Name: Um ensaio de citotoxicidade à base de placas para a avaliação da função citolítica de células assassinas naturais do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a avaliar a função citotóxica de células assassinas naturais de placentas de ratos usando um ensaio colorimétrico simples e econômico. Este método acessível permite comparar atividades citotóxicas sem equipamentos especializados.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Heart Lung e Blood Institute dos institutos nacionais de saúde a subvenção R00HL130456, o Instituto Nacional de ciências médicas gerais dos institutos nacionais de saúde o prêmio P20GM104357, e pelo Mississippi INBRE, financiado por um prêmio de desenvolvimento institucional (IDeA) dos institutos nacionais de ciências médicas gerais dos institutos nacionais de saúde o número de subvenção P20GM103476. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde.

Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais do centro médico da Universidade do Mississippi. O cuidado e manuseio dos animais estavam de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health para o tratamento ético dos animais.
1. isolação da pilha do linfócito de placentas
<ol><li>Remova uma placenta do útero do rato (dia 19 da gestação) e coloc em 10 mL de PBS gelo-frio8.</li>
	<li>Coloque uma placenta num filtro de 100 μm e sente-se numa placa de Petri contendo 13,5 mL de RPMI e 1,5 mL de FBS (o volume total é de 15 mL). Use o lado plano de um êmbolo da seringa para empurrar a placenta através do filtro na placa de Petri.</li>
	<li>Prepare 3 15 mL de tubos cônicos para cada tecido. Adicionar 3 mL de gradiente de densidade médio (ver tabela de materiais) para cada tubo, em seguida, cuidadosamente sobrepor 5 ml de placenta homogeneizada em cada tubo.</li>
	<li>Centrifugador por 25 min a 300 x g à temperatura ambiente (RT) sem travão. Colete a fina camada branca de Buffy com uma pipeta de transferência. Nota: Após a centrifugação, 3 camadas são visíveis, o RPMI vermelho na parte superior, a camada de Buffy branca no meio, e a camada clara do meio gradiente de densidade na parte inferior. Use uma pipeta de transferência para puxar para cima a camada de Buffy branco do tubo. Combine a camada Buffy de todos os tubos da mesma placenta em 1 tubo.</li>
	<li>Adicione 10 mL de RPMI a camadas Buffy combinadas. Centrifugador por 10 min, 300 x g, a 4 ° c e descarte o sobrenadante.</li>
</ol>2. isolação de pilhas naturais do assassino
<ol><li>Reressuscita a pelota da pilha em 50 μL de PBS Ice-Cold</li>
	<li>Adicione o anticorpo CD3 biotina-etiquetado às pilhas peletizadas de acordo com o protocolo do fabricante e misture bem com uma pipeta. Coloc o tubo em um rotator do tubo e incubar 20 minutos em 4 ° c.</li>
	<li>Adicione 1 mL de RPMI, centrifugue por 10 min a 400 x g e 4 ° c e descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspend pellet em 1 mL de RPMI e combine com 150 μL de grânulos magnéticos em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Coloc o tubo do microcentrifugador em um rotator do tubo e gire-o ao incuar por 30 minutos em 4 ° c. Nota: Retire o tampão de libertação neste momento e deixe-o chegar ao RT no gabinete de biossegurança.</li>
	<li>Coloque os tubos no íman durante 1 min. colete sobrenadante e salve a população de células CD3 em um tubo de 15 mL no gelo. Nota: Esta é a população CD3 das células.</li>
	<li>Retire o tubo do íman e adicione 1 mL de RPMI. Misture as células e os grânulos 5 vezes com uma pipeta.</li>
	<li>Repita o passo 2,5.</li>
	<li>Centrifugue a população CD3 de células por 10 min a 400 x g e 4 ° c e descarte o sobrenadante. Ressuscita a pelota da pilha em 50 μL de PBS Ice-Cold</li>
	<li>Adicione o anticorpo CD161a biotina-etiquetado às células CD3de acordo com o protocolo do fabricante e misture bem. Coloc o tubo em um rotator do tubo e incubar por 20 minutos em 4 ° c.</li>
	<li>Adicione 1 mL de RPMI, centrifugue por 10 min a 400 x g e 4 ° c e descarte o sobrenadante. Resuspend pellet em 1 mL de RPMI e combine com 150 μL de grânulos magnéticos em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Coloc o tubo do microcentrifugador em um rotator do tubo e gire-o ao incuar por 30 minutos em 4 ° c.</li>
	<li>Coloque os tubos em um ímã por 1 min. colete sobrenadante e descarte células CD3-/Cd161a.</li>
