Name: Avaliar a integridade do DNA de células-tronco para terapia celular cardíaca (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a avaliar a integridade do DNA em células-tronco para terapia cardíaca regenerativa usando ensaios cometa e imunomarcação. Este método garante a qualidade celular antes do transplante.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo nacional do coração, pulmão e sangue Instituto bolsas RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 e UO1-HL-134764 (para J. Zhang) e pela American coração Associação científica desenvolvimento Grant 17SDG33670677 (a. R. Kannappan).

1. ensaio cometa
<ol><li>
Preparação do reagente
	<ol>
<li>Para agarose de baixo ponto de fusão, coloque 500 mg de agarose de baixo ponto de fusão em 100 mL de DNA - RNA-livre água /. Aqueça a garrafa em um forno de microondas, até que se dissolva a agarose. Coloque o frasco num banho de água de 37 ° C até que seja necessário. Nota: Para ler mais, consulte Azqueta et al, que estudou os efeitos da concentração de agarose no tempo DNA-desenrolar e vários fatores de electroforese23.</li>
		<li>Dilua o corante SYBR green DNA em tampão Tris-EDTA (TE) na proporção de 1:10,000 para obter um 1 x solução de tintura estoque de trabalho. Esta tintura é sensível à luz, então armazená-lo em um lugar escuro.</li>
		<li>Para a lise celular, dissolver 100 mL de tampão de lise (2,5 M NaCl, EDTA 0,1 M, 10 mM Tris, 1% Triton X-100) em água deionizada (DI H2O). Em seguida, adicione 10 M NaOH para ajustar o pH a 10.0. Legal o buffer de 4 ° C.</li>
		<li>Para o buffer de execução DNA-desenrolar/eletroforese alcalino, dissolver 1 L de solução alcalina (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA) em DI H2Cool O. o buffer de 4 ° C. Certifique-se o pH > 13.</li>
		<li>Para slides cometa pré-revestidos, coloque algumas gotas de 0,5% de agarose sobre uma lâmina de vidro. Imediatamente, usando a superfície plana de outro slide, espalhe o agarose para formar uma fina camada de revestimento de agarose. Nota: Seca as lâminas antes de usar.</li>
		<li>Para cultura de células iPS, brevemente as células iPS de cultura no porão-membrana-matriz-revestido (ver Tabela de materiais) cultura placas em meio de cultura de mTESR1 até confluência é alcançada. Nota: Células iPS de humanos-cardíaco fibroblasto-derivados foram utilizadas no presente protocolo. A reprogramação de derivação de células iPS e as condições de cultura é descrita em artigos recentes de nossa pesquisa grupo12,13,21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da amostra
	<ol>
<li>Descartar o meio de cultura e lavar as células. Dissociar as células usando a solução de destacamento (ver Tabela de materiais). Lave o centrifugado com tampão fosfato salino (PBS) e ressuspender as células em PBS a 1 x 105 células/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da amostra slide Nota: Execute as seguintes etapas sob condições de pouca luz, para evitar danos nas células ultravioleta luz-induzida.<ol>
<li>Mix 10 μL da suspensão de células e 90 μL de solução de agarose (01:10 proporção) em um tubo. Coloca o tubo em um banho de água de 37 ° C para evitar que a agarose solidificar.</li>
		<li>Misturar as soluções sem a introdução de bolhas de ar e pipetar 70 μL/spot para o slide pré-revestido cometa. Utilizando uma pipeta de ponta, espalhe a mistura de agarose de célula para formar uma camada fina. Coloque o slide em 4 ° C por 15 min.</li>
		<li>Em um recipiente, mergulhe completamente o slide em tampão de Lise fria. Coloque o recipiente no escuro a 4 ° C, durante 1 h.</li>
		<li>Substitua o tampão de Lise fria solução alcalina. Assegure-se de que os slides estão completamente submersos. Coloque o recipiente no escuro a 4 ° C por 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eletroforese
	<ol>
<li>Coloque o slide em um tanque de eletroforese horizontal. Encha o depósito com tampão de eletroforese alcalina frio até que as lâminas estão completamente submersos. Aplica tensão a 1 V/cm por 15 a 30 min. Nota: Total de tensão = distância entre os eletrodos x 1 V</li>
		<li>Em um recipiente, mergulhe completamente o slide no frio DI H2O. Depois de 2 min, retire o DI H2O e adicione fresco DI H2O. repetir este passo.</li>
		<li>Substitua o DI H2O frio etanol a 70%. Espere 5 min. gentilmente remover o slide, não incliná-lo e deixá-lo secar ao ar livre.</li>
		<li>Uma vez seco, adicione 100 μL de tintura diluída do DNA para cada local. Espere 15 min à temperatura ambiente. Usando um filtro FITC em um microscópio de epifluorescência, com imagens de cometas de 50 a 100 no total por amostra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de imagem e cálculo dos resultados
	<ol>
