>11735423</td><td>Use um avental por cima de um jaleco comum</td></tr><tr><td>Fisherbrand proteção máxima galochas descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>15401952</td><td></td></tr><tr><td><forte>AAV Purificação e dessalinização</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Optiprep gradiente de densidade médio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep é uma solução de 60% (p/v) de iodixanol em água (estéril). CUIDADO. Use sob uma capa de fluxo laminar. Use luvas</td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>CUIDADO. Use sob uma capela de fluxo laminar</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z627992</td><td>Esterilize antes de usar</td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno OptiSeal</td><td>Beckman</td><td>361625</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase (250 U/&micro; L)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Fornecido como uma solução pronta para uso Filtro de</td></tr><tr><td>seringa Acrodisc</td><td>Pall corporation</td><td>4614</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Omnifix (5 mL)</td><td>Braun</td><td>4617053V</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de seringa romba</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z261378</td><td>Agulha de seringa de aço inoxidável 316, pipetagem sem corte 90&deg; calibre de ponta 16, L 4 pol. Referido no texto como uma agulha de ponta romba</td></tr><tr><td>Aqua Ecotainer</td><td>B. Braun</td><td>0082479E</td><td>Água estéril livre de endotoxinas. Referido como 'Água ultrapura'Unidade</td></tr> <tr><td>de filtro centrífugo Amicon ultra-15</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td>Esses filtros concentram o produto final coletando as partículas vetoriais em etapas consecutivas de centrifugação</td></tr><tr><td>Pluronic F68 (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>24040032</td><td>Surfactante não iônico. Diluir em PBS estéril para usar a 0,01% (v/v)</td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga Estéreis Fisherbrand com Tampas de Rosca (2 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-374</td><td>Use tubos com saia para fácil manuseio</td></tr><tr><td><forte>AAV Titulação </forte>Enzima de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>restrição: StuI (10 U/&micro; L)</td><td>Promega</td><td>R6421</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I (1 U/&micro; L)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115852001</td><td>Reconstituir em água ultrapura e usar a uma concentração final de 10 mg / mL. A solução pode ser armazenada a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Tiras de tubo EasyStrip Plus (com tampas anexadas)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AB2000</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microtubo 3810x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z606340-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Placas multipoços, 96 poços</td><td>Placa de polipropileno Roche</td><td>4729692001</td><td>White (com código de barras de identificação exclusivo)</td></tr><tr><td>Placa de PCR Microseal 'A' e Filme de Vedação de Placa de PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>msa5001</td><td></td></tr><tr><td>AAV Controle de pureza </td>Persulfato de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amônio (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Reconstituir em água ultrapura a 10% (v/v). CUIDADO. Use sob uma capa de fluxo laminar. Use luvas</td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>CUIDADO. Use sob uma capa de fluxo laminar. Use luvas</td></tr><tr><td>Tris Base ULTROL Grau</td><td>Merck</td><td>648311</td><td>CUIDADO: Use sob uma capa de fluxo laminar. Luvas</td></tr><tr><td>de desgaste UltraPure Agarose</td><td>Thermo Fisher</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&reg; Gel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.3</td><td>Solução estoque aquosa de acrilamida e bisacrilamida a 30% na proporção de 37,5:1. CUIDADO: Use sob uma capa de fluxo laminar. Use luvas</td></tr><tr><td>Serva Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6104-58-1</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus marcador prestado</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374edu</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7906</td><td>CUIDADO: Use sob uma capa de fluxo laminar. Use luvas</td></tr><tr><td>Imuno-histoquímica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Synaptic Systems</td><td>132002</td><td>diluição 1:300</td></tr><tr><td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:1.000 diluição</td></tr><tr><td>Equipamento<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número de catálogo </td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Laboratório de produção vetorial</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotina 380 centrífuga de bancada *</td><td>Hettich</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN 80 ultracentrífuga *</td><td>Beckmann Coulter</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Tipo 50.2 Ti rotor de titânio de ângulo fixo *</td><td>Beckmann Coulter</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>Entris digital balança *</td><td>Sartorius</td><td>2202-1S</td><td></td></tr><tr><td>Banho de água morna *</td><td></td><td></td><td>Definido em 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Balde de gelo *</td><td>VWR</td><td>10146-290</td><td>Mantenha o material utilizado no laboratório de produção de vetores separado do utilizado nas áreas laboratoriais padrão</td></tr><tr><td>Pipetboy pro *</td><td>Integra</td><td>156.400</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas graduadas: Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td>Capacidade de 5 mL</td></tr><tr><td>Pipetas graduadas: Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td>Capacidade de 10 mL</td></tr><tr><td>Pipetas graduadas: Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>760180</td><td>Capacidade de 25 mL</td></tr><tr><td>CO2 incubadora CB150 *</td><td>Aglutinante</td><td>9040-0038</td><td>Ajustado em 37 &deg; C, 5% CO2 e 95% de umidade</td></tr><tr><td>Armário de segurança Nuaire NU 437-400E *</td><td>Labexchange</td><td>31324</td><td>Limpe todas as superfícies com etanol 70% e Virkon antes e depois do uso</td></tr><tr><td>Laboratório convencional</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 termociclador *</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Instrument II *</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer *</td><td>Eppendorf</td><td>C 5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop *</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND 2000</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell*</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001FC</td><td>Para uso com géis feitos à mão ou pré-moldados</td></tr><tr><td>Kit de coloração de prata ProteoSilver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PROTSIL1</td><td>Detecção de proteína de alta sensibilidade com baixo fundo</td></tr><tr><td>Centrífuga 5804 R * </td><td>Eppendorf</td><td>B1_022628045</td><td>Centrífuga de alta velocidade para necessidades de capacidade média (até 250 mL)</td></tr><tr><td>Pipetas graduadas Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Pipetas graduadas Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Pipetas graduadas Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>760180</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Pontas de filtro *</td><td>Greiner bio-one</td><td>750257</td><td>1250 &micro; L</td></tr><tr><td>Pontas de filtro *</td><td>Greiner bio-one</td><td>738257</td><td>300 &micro; L</td></tr><tr><td>Pontas de filtro *</td><td>Greiner bio-one</td><td>771257</td><td>10 &micro; L</td></tr><tr><td>Balde de gelo com tampa *</td><td>VWR</td><td>10146-290</td><td></td></tr><tr><td>Mini bomba de vácuo de diafragma, VP 86 *</td><td>VWR</td><td>181-0065</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P100</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>* Os materiais marcados com um asterisco são equipamentos caros e geralmente são itens de infraestrutura central compartilhados entre vários laboratórios. Esses itens também podem ser substituídos por equivalentes, se disponíveis. Observe que, quando uma ultracentrífuga diferente é usada, deve-se tomar cuidado para selecionar o rotor e os tubos de centrífuga corretos.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus adeno-associado