	<li>Retire o tubo do íman e adicione 1 mL de RPMI. Misture as células e os grânulos 5 vezes com uma pipeta.</li>
	<li>Repita o passo 2,12.</li>
	<li>Retire os tubos de microcentrífuga do íman e adicione 1 mL de tampão de libertação RT. Coloc o tubo no rotator do tubo e gire-o ao incuating por 15 minutos em RT.</li>
	<li>Coloque os tubos em ímã por 1 min. colete sobrenadante em um novo tubo cônico de 15 mL no gelo. Nota: Esta é a população de células NK.</li>
	<li>Retire o tubo do íman e adicione 1 mL de RT RPMI. Misture as células e os grânulos 5 vezes com pipeta.</li>
	<li>Repita o passo 2,16, colocando sobrenadante no mesmo tubo. Misture bem e tome uma amostra de 20 μL para contar as células Nota: Mantenha o tubo no gelo.</li>
	<li>Centrifugue CD3-/Cd161a+ Cells para 10 minutos, 400 x g em 4 ° c, a seguir remova o sobrenadante. Ressuscite as células em RPMI (10% FBS, 1% Pen/strep, 2 ng/mL IL-2) e semente em uma concentração de 3 x 105 células/bem em uma placa de 6 poços em 2,5 ml de NK Cell Activation Media. Incubar células para 48 h a 37 ° c, 5% CO2 em uma incubadora humidificada.</li>
</ol>3. ensaio de citotoxicidade: Recuperando células NK ou YAC1 de cultura ou células de passagem
Nota: Todos os passos devem ser conduzidos o capô. Todos os tubos de células devem ser mantidos no gelo em todos os momentos.
<ol><li>Use um Pipet sorológicos de vidro para coletar YAC1 pilhas e meios da garrafa, coloc em um tubo de 50 ml no gelo, e misture bem. Tome 20 μL para contar as células.</li>
	<li>Gire as células YAC1 por 10 min a 300 x g e 4 ° c. Contagem de células enquanto estes estão girando.</li>
	<li>Adicionar Trypsin/EDTA para cada poço em uma célula NK 6-placa bem. Bata a placa e coloc na incubadora.</li>
	<li>Depois que as pilhas incubadas com Trypsin/EDTA para ~ 5 minutos em 37 ° c, raspe a placa/frasco com um raspador estéril da placa. Adicione 1 mL de NK Cell Media a cada poço.</li>
	<li>Colete células e meios de comunicação com Pipet serológico e colete em um tubo de centrífuga de 15 mL. Tome 20 μL para contar as células.</li>
	<li>Gire as células NK por 10 min, 400 x g a 4 ° c. Conte a amostra de células da etapa 3,5 durante esta centrifugação. Nota: Veja as placas de cultura um microscópio antes de descartá-las para se certificar de que não há mais células aderentes ao fundo dos poços. Uma vez que o experimento usa células NK e células YAC1, certifique-se de contar cada um separadamente.</li>
	<li>Contagem de células e ressuscito nas concentrações determinadas em ensaios de otimização para testar o número adequado de alvo: relação Effector. Isto será conseguido resuspendendo a pelota em seus meios correspondentes para fazer as seguintes concentrações da pilha: YAC1 em 4 x 105 pilhas/ml e pilhas de NK em 2 x 107 Cells/ml.</li>
</ol>4. ensaio de citotoxicidade: protocolo de ensaio
<ol><li>Use uma parte inferior redonda, cultura tratou a placa 96-well para ajustar acima a placa como sugerido na tabela 1. Esta tabela mostra os controles experimentais e 3 conjuntos de colunas experimentais NK. Isso pode ser expandido para um total de 10 colunas experimentais NK em uma placa 96-well.</li>
	<li>Centrifugue a placa de ensaio a 250 x g durante 4 min para ter a certeza de que as células efetoras e alvo estão em contacto. Incubar a placa 96-well por 5 horas em uma incubadora umidificada da câmara em 37 ° c, 5% co2 para conseguir o contato amplo entre as pilhas do alvo e do efetoras e o lysis da pilha do alvo por pilhas do efetoras. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>45 min antes da colheita de sobrenadantes, adicione 10 μL de solução de Lise 10x aos poços de liberação máxima LDH da célula alvo (poços 1E, 1F, 1G e 1H) e coloque a placa de volta na câmara humidificada.</li>
	<li>Depois que o tempo de incubação é terminado, centrifugue a placa em 250 x g por 4 minutos usando um pipettor multicanal, transfira 50 μL de alíquotas de todos os poços para uma placa de ensaio de fundo plano de 96 bem fresca. Nota: Não toque na parte inferior dos poços para que as células não sejam transferidas para a chapa de ensaio fresca. Não use uma placa tratada cultivada como a placa fresca do ensaio.</li>
	<li>
Faça o reagente do ensaio.
	<ol>