<li>Para marcar os cometas, usar o National Institutes of Health (NIH) ImageJ com plugin do ensaio cometa (download ImageJ aqui: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; Baixe o plugin aqui: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/). Nota: O plugin vem com uma instrução de PDF que contém todos os detalhes para realizar a análise. Além disso, screenshots da análise cometa são mostrados na Figura 2A-C. Imagens do cometa representativa de controle e doxorrubicina (Doxo)-células iPS tratados e a quantificação dos cometas são mostrados na Figura 3A-C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. resposta de dano de DNA
<ol><li>Preparação de amostra e reagente
	<ol>
<li>Para uma cultura de células iPS-CM, cultura iPS-CM pilhas no porão-membrana-matriz-revestido (ver Tabela de materiais) placas de cultura em RPMI suplementado com B-27 (CMM) até confluência é alcançada. Nota: Humanos-iPS-derivado de células cardiomyocytes foram utilizados no presente protocolo. O protocolo para a diferenciação de células iPS em cardiomyocytes pode ser encontrado em artigos recentes de nossa pesquisa grupo12,13,21.</li>
		<li>Semente de iPS-CMs em slides de câmara.<ol>
<li>Descarte o meio de cultura de poços de iPS-CM. Lave as células três vezes com PBS.</li>
			<li>Adicione 1 mL de tripsina 0,25% por bem e incubar a 37 ° C por 5 min. verificar a placa sob um microscópio para o destacamento de célula. Adicione 1 mL de CMM para parar a tripsina.</li>
			<li>Coloque a suspensão de células em um tubo de 15 mL e centrifugar por 5 min a 4 ° C e 200 x g. Descartar o meio, adicionar 1 mL de CMM e ressuspender as células. Contar as células e ajustar a contagem de células para obter células de 20 x 105 em 1,6 mL de CMM.</li>
			<li>Semente de 200 µ l de suspensão de células por poço da câmara 8 poços deslize (ver Tabela de materiais). Toque o deslize suavemente para espalhar as células ao redor do poço e incubar a 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para o tratamento de doxorrubicina iPS-CM, descarte o meio de cultura de poços de iPS-CM. Lave as células com PBS. Tratar as células com 1 doxorrubicina μM e CMM para 4 h. Aspire o meio e lavar as células com PBS.</li>
		<li>Para o tampão de bloqueio, prepare-se 10 mL da solução de albumina de soro bovino (BSA) contendo 3% de BSA e 0,05% Triton X-100. Para preparar 10 mL de tampão de bloqueio, adicione 1 mL de soro normal burro para 9 mL da solução preparada de BSA.</li>
		<li>Para a solução de anticorpo primário, adicione 1 μL de antifosfo coelho-histona H2A. X (Ser139) anticorpo para 200 μL de tampão de bloqueio.</li>
		<li>Para a mistura de anticorpo secundário, adicione 1 μL de conjugados a fluorocromo coelho anti anticorpo secundário, DAPI e conjugados a fluorocromo faloidina para 200 μL de tampão de bloqueio.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunolabeling
	<ol>
<li>Lavar as células três vezes com PBS e adicionar 200 μL de acabadas paraformaldeído 4% (PFA) em cada poço. Conserte as células por 20 min no escuro à temperatura ambiente. Lave as células com PBS.</li>
		<li>Remover a PBS e adicionar 200 μL de tampão de bloqueio por poço e bloco por 30 min em uma câmara humidificada à temperatura ambiente. Retire o tampão de bloqueio e adicionar 200 μL de solução de anticorpo primário. Incube durante 45 min em uma câmara escura, umidificada à temperatura ambiente. Em seguida, lave os poços três vezes com PBS.</li>
		<li>Remova a PBS e adicione 200 μL de mistura de anticorpo secundário. Incube durante 45 min em uma câmara escura, umidificada à temperatura ambiente. Em seguida, lave os poços três vezes com PBS. Lavar com DI H2O, antes de montá-los com Media. Coloque uma lamela e armazenar os slides no escuro a 4 ° C.</li>
		<li>Usando um microscópio de epifluorescência, tomar três a cinco imagens de campos aleatórios por amostra, como indicado na Figura 4Ae proceder à análise de imagem.</li>
	</ol></li>
	<li>Contagem dos focos da DDR
	<ol>
<li>Baixe e instale CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).</li>
		<li>
Nota: Imagem de processamento neste estudo foi realizada usando CellProfiler versão 2.1.1. Tutoriais para CellProfiler que foram usados podem ser encontrados em outro lugar (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & lista = PL7CC87670239B4D10). Se uma versão mais recente de CellProfiler está sendo usada, o gasoduto pode exigir adaptações menores.</li>
		<li>Baixe o oleoduto punctae_gH2AX.cpipe. Selecione arquivo > importar > Pipeline do arquivo e escolha punctae_gH2AX.cpipe.</li>
		<li>Arrastar e soltar a pasta que contém as imagens adquiridas de focos γH2A.X para a janela de lista de arquivo na seção de Módulos de entrada/imagens para análise (Figura 5A). Siga as instruções, como mostrado na Figura 5A-L.</li>
