Name: Exame quantitativos de susceptibilidade antibiótica de Neisseria gonorrhoeae agregados usando ATP-utilização comercial ensaios e coloração Live/mortos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a medir a susceptibilidade antibiótica de Neisseria gonorrhoeae em agregados usando ensaios de ATP e coloração vivo/morto. Este método quantifica a sobrevivência bacteriana após tratamento com ceftriaxona.

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Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Instituto Nacional de saúde para a Premier e W.S. AI123340. L.-CW, J.W., ar-condicionado, e E.N. foram apoiados em parte/participação no programa de "O primeiro ano inovação & pesquisa experiência" financiado pela Universidade de Maryland. Os financiadores não tinham qualquer papel no estudo design, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Reconhecemos o UMD CBMG Imaging Core para todos os experimentos de microscopia.

1. manutenção de cepas de GC
<ol><li>Raia de cepas de N. gonorrhoeae em ágar GCK com 1% Kellogg suplementos18 (tabela 1, tabela 2) dos estoques de congelador e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 para 16-18 h. uso MS11 expressando Opa de fase variável (MS11Opa +), nenhuma Opa (MS11ΔOpa), ou um LOS truncado (MS11ΔLgtE).</li>
	<li>Escolha cuidadosamente pili negativo (colônia sem borda escura) ou positivo (colônia com borda escura) colónias de cada estirpe baseado na colônia morfologia19 usando um microscópio de luz dissecação e raia em uma nova placa GCK.</li>
	<li>Incube a 37 ° C com 5% de CO2 para 16-18 h antes do uso.</li>
</ol>2. quantificação de viabilidade de agregações de GC
<ol><li>Recolha o GC usando um aplicador estéril. Cotonete GC da placa e ressuspender GC em caldo previamente aquecido (GCP, tabela 3) suplementado com 4,2% NaHCO3 e 1% de soluções Kellogg18. Usar espectrofotometria a um comprimento de onda de 650 nm (uma OD650 de 1 = ~ 1 x 109 UFC/mL) para determinar a concentração de bactérias suspensas.</li>
	<li>Ajustar a concentração de GC para ~ 1 x 108 UFC/mL.</li>
	<li>Adicione 99 µ l de suspensão de GC ajustado em poços de uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Incubar a placa de 6 h a 37 ° C com 5% de CO2 para permitir que as bactérias para agregar.</li>
	<li>Adicione 1 µ l de serial ceftriaxona diluída (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0,2 µ g/mL) em cada poço. Embora alguns poços não tratados para servir como controles.</li>
	<li>Incube a placa por 24 h a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>Proceda à sonicação a suspensão 3 vezes em cada poço para 5 s em 144 W e 20 kHz.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de reagente de brilho disponível comercialmente ATP utilização em cada poço, pipetar acima- e abaixo por 3 vezes e incube por 15 min a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>Com cuidado transferir 150 µ l de mistura de cada poço em um novo poço em uma microplaca de 96 poços negro e evitar a introdução de bolhas.</li>
	<li>Medir a absorvância de cada poço em 560 nm, utilizando o leitor de placa.</li>
	<li>Calcule a taxa de sobrevivência pela relação da leitura obtida após o tratamento de ceftriaxona serial para a leitura de poços não tratados.</li>
</ol>3. a análise microscópica de Live/mortos dos agregados de GC fluorescência