<li>Depois que o buffer de ensaio atingiu a temperatura ambiente, adicione 12 mL de tampão de ensaio a um frasco de mistura de substrato. Inverta e agite suavemente até dissolver completamente. 1 garrafa é suficiente para 2 96-bem placas. Nota: O tampão do ensaio deve ser protegido da luz ao ser thawed. Misture imediatamente antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 50 μL de reagente de ensaio a todos os poços da placa de ensaio a partir do passo 4,6. Cubra a placa com a folha para protegê-la da luz e incubar por 30 minutos na temperatura ambiente. Nota: O reagente recentemente feito do ensaio deve ser armazenado em um congelador. O reagente é bom por aproximadamente 8 semanas.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de solução de paragem a cada poço. Leia a placa dentro de 1 hora após ter adicionado a solução da parada e registre a absorbância em 490 nanômetro. Os dados representativos são mostrados na tabela 2.</li>
</ol>5. cálculo dos resultados
<ol><li>Calcule o valor médio da absorvência dos poços do fundo do meio de cultura e subtraia de todos os valores da absorvência para experimental, liberação espontânea do LDH da pilha do alvo e poços espontâneos da liberação do LDH da pilha do effector.</li>
	<li>Calcule os valores médios de absorvância para os poços de controle de correção de volume e subtraia dos valores de absorvência adquiridos para os poços de controle de liberação de LDH de célula de destino máximo.</li>
	<li>Use os valores corrigidos das etapas 5,1 e 5,2 na seguinte fórmula para calcular a porcentagem de citotoxicidade para cada Effector: alvo bem. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58961/58961eq1.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Mediators%3A+A+causal+link+to+hypertension+during+pregnancy-+Studies+in+Preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia.</a> British Journal of Pharmacology. , (2018).</li>
<li>Elfarra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+mediate+pathophysiology+in+response+to+reduced+uterine+perfusion+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure.</a> Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).</li>
<li>Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+of+the+lytic+action+of+immune+lymphoid+cells+on+51-Cr-labelled+allogeneic+target+cells+in+vitro%3B+inhibition+by+isoantibody+and+by+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs.</a> Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).</li>
<li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells%3A+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).</li>
<li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLoS One. 10 (10), 0141074(2015).</li>
<li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay%3A+standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li>
<li>Karimi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cytotoxicity+by+bioluminescence+imaging+outperforms+the+standard+chromium-51+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay.</a> PLoS One. 9 (2), 89357(2014).</li>
<li>Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+gastroschisis+experimental+model+and+the+influence+of+the+mother%27s+diet+enriched+with+glutamine+in+the+fetal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cir%C3%BArgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother's diet enriched with glutamine in the fetal morphology.</a> Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).</li>
<li>Lv, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+distinction+of+rat+liver+natural+killer+cells+from+spleen+natural+killer+cells+under+normal+and+acidic+conditions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+and+Pancreatic+Diseases+International%22%5BJournal%5D)">Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro.</a> Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).</li>
<li>Flieger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+cellular+cytotoxicity+test+based+on+the+differential+assessment+of+living+and+killed+target+and+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).</li>
<li>Jang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+flow+cytometry-based+natural+killer+cytotoxicity+assay+involving+calcein+AM+staining+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells.</a> Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesse, financeiro ou de outra forma, é declarado pelos autores.