		<li>Defina os seguintes parâmetros para as imagens:<ol>
<li>Arraste a imagem desejada para a análise da lista de arquivos. Em módulos de entrada, selecione imagens (ver Figura 5A para configurações do módulo). Em módulos de entrada, selecione metadados (ver Figura 5B para configurações do módulo). Em módulos de entrada, selecione NamesAndTypes (consulte a Figura 5 para as configurações do módulo).</li>
			<li>Para grupos, selecione nenhum. Em módulos de análise, selecione ColorToGray (consulte a Figura 5 para as configurações do módulo).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Em módulos de análise, selecione suave (ver Figura 5E para configurações do módulo). Nota: Esse valor pode precisar de ser otimizado, dependendo da resolução da imagem.</li>
		<li>Em módulos de análise, selecione IdentifyPrimaryObjects (ver Figura 5F para configurações do módulo). Nota: Otimize esses valores para certificar-se que o núcleo inteiro é selecionado. Após esta etapa, o computador pode ficar.</li>
		<li>Em módulos de análise, selecione suave (consulte a Figura 5 para as configurações do módulo). Nota: Esse valor pode precisar de ser otimizado, dependendo da resolução da imagem.</li>
		<li>Em módulos de análise, selecione EnhanceOrSuppressFeatures (consulte a Figura 5 H para as configurações do módulo).</li>
		<li>Em módulos de análise, selecione IdentifyPrimaryObjects (ver Figura 5I para configurações do módulo). Nota: Otimize esses valores para certificar-se de que os punctae são selecionados. Após esta etapa, o computador pode lag novamente.<ol>
<li>Em módulos de análise, selecione RelateObjects (ver Figura 5J para configurações do módulo). Em módulos de análise, selecione ClassifyObjects (consulte a Figura 5 K para as configurações do módulo). Em módulos de análise, selecione ExportToSpreadsheet (consulte a Figura 5 L para as configurações do módulo).</li>
			<li>Clique em Analisar imagens no painel inferior esquerdo para realizar a análise de imagem. Após a conclusão bem sucedida da análise, várias imagens são geradas (Figura 6A-F). Nota: Os usuários devem salvar essas imagens para referência futura.</li>
			<li>Observação o arquivo CSV que contém os dados quantitativos para uma análise mais adicional que é gerado e salvo no local apropriado no computador. Na planilha chamada MyExpt_Image, colunas B e D terá o número de núcleos que têm até cinco e mais punctae, respectivamente. Adicione colunas B e D para obter o número total de núcleos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Repita a etapa 2.3.3 - 2.3.8 para todas as imagens (mudar o nome do arquivo MyExpt_ antes de cada análise). Parcelas podem ser feitas para avaliar a integridade do DNA, como mostrado na Figura 4.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+%28CADUCEUS%29%3A+a+prospective%2C+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li>
<li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li>
<li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li>
<li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li>
<li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li>
<li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li>
<li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li>
<li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li>
<li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li>
<li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li>
<li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals%2C+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li>
<li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%3A+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
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<li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li>
<li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li>
<li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li>
<li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+more+reliable+comet+assay%3A+optimising+agarose+concentration%2C+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleation+of+cardiomyocytes%3A+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Integridade do DNA retrata a integridade celular. Células com DNA danificado são frequentemente em stress e eventualmente perdem sua integridade. A integridade do tronco e células tronco-derivado de células que estão sendo propagadas para fins de transplante é principal para as células executar sua função pretendida. Transplante de células com DNA danificado resultaria em uma taxa de enxertia pobre e desempenho da célula8,20. Por conseguinte, examinar a integrida...