<ol><li>Recolha o GC usando um aplicador estéril. Cotonete GC da placa e ressuspender GC na mídia GCP previamente aquecido além de 1% Kellogg suplementos.</li>
	<li>Determinar o número de bactérias por espectrofotometria a um comprimento de onda de 650 nm e ajustar a concentração de GC para ~ 1 x 107 UFC/mL.</li>
	<li>Adicione 198 µ l de suspensão de GC em câmaras de 8 poços lamela-inferior.</li>
	<li>Incube a câmara para 6 h a 37 ° C com 5% de CO2 para permitir a formação de agregação.</li>
	<li>Adicione 2 µ l de ceftriaxona (100 µ g/mL ou várias diluições) em cada poço dentro de cada condição de agregação. Incube a 37 ° C com 5% de CO2, o tempo desejado.</li>
	<li>Adicionar 0,6 µ l de mistura de solução coloração viva/morta em cada poço e incube por 20 min a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>Adquira imagens de Z-series, usando um microscópio confocal (um microscópio equivalente pode ser usado).</li>
	<li>Analise as imagens usando o software ImageJ para medição do tamanho de agregados de GC e a relação de intensidade de fluorescência (FIR) de viver-mortos coloração em cada agregado.</li>
</ol>4. análise de imagens
<ol><li>Estimativa do tamanho de agregados de bactérias.<ol>
<li>Abra o ImageJ e abra uma imagem arrastando um arquivo de imagem raw para a barra de menus do ImageJ.</li>
		<li>Clique em Linhas à mão livre na barra de menus do ImageJ e um círculo no local de cada agregação na imagem.</li>
		<li>Clique em analisar | Medida na barra de menus do ImageJ.</li>
		<li>Obter o número em uma nova janela na coluna de área .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificação da relação ao vivo-mortos de agregações<ol>
<li>Abra o ImageJ e abra uma imagem arrastando um arquivo de imagem raw para a barra de menus do ImageJ.</li>
		<li>Clique em analisar | Definir medidas na barra de menus do ImageJ.</li>
		<li>Verifique a densidade integrada na janela pop-up e clique Okey.</li>
		<li>Clique na imagem | Cor | Ferramenta de canais na barra de menu e selecione uma cor.</li>
		<li>Verifique o canal 1 como a fluorescência para coloração de bactérias vivas.</li>
		<li>Clique em Linhas à mão livre na barra de menus do ImageJ e um círculo no local de cada agregação.</li>
		<li>Clique em analisar | Medida na barra de menus do ImageJ.</li>
		<li>Obter o número na coluna IntDen .</li>
		<li>Verifique o canal 2 como a fluorescência para a mancha bacteriana morto. Repita as etapas 4.2.6-4.2.8.</li>
		<li>Obter a relação de viver-mortos, dividindo o número da etapa 4.2.8 pelo número da etapa 4.2.9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise estatística<ol>
<li>Abra o GraphPad Prism e digite os números obtidos do ImageJ para a coluna desejada.</li>
		<li>Clique em analisar e selecionar testes t sob análises de coluna.</li>
		<li>Verifique a coluna desejada para comparação e clique Okey.</li>
		<li>Obter o P-valor sob a janela de análise .</li>
		<li>Selecione a Regressão Linear , sob análises XY da etapa 4.3.3</li>
		<li>Obter o R-quadrado e o P-valor sob a janela de análise.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm">http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm</a> (2017).</li>
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<li>Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-related+infections%3A+bridging+the+gap+between+clinical+management+and+fundamental+aspects+of+recalcitrance+toward+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