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Ferramentas de entrega de gene com base no vírus adeno-associado (AAVs) são uma escolha popular para a entrega de transgenes para o sistema nervoso central (CNS), incluindo aplicações da terapia de gene. Vetores AAV são não se replicam, capaz de infectar células de divisão e não dividindo e fornecer a longo prazo expressão do transgene. Importante, alguns serotipos, tais como o PHP recém descrito. B, pode cruzar a sangue-cérebro-barreira (BBB) em modelos animais, após o parto sistêmico. Vetores de vírus adeno-associados podem ser eficientemente produzidos em laboratório. No entanto, robustos e reprodutíveis protocolos são necessários para obter vetores AAV com níveis suficientes de pureza e valores de concentração altas o suficiente para aplicações em vivo . Este protocolo descreve uma estratégia eficiente e reprodutível para produção de vetor AAV, baseada numa estratégia iodixanol gradiente de purificação. O método de purificação iodixanol é adequado para a obtenção de lotes de vetores AAV alta-título de alta pureza, quando comparado a outros métodos de purificação. Além disso, o protocolo é geralmente mais rápido que outros métodos descritos atualmente. Além disso, um quantitativo polymerase chain reação (qPCR)-estratégia baseada é descrito por uma determinação rápida e precisa do título o vetor, bem como uma método de coloração de prata determinar a pureza do lote vector. Finalmente, resultados representativos da entrega do gene ao SNC, seguindo a administração sistémica de AAV-PHP. B, são apresentados. Tais resultados devem ser possíveis em todos os laboratórios usando os protocolos descritos neste artigo.