Evidências experimentais e clínicas demonstra que o transplante de células moderadamente pode melhorar o desempenho contrátil do ventrículo esquerdo de falhando corações1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Avanços recentes abriram ainda mais atraentes oportunidades de regeneração cardiovascular; Estes incluem a expressão forçada de reprogramação fatores em células somáticas para induzir a pluripotência e diferenciar essas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) em diferentes linhagens cardíacas, importante casos (CM)10, 11 , 12 , 13. o material hereditário em todas as células, incluindo os artificialmente gerado iPSCs e derivado de iPSC CM (iPS-CM), é DNA. Instruções genéticas armazenadas no DNA dita o crescimento, desenvolvimento e função de células, tecidos, órgãos e organismos. DNA não é inerte; metabólitos, tais como reativas de oxigênio, carbonila e espécies de nitrogênio, de células e agentes alquilantes pode DNA causa danos in vitro e in vivo14,15,16,17. Importante, o dano ao DNA ocorre intuitivamente em cada célula, com uma frequência significativa. Se esses danos não são corrigidos, conduzirá a mutação de DNA, senescência celular, a perda da integridade do DNA e células e possivelmente, doenças, incluindo câncer fatal. Portanto, mantendo a integridade do DNA é essencial para qualquer célula, especialmente iPSCs, que tem um enorme potencial na clínica.
Para avaliar a quantidade e a integridade do DNA genômico de isolados, equipamento caro está disponível no mercado. No entanto, não há nenhum método simples e econômico para avaliar a integridade do DNA nas células sem isolar as células. Além disso, degradação de DNA induzida pelo usuário durante o isolamento do DNA é uma das principais desvantagens em usar esses métodos. O gel de célula única eletroforese (conhecido como ensaio cometa)18,19 e γH2A.X immunolabeling8 técnicas é abordagens fundamentais em laboratórios de pesquisa para avaliar o dano do ADN. Esses dois métodos não exigem equipamentos caros ou DNA genômico isolado para analisar DNA integridade8,20,21. Desde então, estas técnicas têm sido realizadas com células toda; degradação de DNA/RNA/proteína induzida pelo usuário durante a preparação da amostra não afetará a esses protocolos. Aqui, para avaliar os danos ao DNA e resposta de dano do ADN no tronco e células tronco-células-derivadas, nós fornecemos protocolos passo a passo para executar tanto o cometa do ensaio e γH2A.X immunolabeling. Além disso, combinando essas duas abordagens, propomos uma avaliação ingênua que pode ser usada para avaliar a adequação da célula para transplante.
O ensaio cometa, ou célula única electroforese do gel, mede as quebras de DNA nas células. Incorporado em agarose de baixo ponto de fusão de células lysed para nucleoids de formulário contendo DNA supercoiled. Após eletroforese, pequenos pedaços de DNA fragmentado e fios quebrados de DNA migram através dos poros de agarose, Considerando que o DNA intacto, devido ao seu enorme tamanho e sua conjugação com a proteína da matriz, terá uma migração restrita. O padrão de DNA manchada sob um microscópio de fluorescência imita um cometa. A cabeça do cometa contém DNA intacto e a cauda é composta de fragmentos de quebrar cadeias de ADN. A fração de dano do ADN pode ser medida pela intensidade da fluorescência do DNA danificado (cauda de cometa) em relação a intensidade de (cabeça de cometa) de DNA intacta. O momento de cauda do parâmetro pode ser calculado como mostrado na Figura 1.
Danos ao DNA induz a fosforilação de histona H2A. X (γH2A.X) no Ser139 por quinases ATM, ATR e DNA-PK. A fosforilação e o recrutamento da H2A. X em quebras da cadeia de ADN é chamada de resposta de dano de DNA (DDR) e acontece rapidamente depois que o DNA é danificado. Após este processo, detenção de ciclo de celular mediada por ponto de verificação e DNA são iniciados os processos de reparação. Após a conclusão bem-sucedida de reparação do ADN, γH2A.X é dephosphorylated e inativado por fosfatases. Prolongada e múltiplas quebras DNA levam ao acúmulo de focos γH2A.X no DNA. Isto indica a incapacidade da célula para reparar os danos do DNA e a perda da integridade do DNA. Estes focos γH2A.X no DNA podem ser identificados por... e o número de focos DDR pode ser contado usando o protocolo na secção 2.