As bactérias podem formar biofilmes durante a infecção do organismo humano. Teste de MIC tradicional pode não refletir a concentração necessária para erradicar as bactérias em um biofilme. Para testar os efeitos de agentes antimicrobianos em um biofilme, métodos baseados em biomassa de biofilme, bem como do chapeamento CFUs podem ser errôneos devido ao impacto da estrutura do biofilme. Por exemplo, o método de chapeamento só funciona se o biofilme pode ser interrompido. Daí, o UFC obtida pode ser menor que o número real ...

Gonorreia é que um comum sexualmente transmissíveis infecção (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), uma bactéria Gram-negativa de diplococcal, é o agente causador da doença. Sintomas de infecção genital podem resultar em dor durante a micção, dor genital generalizada e descarga uretral. Infecção é frequentemente assintomática2,3,4,5, e isto permite a colonização estendida. Estas infecções não tratadas são uma preocupação de saúde importantes, como eles têm o potencial para facilitar a transmissão do organismo e isto pode levar a complicações como doença inflamatória pélvica (DIP) e disseminado de Infecção gonocócica (DGI)6. Resistentes aos antibióticos gonorreia é uma crise de saúde pública e um crescente fardo socioeconômico7. Suscetibilidade reduzida às cefalosporinas, resultou em mudança de regime de tratamento de um único antibiótico a terapia dupla, que combina a azitromicina ou doxiciclina com ceftriaxone8. O maior fracasso de ceftriaxona e azitromicina9,10, em combinação com infecções assintomáticas, destaca a necessidade de compreender as falhas do tratamento de gonorreia.
O teste de concentração inibitória mínima (CIM), incluindo o ágar diluição e disco difusão testes, tem sido usado como o exame médico padrão para a identificação de resistência a um antibiótico. No entanto, não está claro se o MIC teste reflete a resistência antibiótica bacteriana in vivo. A formação de biofilmes bacterianos contribui para a sobrevivência de bactérias na presença de concentrações bactericidas de antibiótico: testando o MIC é incapaz de detectar este efeito11. Porque o GC pode formar biofilmes sobre superfícies mucosas12, nós hypothesize que antibiótico suscetibilidade dentro agregados seria diferente daquele visto no GC individual. Além disso, estudos têm mostrado que trifásico moléculas de superfície variável, Pili, associada a opacidade da proteína (Opa), e lipooligosaccharides (LOS), que regulam interações inter bactérias, conduzir a diferentes agregados tamanho13, 14 , 15. a contribuição destes componentes de resistência aos antibióticos não tem sido examinada devido à falta de métodos apropriados.
Atualmente, existem vários métodos para medir a erradicação do biofilme. O método quantitativo mais amplamente utilizado é medindo as mudanças na biomassa usando cristal violeta mancha16. No entanto, o método requer manipulação experimental significativa, que potencialmente pode gerar erros no experimento repetições17. O método de coloração ao vivo/morto usado aqui permite a visualização de bactérias vivas e mortas e sua distribuição dentro do biofilme. No entanto, a estrutura do biofilme pode posar como uma barreira física que reduz a penetração do corante. Portanto, para quantificar as bactérias ao vivo/morto dentro de um grupo, a coloração é limitada a pequenas biofilmes seu precursor-microcolonies ou agregações. Outros métodos, incluindo os testes de difusão diluição e disco de ágar, não são capazes de medir os efeitos de agregação. Para examinar a susceptibilidade de GC dentro de agregação após a exposição aos antibióticos, um método ideal seria preciso ter ambos um ensaio quantitativo que pode medir vivem bactérias e visualizar sua distribuição.
O procedimento descrito aqui combina uma medição de utilização de ATP e ao vivo/morto coloração do ensaio para quantitativamente e examinar visualmente a susceptibilidade de GC dentro agregados na presença de antibióticos.

<table><tbody><tr><td>100x suplemento</td><td></td><td></td><td></td>Kellogg's</tr><tr><td>Agar</td><td>United States Biological</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>BacTiter Assay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8232</td><td></td></tr><tr><td>Ceftriaxona</td><td>TCI</td><td>C2226</td><td></td></tr><tr><td>Difco GC base média&nbsp;</td><td>BD</td><td>228950</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato férrico, nonahidratado&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254223-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina Pó Cristalino</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>BacLight coloração viva/morta</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>MS11 Cepa</td><td></td><td></td> de Neisseria gonorrhoeae <td>gentilmente fornecida pelo Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Pesquisa</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Proteose Peptone&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-10</td><td></td></tr><tr><td>Amido solúvel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9765</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfato de tiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>8 poços câmara de fundo de lamínula&nbsp;</td>Placas <td>de</td> cultura de tecidos de 96 poços 155411 <td></td>da <td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Corning, Falcon</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de Biossegurança (NU-425-600 Classe II, Capuz de Risco Biológico de Fluxo Laminar A2)</td><td>Nuaire</td><td>32776</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; Microscópio confocal modelo 3530</td><td></td></tr><tr><td>equipado com câmara de imagem ao vivo</td><td>Leica</td><td>SP5X</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Microplaca de Poliestireno Preto de 96 Poços&nbsp;</td><td>Iluminador Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Glomax&nbsp;</td><td>Pontas de pipeta Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>(0.1-10 &micro; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-717-133</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (1000 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (200 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>53509-007</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Ultrospec 2000 UV</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>80-2106-00</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos estéreis de 15 ml</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga estéreis (1,7 ml)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores estéreis com ponta de poliéster</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Kontes</td><td>Equivalente a 9110001</td><td></td></tr></tbody></table>