AAV9 foi considerada, até recentemente, para ser o mais eficaz sorotipo de vetor AAV no cruzando o BBB e transducing células do SNC, após a administração periférica. Foi conseguido um avanço significativo no projeto de capsídeo quando Deverman et al. relataram o uso de um método de seleção de capsídeo chamado Cre evolução de AAV-alvo baseados na recombinação (criar)17. Usando este método, eles identificaram um novo capsídeo, chamado PHP. B, que relataram como capaz de transduce a maioria dos astrócitos e neurônios em várias regiões do CNS, após a injeção sistêmica de17. Neste ponto, deve ser observou que mesmo que PHP. B fornece resultados positivos em camundongos C57/Bl6 (que era a tensão utilizada nas experiências de isolamento inicial), relatórios preliminares sugerem que sua eficácia pode variar de forma dependente da tensão. Mais experimentos verterá, sem dúvida, mais luz sobre esta questão31.
No entanto, apesar desses problemas, PHP. B oferece possibilidades excitantes para manipulação de gene não-invasiva no SNC de camundongos, incluindo experiências de terapia do gene de prova de conceito em modelos de doenças. Como tal, escolhemos avaliar a eficiência da expressão do transgene utilizando PHP. B contra o AAV9, que tem sido o vetor 'padrão ouro' para a transdução de CNS administração periférica desde 20092a seguir. Para realizar uma comparação direta entre os dois serótipos, sob condições ideais para a expressão do transgene, usamos um genoma de sc configuração32. Ambos os vetores carregava o transgene para a proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle do promotor frango onipresente β-actina (CBA). Camundongos C57/Bl6 fêmeas no dia pós-natal 42 (cerca de 20 g de peso) receberam uma dose de 1 x 1012 vg por rato de qualquer scAAV2/PHP. B-CBA-GFP ou scAAV2/9-CBA-GFP. Vector administração foi realizada através de injeção de veia de cauda. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de ética do KU Leuven.
Postinjection de três semanas, os ratos foram submetidos a perfusão transcardial com PBS gelado, seguido de 4% (p/v) gelada paraformaldeído (PFA). Seus cérebros foram colhidos e submeteu-se ainda mais postfixation por uma incubação durante a noite no fixador mesmo, antes de transferir para 0,01% (p/v) at-azida/PBS para armazenamento até posterior análise. Depois, os cérebros foram seccionados usando um micrótomo vibratório e imuno-histoquímica foi realizada em 50 µm de seções espessas.
Para avaliar os níveis de expressão do transgene, seções foram coradas com anticorpos primários contra GFP (coelho anti-GFP), com deteção usando anticorpos secundarios conjugados a um corante fluorescente (anticoelho Alexa Fluor 488) (Figura 4A, B ). Medições de intensidade de fluorescência (em unidades arbitrárias [au]) confirmaram um aumento significativo na expressão de GFP quando um sc genoma e o PHP. Capsídeo B foram usados em relação ao AAV9. Foram observados aumentos na GFP no cérebro (2105 que 161 de ± vs 1441 ± 99 au; p = 0,0032), o cerebelo (2601 ± 196 vs 1737 ± 135 au; p = 0,0032) e o tronco cerebral (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 UA; p = 0.0038) (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> Figura 4: entrega sistêmica de scAAV2/PHP. B-CBA-GFP leva a uma alta expressão de GFP no SNC. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP ou scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/mouse) foi administrado a camundongos C57/Bl6 de 6 semanas de idade através da injeção de veia de cauda. GFP foi detectado usando imuno-histoquímica na postinjection de 3 semanas de secções coronais do cérebro. (A) o encéfalo e (B) o cerebelo e tronco encefálico são mostrados. Barras de escala = 1 mm. (C) a quantificação das intensidades de fluorescência relativa foi realizada para determinar os níveis de sinal GFP alcançado com cada vetor (10 seções por rato; três ratos por grupo de vetor). Foi realizado um teste ANOVA One-Way, seguido de um Student bicaudal t-teste; os dados são expressos como média ± desvio-padrão; p &lt; 0,01; au. unidades arbitrárias. pCapsid, usado para a produção de vetor de vírus adeno-associados, contém o gene rep do sorotipo 2 e o gene cap do sorotipo PHP. B ou AAV9, em conformidade. Esta figura foi modificada em Rincon et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, descrevemos uma estratégia eficiente e reprodutível para produzir, título e lotes de qualidade-controle de vetores de vírus adeno-associado. Permite ao usuário obter uma preparação de vetor com alta-título (≥ 1 x 1013 vector genomas/mL) e um elevado grau de pureza, pronto para uso em vitro ou na vivo .