<table><tbody><tr><td>0,25% de tripsina</td><td>Corning</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>lâmina de câmara de 8 poços</td><td>Millicell</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td>Solução de descolamento celular</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>711-545-152 (RRID: AB_2313584)</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>711-165-152 (RRID:AB_2307443)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Gibco B-27 Suplemento, sem soro,</td> <td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento Matrigel reduzido</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>FaloidinaA488</td><td>Life Technology</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-histona H2A. X (Ser139)</td><td>Tecnologia de Sinalização de Célula de Anticorpo</td><td>2577 (RRID: AB_2118010)</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&nbsp; Verde I coloração de gel de ácido nucleico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher científico</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Baixo ponto de fusão Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Antifade</td></tr></tbody></table>

avaliar a integridade do dna de células-tronco para terapia celular cardíaca

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Tronco e células tronco-células-derivadas têm imenso potencial como uma terapia regenerativa para várias doenças degenerativas. DNA é o armazém de dados genéticos em todas as células, incluindo células-tronco, e sua integridade é fundamental para a sua capacidade de regeneração. Células-tronco passam por propagação rápida em laboratórios para alcançar os números necessários para transplante. Crescimento acelerado celular leva à perda da integridade do DNA por metabólitos acumulados, como reativas de oxigênio, carbonila e agentes alquilantes. Estas células de transplantação resultaria em enxertia pobre e regeneração do órgão se deteriorando. Além disso, transplante de células de DNA danificado leva a mutações, instabilidade do DNA, senescência celular e possivelmente, fatais doenças como o câncer. Portanto, há uma necessidade imediata de um método de controle de qualidade avaliar a adequação da célula para transplante. Aqui, nós fornecemos protocolos passo a passo para a avaliação da integridade da DNA de células antes do transplante de células-tronco.

Células-tronco pluripotentes induzidas humanas foram cultivadas, e os danos do DNA e o momento de cauda, que eram usados como uma medida de integridade do DNA, foram analisados por meio de ensaio cometa. células iPS foram incorporadas em agarose de baixo ponto de fusão e colocadas em uma lâmina de vidro. As células foram, em seguida, tratadas com tampão de Lise, seguido por uma solução alcalina, para obter o DNA supercoiled. Nucleoids foram electrophoresed e cometas foram visualizados pel...

Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de uma instalação experimental para uma análise da avaliação da integridade do DNA em células antes do transplante de células-tronco.

Avaliar a integridade do DNA de células-tronco para terapia celular cardíaca

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Para doenças neonatais como cardiomiopatia, a terapia regenerativa usando células-tronco pluripotentes induzidas tem um enorme potencial. No entanto, o crescimento acelerado das células in vitro leva a danos no DNA por metabólitos acumulados, como espécies reativas de oxigênio. Transplantar essas células danificadas pelo DNA resultaria em má engrafia e regeneração do órgão.Antes do transplante, a qualidade das células deve ser avaliada. Aqui fornecemos dois protocolos passo a passo para avaliar os danos de DNA em células-tronco. Os procedimentos serão Jessica Miller, pesquisadora, Nikhil Mardhekar, pesquisadora, e Vasanthi Rajasekaran, técnica de laboratório.Para começar, coloque 500 miligramas de agarose de baixo derretimento em 100 mililitros de água livre de DNA-RNA. Aqueça a garrafa em um forno de micro-ondas até que a ágarose se dissolva. Em seguida, coloque a garrafa em um banho de água de 37 graus Celsius até que seja necessário.Para preparar slides de cometas pré-revestidos, coloque algumas gotas de 0,5% em um slide de vidro. Espalhe imediatamente a agarose para formar uma fina camada de revestimento de agarose usando um deslizamento de tampa. Trabalhando sob condições de baixa luz para evitar danos celulares ultravioletas induzidos pela luz, misture 10 microliters de suspensão celular e 90 microliters de solução agarose em um tubo.Coloque o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius para evitar que a agarose se solidifique. Misture a solução sem introduzir bolhas de ar e pipeta 70 microliters por ponto no slide do cometa pré-revestido. Usando uma ponta de pipeta, espalhe a mistura de agarose celular para formar uma camada fina.Coloque o slide em quatro graus Celsius por 15 minutos. Em um recipiente, submerga completamente o deslizamento em tampão de lise fria. Coloque o recipiente no escuro a quatro graus Celsius por uma hora.Substitua o tampão de lise por solução alcalina fria. Certifique-se de que os slides estão completamente submersos. Depois de deixar o recipiente no escuro a quatro graus Celsius por mais 30 minutos, coloque o slide em um tanque de eletroforese horizontal.Encha o tanque com tampão de eletroforese alcalina a frio até que os slides estejam completamente submersos. Aplique tensão a um volt por centímetro por 15 a 30 minutos. Em um recipiente, submerga completamente o escorregador em água deionizada fria.Depois de dois minutos, retire a água deionizada e adicione água deionizada fresca e, em seguida, repita esta etapa uma segunda vez. Em seguida, substitua a água deionizada por 70% de etanol frio. Depois de cinco minutos, remova suavemente o slide sem inclinar-o e deixe-o secar.Uma vez seco, adicione 100 microliters de corante de DNA diluído em cada ponto, e espere 15 minutos em temperatura ambiente. Usando um filtro FITC em um microscópio de epifluorescência, tire imagens de 50 a 100 cometas no total por amostra. Cardiomiócitos derivados do iPS, como descrito no protocolo de texto.Para ver os cardiomiócitos derivados do iPS em lâminas de câmara, primeiro descarte o meio de cultura dos poços e lave as células três vezes com PBS. Adicione um mililitro de 0,25% Trypsin por poço, e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos. Verifique a placa sob um microscópio para desprendimento celular.Em seguida, adicione um mililitro de CMM para parar o Trypsin. Coloque a suspensão celular em um tubo de 15 mililitros e centrífuga por cinco minutos a quatro graus Celsius e 200 vezes g. Descarte o meio, adicione um mililitro de CMM e resuspenque as células.Conte as células e ajuste a contagem celular para obter dois milhões de células em 1,6 mililitros de CMM. Agora semente 200 microliters de suspensão celular por poço do slide de câmara de oito poços. Toque no slide suavemente para espalhar as células ao redor do poço.Incubar as células a 37 graus Celsius. Para o tratamento de doxorubicina cardiomiócito derivado do iPS, descarte o meio de cultura dos poços de cardiomocíte derivados do iPS e lave as células com PBS. Trate as células com doxorubicina de um micromolar por quatro horas a 37 graus Celsius.Aspire o meio e lave as células com PBS. Para realizar o imunolabelamento, lave as células três vezes com PBS e adicione 200 microliters de 4% de paraformaldeído recém-preparado a cada poço. Conserte as células por 20 minutos no escuro