exame quantitativos de susceptibilidade antibiótica de neisseria gonorrhoeae agregados usando atp-utilização comercial ensaios e coloração live/mortos

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

O surgimento de resistentes aos antibióticos Neisseria gonorrhoeae (GC) é uma ameaça para a saúde no mundo e destaca a necessidade de identificar as pessoas que não o tratamento. Esta bactéria Gram-negativa causa a gonorreia exclusivamente em seres humanos. Durante a infecção, é capaz de agregados de forma e/ou biofilmes. O teste de concentração inibitória mínima (CIM) é usado para determinar a susceptibilidade aos antibióticos e definir o tratamento adequado. No entanto, o mecanismo de erradicação em vivo e sua relação com os resultados de laboratório não são conhecidos. Foi desenvolvido um método que examina como GC agregação afeta a susceptibilidade aos antibióticos e mostra a relação entre tamanho de agregação e suscetibilidade aos antibióticos. Quando agregado de GC, são mais resistentes ao antibiótico matar, com bactérias no centro sobrevivendo ceftriaxona tratamento melhor do que aqueles na periferia. Os dados indicam que a agregação de N. gonorrhoeae pode reduzir sua susceptibilidade à Ceftriaxona, que não é reflectida usando os métodos MIC de baseados em placa de ágar padrão. O método utilizado neste estudo permitirá aos pesquisadores testar susceptibilidade bacteriana em condições clinicamente relevantes.

Foram utilizados dois métodos: um ensaio de utilização do ATP e um ensaio de coloração ao vivo/morto. Os resultados podem ser combinados ou usados individualmente pela análise de sobrevivência bacteriana dentro agregados após tratamento com antibióticos. O ensaio de utilização de ATP foi mostrado para medir com precisão viáveis bactérias S. aureus biofilmes20,21. Aqui, MS11Opa + Pil + estirpe foi usado para examinar o pap...

Um simples ensaio de medição da ATP e método de coloração ao vivo/morto foram usados para quantificar e Visualizar Neisseria gonorrhoeae sobrevivência após o tratamento com ceftriaxona. Este protocolo pode ser estendido para examinar os efeitos antimicrobianos de qualquer antibiótico e pode ser usado para definir a concentração inibitória mínima dos antibióticos em biofilmes bacterianos.

Exame quantitativos de susceptibilidade antibiótica de Neisseria gonorrhoeae agregados usando ATP-utilização comercial ensaios e coloração Live/mortos