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Seguindo este protocolo, o usuário poderá produzir vetores AAV de alta pureza e rendimento adequado para aplicações in vitro ou in vivo. Este protocolo pode ser usado para produzir e purificar uma gama de sorotipos AAV com diferenças nas configurações. A combinação desses dois elementos pode ser útil para obter o tipo celular e a expressão específica do tecido.A produção de alguns sorotipos pode dar um rendimento menor. Esta é a produção onde há sorotipos próximos e deve ser avaliado individualmente. Demonstrando esses procedimentos será Shelly Fripont, técnica do nosso laboratório.Depois de cultivar as células HEK, misture 360 microgramas de plasmídeos auxiliares, 180 microgramas de plasmid codificando o capsídeo vetorial, e 180 microgramas de plasmídeo contendo o transgene em 18 mililitros de 150 milimilas de cloreto de sódio para preparar a mistura de DNA. Distribua esta mistura por três tubos cônicos de 50 mililitros. Em um novo tubo cônico, misture 840 microgramas de PEI e seis mililitros de cloreto de sódio de 150 mililitros para preparar a mistura pei para seis pratos de cultura celular.Em seguida, adicione seis mililitros da mistura PEI, gota a gota, a um dos tubos cônicos contendo a mistura de DNA. Incubar em temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, remova seis pratos de cultura celular da incubadora.Em uma capa de fluxo laminar, aspire completamente o meio de cada prato. Enxágüe os pratos com cinco mililitros de DPBS pré-aquecidos para remover traços do meio. Incline suavemente cada prato para garantir que o DPBS seja distribuído uniformemente por toda a superfície.Em seguida, aspire suavemente o DPBS. Adicione 12 mililitros de DMEM um a cada prato lentamente, com uma pipeta colocada na borda do prato. Misture o PEI e a mistura de DNA, encanar-o para cima e para baixo três a cinco vezes.Adicione dois mililitros desta mistura a cada um dos seis pratos de cultura celular de forma gota a gota, certificando-se de distribuí-lo cuidadosamente sobre toda a superfície. Repita este processo usando seis pratos de cultura celular de cada vez até chegar a 18 pratos de cultura celular. Agite suavemente os pratos da cultura celular para distribuir a mistura de DNA PEI.Incubar as células transfeinadas a 37 graus Celsius com 95% de umidade e 5% de dióxido de carbono por cinco horas. Depois disso, adicione mais 12 mililitros de DMEM 10 a cada um dos 18 pratos sem remover o meio pré-existente. Continue incubando as células transfeinadas nas mesmas condições.Às 72 horas após a transfecção, use um raspador de células para separar cuidadosamente as células de cada prato de cultura. Colete o meio e as células de dois pratos de cultura em um tubo cônico de 15 mililitros, mantidos no gelo. Centrifugar os tubos a 420 vezes G e a quatro graus Celsius por 10 minutos com a aceleração e desaceleração da centrífuga definida ao máximo.Descarte cuidadosamente o supernatante de cada tubo, despejando-o suavemente em um recipiente de descarte de resíduos. Em seguida, coloque os tubos contendo as pelotas de célula no gelo. Suspendemos cada pelota em dois mililitros de tampão de lise e misturamos pipetting para cima e para baixo cinco a dez vezes.Puxe o AAV de três tubos, juntos. Para começar, congele as células re-suspensas colocando-as em um balde contendo gelo seco misturado com etanol. Em seguida, descongele as células colocando-as imediatamente em um banho de água a 37 graus Celsius.Repita este ciclo de congelamento e degelo três vezes para lise as células e solte as partículas AAV. Após o terceiro passo de descongelamento, centrífuga a 1167 vezes G e a quatro graus Celsius por 15 minutos. Transfira cuidadosamente os supernantes para limpar tubos cônicos de 50 mililitros.Adicione nuclease a cada tubo a uma concentração final de 50 unidades por mililitro de supernaspeuta. Incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos, enquanto