Há um número de importantes notas-chave a considerar para obter resultados ideais. A esterilidade das células utilizadas é muito importante. Após a coleta da placenta, é importante que a preparação e o isolamento das células NK sejam realizados condições estéreis em um gabinete de biossegurança. Além disso, como todas as células liberam LDH após dano celular, deve-se tomar cuidado para obter uma alta viabilidade das células NK após o isolamento e durante o processo de cocultura. Demasiada liberação espontânea do LDH das ...

A pré-eclâmpsia é uma doença hipertensiva da gravidez caracterizada por restrição de crescimento fetal, dano de órgão final e ativação imune crônica. A ativação imune crônica em mulheres com pré-eclampsia leva a aumento das citocinas inflamatórias circulantes e placentárias, um desequilíbrio nas populações de células T CD4+ e uma população aumentada de células de Killer natural (NK) ativadas1. Os estudos publicados recentemente por nosso laboratório demonstram um papel para pilhas de NK em causar alguma da patofisiologia associada com o pré-eclâmpsia no modelo reduzido do rato da pressão de perfusão uterine (Rupp) do pré-eclâmpsia. Utilizando-se a citometria de fluxo para medir a expressão superficial dos marcadores de ativação nas células NK, observou-se aumento da população de células NK ativadas na circulação e placentas de ratos RUPP comparados aos ratos gestantes normais (NP)2.
Para confirmar as observações de citometria de fluxo, foram realizados estudos funcionais para avaliar a atividade citotóxica de células NK isoladas das placentas dos ratos NP e RUPP. Existem vários métodos disponíveis para a avaliação da função citotóxica de células T citotóxicas CD8+ e células NK. O padrão-ouro para análise citotóxica funcional é o ensaio de liberação de cromo3. Outros protocolos desenvolvidos utilizados incluem citometria de fluxo4, citometria de imagem5, liberação de calceina6e, mais recentemente, bioluminescência7. Este vídeo fornecerá um protocolo detalhado em usar o ensaio bem estabelecido da liberação do desidrogenase do lactato (LDH) para medir a função citotóxica de pilhas de NK usando um jogo comercialmente disponível do ensaio da citotoxicidade de LDH.

<table><tbody><tr><td>Tubo Eppendorf de 1,5 mL</td><td>Fisher</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; Filtro L</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td>Malha de Nylon</td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 mL</td><td>Seringa Fisher</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3 mL</td><td>Fisher</td><td>14823436</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td> Placa de cultura de células <td>Fisher</td><td>7203510</td><td></td></tr> de <tr><td>6 poços Placa de cultura</td> de tecidos <td>de</td><td>720083</td><td></td>de</tr><tr><td>96 poços</td><td>CELLTREAT</td><td>229190</td><td>Estéril, Raspador de células</td></tr><tr><td>AOPI</td><td>Nexcelom</td><td>CS201065ML</td><td></td></tr> fundo redondo <tr><td></td><td>Fisher</td><td>8100241</td><td></td></tr><tr><td>Celômetro Câmaras de contagem descartáveis</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td>Celômetro Citômetro de imagem de visão</td><td>Nexcelom</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cytotox 96 Kit de ensaio de citotoxicidade não radioativa</td><td>Promega</td><td>G1780</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Flowcomp Flexi Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11061D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Ímã</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Citometria de Fluxo</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Fisher</td><td>NC0460539</td><td>Gradiente de densidade Média; 4 x 250 mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH3025801</td><td>10 x 500 mL</td></tr> de <tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri</td><td>Fisher</td><td>9720500</td><td>Sem Almofada</td></tr><tr><td>Purificado Mouse anti-Rato CD161a</td><td>BD Biosciences</td><td>555006</td><td></td></tr><tr><td>Rato Purificado anti-Rato CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>554829</td><td></td></tr><tr><td>Rato Recombinante IL-2</td><td>R& D Systems</td><td>502-RL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td>1640 Frasco Médio</td></tr><tr><td>T25</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>YAC-1 célula</td><td>ATCC</td><td>TIB-160</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio de citotoxicidade à base de placas para a avaliação da função citolítica de células assassinas naturais do rato