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Esta técnica nos permite medir a suscetibilidade de antibióticos em condições mais clinicamente relevantes. A técnica também nos permite determinar a verdadeira concentração de antibióticos que podem matar bactérias em agregados. Esta técnica pode ser aplicada para determinar a concentração necessária para eliminar agregados de GC.O método também pode ser aplicado à medição da suscetibilidade antimicrobiana de qualquer bactéria capaz de formar agregados. Preste atenção às etapas de lise para garantir que a lise esteja completa. Caso contrário, o ensaio de medição ATP subestimará o número de bactérias viáveis.A visualização desse método permitirá que outros pesquisadores sigam e repliquem este experimento com consistência. Comece por estilhaços de Neisseria gonorrhoeae, ou cepas GC, em ágar GCK suplementado com 1%Kellogg para uma incubação de 16 a 18 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, use um microscópio leve para selecionar cuidadosamente colônias pili-negativas sem bordas escuras ou colônias pili-positivas com bordas escuras de cada placa, e coloque as colônias escolhidas em novas placas GCK para uma cultura de 16 a 18 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Na manhã seguinte, use um aplicador estéril para coletar colônias de GC de cada placa e resuspensar cada cotonete em caldo quente complementado com 4,2% de bicarbonato de sódio e 1% solução Kellogg. Meça a densidade óptica em 650 nanômetros, ou OD650, para determinar a concentração das bactérias suspensas e ajuste a concentração de GC para cerca de uma vez 10 para as oito unidades formadoras de colônias por mililitro. Em seguida, adicione 99 microliters da suspensão gc em poços individuais de uma placa de 96 poços e permita que as bactérias se agreguem a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por seis horas.No final da incubação, adicione um microliter de ceftriaxona diluída em série a cada poço deixando alguns poços não tratados para servir como controles e devolver a placa à incubadora por mais 24 horas. No dia seguinte, sonicar a suspensão em cada poço três vezes a 144 watts e 20 kilohertz por cinco segundos por sônica e adicionar 100 microliters de reagente de brilho de utilização ATP comercialmente disponível a cada poço. Transfira cuidadosamente 150 microliters de mistura de cada poço em poços individuais de uma nova microplaca preta de 96 poços e meça a absorção de cada poço a 560 nanômetros em um leitor de placas.Em seguida, calcule a taxa de sobrevivência pela razão da leitura obtida após o tratamento de antibióticos em série para a leitura dos poços não tratados. Para visualização dos agregados gc vivos/mortos, use um aplicador estéril para coletar GC das placas cultivadas durante a noite e resuspensar o GC em meio GCP pré-armado complementado com 1%Kellogg. Meça o OD650 por espectrofotometria e ajuste a concentração para aproximadamente uma vez 10 para as sete unidades formadoras de colônias por mililitro.Em seguida, adicione 198 microliters de suspensão GC em câmaras de oito poços e incuba as câmaras a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por seis horas. Ao final da incubação, trate as bactérias com dois microlitadores de ceftriaxona por condição de agregação e devolva as câmaras à incubadora para o período de incubação experimental adequado. Ao final da incubação, adicione 0,6 microliters de solução de coloração viva/morta em cada poço e devolva as câmaras à incubadora por mais 20 minutos.Em seguida, use um microscópio confocal para obter imagens da série Z. Para medir o tamanho dos agregados gc, abra a primeira imagem no ImageJ e selecione linhas à mão livre para circular a área de cada agregação na imagem. Clique em analisar e medir.O tamanho dos agregados será indicado sob a coluna da área. Para quantificar a razão de intensidade de fluorescência da coloração viva para a morta em cada agregado, clique em analisar e definir medições e verifique a densidade integrada na janela popup. Clique em OK e clique na ferramenta imagem, cor e canais.Selecione a cor e o canal um como a fluorescência para coloração de bactérias mortas. Selecione linhas à mão livre para circular a área de cada agregação e clique em analisar e medir para obter a razão de intensidade de fluorescência para cada agregado na coluna de densidade integrada. Selecione o canal dois para a fluorescência para a coloração bacteriana viva e meça a intensidade da fluorescência em cada agregado como apenas demonstrado.Em seguida, divida os dados de intensidade de fluorescência viva pelos dados de intensidade de fluorescência morta para obter a razão de intensidade de fluorescência viva para morta. Neste experimento representativo, pili não agregado positivo, acumulado pili positivo ou agregado e interrompido pili positivo bactérias foram tratados com diluições seriais de ceftriaxona antes da medição de seus níveis DE ATP. GC pré-agregado demonstrou uma sobrevida significativamente maior do que o GC não agregado ou de agregação interrompido gc quando tratado com concentrações iguais de ceftriaxona ou superior.Cepas pili-positivas que formam agregados maiores apresentaram os mais altos níveis de ATP após o tratamento ceftriaxona em comparação com as cepas mutantes. Independentemente da cepa testada, a coloração viva/morta antes do tratamento com antibióticos revelou bactérias mortas em grande parte localizadas nas camadas externas da cultura, enquanto a GC viva foi identificada principalmente dentro do núcleo de agregados tratados com ceftriaxona. Como esperado, as bactérias pili-positivas formaram os maiores agregados, enquanto as culturas pili-negativas formaram-se as menores.Notavelmente, os agregados pili-positivos ainda estavam vivos em suas camadas principais após o tratamento com antibióticos, enquanto gc nos pequenos agregados mutantes soltos estavam mortos. Com base no tamanho e sobrevivência do GC, um gráfico de correlação pode ser traçado para examinar a relação entre o tamanho da agregação e a sobrevivência de antibióticos das bactérias. A sonicação é importante para garantir que a ATP de cada bactéria individual seja liberada dentro dos agregados firmemente vinculados.Caso contrário, as medidas não serão consistentes. É importante emplacar as bactérias após o agresso e são tratadas com antibióticos para medir tanto as bactérias viáveis quanto as capazes de replicação. A técnica mede a influência da agregação de bactérias na suscetibilidade a antibióticos, permitindo que os pesquisadores desenvolvam melhores medicamentos para o tratamento de doenças.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Cayron, J., e Lesterlin, C. Análise Multiescala do Crescimento Bacteriano Sob Tratamentos de Estresse. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento para avaliar a filamentação de E. coli e a replicação do DNA sob tratamento antibiótico inibidor da divisão celular usando placas para medir a viabilidade e citometria de fluxo para analisar o tamanho da célula e o conteúdo de DNA.