gira os tubos a cada 10 minutos para garantir que a nuclease seja completamente misturada com o sobrenante. Centrifugar a 13490 vezes G e a quatro graus Celsius por 20 minutos para esclarecer o supernaspe.Depois disso, remova o êmbolo de uma seringa de 10 mililitros, conecte um filtro de 0,45 micrômetro à seringa e coloque-a em cima de um tubo cônico limpo de 50 mililitros. Encha cuidadosamente a seringa com o supernatante esclarecido. Use o êmbolo para forçar o lise através do filtro.Em seguida, prepare cada uma das frações iodixanol em quatro tubos cônicos separados de 50 mililitros, conforme descrito na tabela um do protocolo de texto. Pipeta oito mililitros de 15% de iodixanol em cada um dos três tubos ultracentrífugas. Pipeta 5,5 mililitros de 25% de iodixanol em um tubo cônico limpo de 50 mililitros.Usando uma pipeta Pasteur não graduada, cuidadosamente camada 5,5 mililitros de solução iodixanol de 25% abaixo da solução iodixanol de 15%. Adicione as soluções de 40% e 60% conforme descrito no protocolo de texto. Frações iodixanol não devem se misturar em camadas.Usando uma pipeta Pasteur, coloque o liseto bruto em cima do gradiente iodixanol de 15%, gota a gota, para evitar perturbar a interface entre o lise bruto e a solução iodixanol. Encha cada tubo de ultracentrifugação com tampão de lise até que o menisco atinja a base do pescoço do tubo, para garantir que o tubo não entre em colapso sob as forças muito altas geradas durante a ultracentrifugação. Feche os tubos usando tampas apropriadas.Usando uma escala digital, certifique-se de que todos os três tubos de ultracentrifugação tenham o mesmo peso. Ajustando o peso conforme necessário, adicionando mais tampão de lise em cima do lise bruto. Use um rotor de titânio de ângulo fixo para centrifugar os tubos a 301580 vezes G e a 12 graus Celsius por uma hora e 40 minutos usando aceleração máxima e desaceleração.Em seguida, anexar uma agulha a uma seringa de cinco mililitros. Remova o espaçador dos tubos do rotor e recupere os tubos após a centrifugação. Aspire apenas a fração de 40% de iodixanol que contém as partículas vetoriais.Processe a amostra ou armazene-a a quatro graus Celsius. Aqui, é demonstrado um protocolo que pode ser usado para produzir vetores AAV com uma variedade de capsídeos, configurações de genoma, tipos de promotores e cargas transgênicas. Neste exemplo, produzimos e purificamos dois vetores AAV diferentes que expressavam a proteína fluorescente verde a partir de um genoma auto-complementar.Os dois vetores são distinguidos por capsídeos diferentes:PHPB e AAV9. Eles foram entregues, por injeção de veia traseira, em seis camundongos adultos C57 pretos. Para avaliar os níveis de expressão transgênica três semanas após a injeção, as seções são manchadas com anticorpos primários contra gfp com detecção usando anticorpos secundários conjugados a um corante fluorescente.As medidas de intensidade de fluorescência mostram um aumento significativo na expressão GFP quando o vetor PHPB é usado em relação ao AAV9. Aumentos no GFP foram observados no cerebrum, no cerebelo e no tronco cerebral. A coleta precisa do vetor contendo fração é crucial para este protocolo.Caso isso não seja feito corretamente, o rendimento do vetor, bem como a pureza vetorial são adversamente afetados. Sendo capazes de produzir vetores AAV, pequenos laboratórios estarão em posição de aproveitar inúmeras possibilidades experimentais para fornecer genes no sistema nervoso central. Este protocolo requer o uso de uma ultracentrifuagem e é importante receber treinamento adequado antes de lidar com isso para evitar acidentes.Além disso, os vetores AAV são frequentemente classificados como riscos biológicos e, portanto, você deve consultar as regulamentações locais antes de manuseá-los e gerenciá-los.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Recombinante adeno-associated virus (rAAVs) vetores estão se tornando cada vez mais valioso...