à temperatura ambiente.Depois de lavar as células com PBS, adicione 200 microliters de tampão de bloqueio por poço, e bloqueie por 30 minutos em uma câmara umidificada à temperatura ambiente. Remova o buffer de bloqueio e adicione 200 microliters da solução de anticorpos primários. Depois de incubar por 45 minutos em uma câmara escura umidificada à temperatura ambiente, lave os poços três vezes com PBS.Remova o PBS e adicione 200 microliters de mistura de anticorpos secundários. Incubar por 45 minutos em uma câmara escura umidificada à temperatura ambiente. Em seguida, lave os poços três vezes com PBS.Lave com água deionizada antes de montar os slides com antifado. Coloque um copo de cobertura e armazene os slides no escuro a quatro graus Celsius. Usando um microscópio confocal, pegue de três a cinco imagens de campos aleatórios por amostra e prossiga para análise de imagem.Para contar os focos de resposta a danos de DNA, baixe e instale o CellProfiler. Selecione arquivo, importação, pipeline do arquivo e escolha o arquivo de pipeline chamado puncti gamma-H2AX. Arraste e solte a pasta contendo as imagens adquiridas de focos gama-H2AX para a janela de lista de arquivos na seção de imagens dos módulos de entrada para análise.Em seguida, siga as instruções como mostrado no protocolo de texto. Para definir os parâmetros das imagens, arraste a imagem desejada para análise na lista de arquivos. Em módulos de entrada, selecione imagens.Também em módulos de entrada, selecione metadados e selecione nomes e tipos. Para grupos, selecione não. Trabalhando em módulos de análise, selecione cor a cinza.Em seguida, selecione suavemente, selecione identificar objetos primários e selecione novamente suavemente. Em seguida, selecione melhorar ou suprimir recursos e, em seguida, selecione identificar objetos primários. Ainda trabalhando em módulos de análise, selecione objetos de relação, depois classifique objetos e, finalmente, selecione exportar para planilha.Clique em analisar imagens no painel inferior esquerdo para realizar a análise da imagem. Na conclusão bem sucedida da análise, várias imagens são geradas. Observe o arquivo CSV gerado e salvo no local apropriado no computador.Este arquivo contém os dados quantitativos para análise posterior. Na planilha chamada minha imagem de experimento, a coluna B terá o número de núcleos que têm até cinco puncti, e a coluna D terá o número de núcleos que possuem mais de cinco puncti. Adicione as colunas B e D para obter o número total de núcleos.Repita estes passos para todas as imagens, alterando o meu nome de arquivo de experimento antes de cada análise. Micrografos representativos de cometas de células iPS tratadas com doxo e não tratadas são mostrados aqui. Uma quantidade basal de dano de DNA foi encontrada em células iPS, expressas como uma fração de dano de DNA e momento da cauda.No entanto, o tratamento do doxo aumentou o dano de DNA em células iPS como esperado, indicando que o ensaio do cometa pode ser usado para avaliar a integridade do DNA em células-tronco pluripotentes. Micrografos representativos da imunolabeling gama-H2AX são mostrados aqui, em menor ampliação e em maior ampliação. No controle de cardiomiócitos derivados do iPS, mais de 90% das células apresentavam menos de cinco focos de DDR por núcleos.E um total de menos de 10% das células tinha mais de seis focos de DDR por núcleos. Para cardiomiócitos derivados do iPS cultivados por seis meses, menos de 90% das células tinham até cinco focos de DDR por núcleos, e um total de mais de 13% das células tinham mais de seis focos de DDR por núcleos. Considerando que nos cardiomiócitos derivados do doxo iPS, menos de 80% das células tinham até cinco focos de DDR por núcleos.E um total de cerca de 24% das células tinham mais de seis focos de DDR por núcleos. Esses dados indicam que a cultura celular cardiomiócito derivada do iPS prolongada e o tratamento doxo induziram danos significativos no DNA, tornando-os inadequados para transplante celular. É muito importante evitar variáveis ao misturar a suspensão celular, pois isso pode afetar a eletroforese.Após este procedimento, você pode realizar os ensaios do cometa e os procedimentos de imunolabeling com células de vários tipos. Essas técnicas permitirão que células de vários tipos sejam avaliadas para danos ao DNA antes de serem usadas em estudos de transplante celular.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Núcleos cardíaca são isolados através de sedimentação densidade e immunolabeled com anticorpos contra o material pericentriolar 1 (PCM-1) para identificar e classificar os núcleos dos cardiomiócitos por citometria de fluxo.