A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function

É sabido que as pilhas decidual natural do assassino (NK) jogam um papel crítico no estabelecimento e na manutenção da gravidez normal. Estudos recentes demonstraram uma população alterada de células NK circulantes e decidual em mulheres que sofrem de complicações adversas da gravidez, como aborto espontâneo e pré-eclampsia. Os estudos de nosso grupo mostraram que a hipertensão na gravidez é associada com um aumento da população de pilhas NK ativadas na placenta baseada na expressão de marcadores de ativação de superfície. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para avaliar a função citotóxica de pilhas de NK isoladas das placentas em um preeclampsia-como o modelo animal da isquemia placentária cirùrgica induzida. As seguintes etapas são descritas em detalhe: geração da única suspensão da pilha, isolação da pilha de NK, estimulação ex vivo, Effector: cocultura da pilha de alvo, e o ensaio da citotoxicidade.

Células NK placentárias obtidas de ratos NP e RUPP foram incubadas por 5 h com células-alvo em suas respectivas mídias em uma proporção de 50:1 (NK: Target). A absorbância foi registrada em 490 nm e os dados brutos são mostrados na tabela 2. Calculou-se a absorvência média do fundo do meio de cultura e os poços de controle de correção de volume. Essas médias foram subtraidas dos poços apropriados indicados no protocolo do fabricante e estão representadas na tabela 3. Os valores corrigido...

Aqui, nós fornecemos uma metodologia detalhada para isolar e avaliar a função citotóxica de pilhas naturais do assassino das placentas por um ensaio colorimétrico da placa. O modelo reduzido de rato de pressão de perfusão uterina de isquemia placentária foi escolhido para demonstrar o isolamento e a avaliação mediada por anticorpos da função citotóxica de células assassinas naturais.

Um ensaio de citotoxicidade à base de placas para a avaliação da função citolítica de células assassinas naturais do rato

It is well known that decidual natural killer (NK) cells play a critical role in establishment and maintenance of normal pregnancy. Recent studies have ...

Este método ajuda a comparar a atividade citotóxica de diferentes tipos de células usando um método simples e barato que não requer equipamento especializado. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer o uso de materiais perigosos, é barata e não requer o uso de equipamentos especializados. Este método pode ser aplicado para medir a atividade citotóxica de outros tipos celulares, como CD8 mais células citíticas ou mesmo para avaliar a morte espontânea de células sem incubação, sem células efeito citólíticas.Indivíduos novos nessa técnica provavelmente lutarão com a otimização da relação alvo para efeito ou célula. Meu conselho é fazer uma busca minuciosa na literatura para determinar as proporções que você testaria ao otimizar o protocolo. Embora este método não exija habilidades especializadas, além de pipetar com precisão, o isolamento das células mononucleares e a configuração da placa de ensaio são passos que podem ser mais fáceis de entender e imitar se forem observados visualmente.Demonstrando o procedimento estará Chelsea Jekelley, uma técnica do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, adicione 13,5 mililitros de RPMI em 1,5 mililitros de FBS a uma plac

a-plate-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-rat-placental-natural

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Ensaios de citotoxicidade para medir as respostas das células natural killer lítica de células infectadas pelo HIV é limitada pela pureza das células-alvo. Demonstramos aqui o isolamento de uma população altamente purificada de HIV-1 infectados primários de células T explosões tirando vantagem da capacidade do HIV-1 s para down-modular CD4.

Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos

Este vídeo demonstra um ensaio para medir a citotoxicidade de células natural killer contra células cancerígenas usando a coloração Calcein AM. O número reduzido de células cancerígenas fluorescentes após a co-cultura com células assassinas naturais indica citotoxicidade mediada por células assassinas naturais em relação às células cancerígenas.