Produção e titulação de adeno-associados recombinantes Vetores Virais

Um protocolo para geração de vetores adenovirais de alta capacidade sem todas as sequências codificadoras virais é apresentado. A clonagem de transgenes contidos no genoma do vetor é baseada em endonucleases homing. A amplificação do vírus em células produtoras cultivadas como células aderentes e em suspensão depende de um vírus auxiliar que fornece genes virais em trans.

Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

Aqui fornecemos um procedimento detalhado para a produção em larga escala de vetores AAV de grau de pesquisa usando células hek 293 aderentes cultivadas em pilhas de células e purificação de cromatografia de afinidade. Este protocolo produz consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vetoriais/mL, fornecendo quantidades vetoriais apropriadas para grandes estudos em animais.

Produção de vetores de vírus associados a Adeno em pilhas de células para estudos pré-clínicos em grandes modelos animais

Neste protocolo, o vetor AAV2 é produzido por células de insetos Spodoptera frugiperda (Sf9) com baculovírus (BV)-AAV2-green fluorescente protein (GFP) ou gene terapêutico e células Sf9 infectadas por BV-AAV2-rep-cap na cultura de suspensão. As partículas de AAV são liberadas das células usando detergente, clarificadas, purificadas pela cromatografia da coluna de afinidade, e concentradas pela filtragem de fluxo tangencial.

Desenvolvimento de processos para a produção e purificação do vírus associado ao Adeno (AAV)2 Vetor usando o sistema de cultura de células de baculovírus-inseto

O vírus adenoassociado é produzido em cultura de células de suspensão e purificado por centrifugação com duplo gradiente de densidade de iodixanol. Etapas são incluídas para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação do vírus e concentrar ainda mais o produto final do vírus. Os títulos finais esperados atingem 10a 12 partículas virais/mL e são adequados para uso pré-clínico in vivo .

Produção e purificação de vírus adenoassociados em cultura de suspensão por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol para aplicações in vivo

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para a geração e purificação de vetores virais adeno-associados usando um método otimizado de cromatografia de afinidade à base de heparina. Apresenta uma abordagem simples, escalável e econômica, eliminando a necessidade de ultracentrifugação. Os vetores resultantes exibem alta pureza e atividade biológica, comprovando seu valor em estudos pré-clínicos.

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

À medida que o campo da terapia gênica continua a evoluir, há uma necessidade crescente de métodos inovadores que possam enfrentar esses desafios. Aqui, é apresentado um método único, que agiliza o processo de geração de vetores AAV de alto rendimento e alta pureza usando uma plataforma de fábrica de células, atendendo aos padrões de qualidade para estudos in vivo .

Um procedimento simplificado e padronizado para gerar vetores de vírus adeno-associados de alto título e alta qualidade utilizando uma plataforma de fábrica de células

A quantificação precisa das cópias do genoma do vetor do vírus adeno-associado (AAV) é crítica, mas um protocolo padronizado ainda não foi estabelecido. Este protocolo descreve um método validado para preparar amostras de AAV purificadas e conduzir a reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais (dd_PCR) para quantificar de forma confiável o título do genoma viral.

Quantificação de genomas virais adeno-associados em amostras de vetores purificados por reação em cadeia da polimerase por gotículas digitais

Aqui apresentamos a injeção intracraniana de vetores de AAV para a rotulagem fluorescentes de neurônios e células gliais no córtex visual.

Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

Neste protocolo descrevemos produção, purificação e titulação de lentivirais. Nós fornecemos um exemplo de entrega do gene lentiviral vetor mediada em primárias neurônios cultivados e astrócitos. Nossos métodos podem também se aplicam a outros tipos de...

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Aprenda a produzir e purificar vetores AAV de alta pureza usando células HEK e ultracentrifugação. Este protocolo permite obter altos títulos para aplicações in vitro e in vivo em terapia gênica.

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

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