Isolamento dos núcleos dos cardiomiócitos a partir de Post-mortem de tecidos

Descrevemos aqui um ensaio in vivo de mutagénese para pequenos números de células hematopoiéticas purificados utilizando o modelo de ratinho transgénico Lacl. O gene LacI pode ser isolado para determinar a frequência, a localização eo tipo de mutantes de DNA espontaneamente surgido ou após a exposição ao genotoxinas.

A identificação de DNA Mutações em Purificada-Tronco Hematopoéticas / células progenitoras

O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

A quantificação da renovação de cardiomiócitos é um desafio. O protocolo aqui descrito faz uma contribuição importante para esse desafio, permitindo a quantificação precisa e sensível da geração de núcleos de neocardiomiócitos e ploidia de núcleos.

Avaliação simultânea de Cardiomyocyte DNA Síntese e Ploidia: Um Método de Assistência Quantificação dos cardiomiócitos Regeneração e volume de negócios

Apresentamos três protocolos de novos e mais eficientes para a diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas induzida em cardiomiócitos, células endoteliais, e células do músculo liso e um método de entrega que melhora o enxerto de células transplantadas através da combinação de injecção das células com citocinas entrega mediada por remendo.

Pluripotentes Stem Cell Derivado células cardíacas para reparo do miocárdio

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a geração e quantificação de diversos subtipos cardíacos reprogramados usando uma entrega mediada por retrovírus de Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Aqui, apresentamos um método para eficientemente aproveitar o potencial de diferenciação cardíaca da jovens fontes de células-tronco mesenquimais humanas a fim de gerar células funcionais, contratantes, casos, como in vitro.

In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

O objetivo geral deste artigo é a padronização do protocolo para o isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas (CSCs) do fundo do coração de rato adulto. Aqui, descrevemos um método de centrifugação gradiente de densidade para isolar murino CSCs e métodos elaborados para CSC cultura, proliferação e diferenciação em cardiomyocytes.

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

Neste protocolo, podemos demonstrar e elaborar sobre como usar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para diferenciação e purificação de cardiomiócitos, e ainda, sobre como melhorar sua eficiência de transplante com inibidor de proteína quinase associada a Rho pré-tratamento em um modelo de infarto do miocárdio do camundongo.

Melhorar o Engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da Rho kinase

Aqui, demonstramos um método de avaliação da contratilidade de dispositivos médicos cardíacos não invasivos usando monocamadas de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D (hiPSC-CM), banhadas em um substrato flexível, juntamente com microscopia baseada em vídeo. Esta ferramenta será útil para a avaliação in vitro das propriedades contráteis de dispositivos de eletrofisiologia cardíaca.

Avaliação da Terapia de Modulação da Contratilidade Cardíaca em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Humanas 2D

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.

Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular

Aprenda a avaliar a integridade do DNA em células-tronco para terapia cardíaca regenerativa usando ensaios cometa e imunomarcação. Este método garante a qualidade celular antes do transplante.

Avaliar a integridade do DNA de células-tronco para terapia celular cardíaca

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