Coloração de acetoximetil de calceína para avaliar a citotoxicidade mediada por células assassinas naturais em células cancerígenas

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para medir a capacidade citotóxica das células assassinas induzidas por citocinas (CIK) contra células cancerígenas. Após a co-cultura de células-alvo cancerígenas com células CIK, as células cancerígenas mortas são identificadas usando um corante de viabilidade fluorescente e são quantificadas usando citometria de fluxo, estimando o efeito citotóxico das células CIK.

Um ensaio in vitro para estudar a capacidade citotóxica de células assassinas induzidas por citocinas

Este vídeo demonstra a atividade lítica das células natural killer contra as células-alvo coradas com fluorescência. O método permite a medição da citotoxicidade induzida por células NK colorindo células mortas e usando um citômetro de fluxo para quantificar células-alvo vivas e mortas.

Preparação de amostra de ensaio de citotoxicidade mediada por células natural killer para análise de citometria de fluxo

Este vídeo demonstra a realização de um ensaio de liberação de lactato desidrogenase para determinar a citotoxicidade das células natural killer (NK) contra as células cancerígenas alvo. O ensaio quantifica a liberação da enzima lactato desidrogenase citoplasmática das células cancerígenas, medindo a absorbância do produto de cor vermelha formado.

Um ensaio in vitro para avaliar a citotoxicidade de células assassinas naturais contra células cancerígenas

Os leucócitos hepáticos marginais exibem características únicas e funções imunológicas distintas em comparação com outras populações de leucócitos. Aqui descrevemos um método para colheita seletiva dessa população específica de células hepáticas, por meio de perfusão forçada do fígado de ratos ou camundongos. Os leucócitos hepáticos marginais parecem críticos na determinação da suscetibilidade a doenças e metástases relacionadas à hepatia.

Colheita seletiva de Marginating-hepática Leucócitos

Um método baseado em citometria de fluxo para determinar quantitativamente a atividade citotóxica de células humanas de assassino natural é mostrado aqui.

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

A erradicação mediada por células por células cancerígenas é importante para a iniciação e progressão do câncer. Aqui, apresentamos dois protocolos não baseados em radioatividade para avaliar a citotoxicidade mediada por célulank em relação às células tumorais hepáticas. Além disso, um terceiro protocolo é apresentado para analisar a migração de células NK.

Medição da Citotoxicidade e Migração Mediadas por Células Assassinas Naturais no Contexto das Células Tumorais Hepáticas

Um protocolo para estudar eventos orientados pela FcγRIIIa por anticorpos terapêuticos em células assassinas naturais humanas é descrito aqui. Esta plataforma de estimulação artificial permite o interrogatório de funções de efeitos a jusante, como degranulação, produção de quimiocina/citocina, e caminhos de sinalização mediados pelas porções fcγriiia e fc de anticorpos envolvidos na vinculação.

Avaliação de Eventos celulares assassinos naturais humanos impulsionados pelo engajamento da FcγRIIIa na presença de anticorpos terapêuticos

O protocolo descreve um ensaio rápido, de alto rendimento, confiável, barato e imparcial para determinar eficientemente a viabilidade celular. Este ensaio é particularmente útil quando as mitocôndrias das células foram danificadas, o que interfere com outros ensaios. O ensaio utiliza a contagem automatizada de células manchadas com dois corantes nucleares – Hoechst 33342 e iodeto de propidium.

Um ensaio automatizado de coloração nuclear diferencial para determinação precisa da citotoxicidade mitocana

Este protocolo oferece um fluxo de trabalho padronizado in vitro. para medição consistente da citotoxicidade natural, mediada pelo receptor de antígeno quimérico e dependente de anticorpos de células humanas natural killer, utilizando imagens de células vivas e citometria de fluxo.

Quantificação da citotoxicidade de células NK potenciada por receptores de antígeno quiméricos e anticorpos terapêuticos usando imagem de células vivas e citometria de fluxo

Aprenda a avaliar a função citotóxica de células assassinas naturais de placentas de ratos usando um ensaio colorimétrico simples e econômico. Este método acessível permite comparar atividades citotóxicas sem equipamentos especializados.

Um ensaio de citotoxicidade à base de placas para a avaliação da função citolítica de células assassinas naturais do rato

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