Avaliação da filamentação induzida por antibióticos em E. coli usando ensaio de plaqueamento e citometria de fluxo

Fonte: Maurakis, S., e Cornelissen, C. N. Crescimento limitado por metais de Neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes responsivos a metais e aquisição de metais de ligantes hospedeiros. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o procedimento para detectar transportadores de metal de superfície em Neisseria gonorrhoeae cultivada sob condições limitadas por metal usando um ensaio de dot blot, envolvendo ligação de ligante, detecção de anticorpos e visualização colorimétrica.

Detecção dos transportadores de metais de superfície em Neisseria gonorrhoeae usando Dot Blot

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para estudar o impacto do tratamento antimicrobiano em agregados de Pseudomonas aeruginosa (Pa). As células Pa marcadas com fluorescência são cultivadas como agregados, imitando o padrão de crescimento durante a infecção. Ao desafiar os agregados com uma concentração subletal do antibiótico colistina, a avaliação em tempo real da interação bactéria-antibiótico é realizada por meio de microscopia de fluorescência.

Uma técnica in vitro para estudar tratamentos antimicrobianos em agregados bacterianos

Este vídeo descreve o ensaio simples de medição de ATP usando o reagente de brilho de luciferase. Este ensaio é usado para quantificar a sobrevida de Neisseria gonorrhoeae após o tratamento com ceftriaxona.

Um ensaio de utilização de ATP para determinar a sobrevivência bacteriana sob tratamento com antibióticos

Central ao campo da patogénese bacteriana é a capacidade de definir se e como os micróbios sobrevivem após exposição a células eucarióticas. Este artigo descreve protocolos para a utilização de corantes fluorescentes que revelam a viabilidade das bactérias individuais dentro e associados com as células hospedeiras.

Fluorescência métodos de microscopia para determinar a viabilidade de bactérias em associação com células de mamíferos

Aqui, apresentamos protocolos para rastrear e caracterizar rapidamente enzimas quanto à atividade antimicrobiana. O ensaio de difusão em microlâminas e o ensaio de liberação de corante utilizam substratos bacterianos alvo para avaliação qualitativa e quantitativa da atividade enzimática.

Qualitativos e quantitativos Os ensaios para a detecção e caracterização de antimicrobianos Proteína

O protocolo apresenta o Escherichia coli-baseado pressão seletiva incorporação de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) a lactococcal peptídeo antimicrobiano nisina. Suas propriedades podem ser alteradas durante a expressão recombinantes através de substituição com ncAAs desejado em meios de crescimento definido. As alterações resultantes na Bioatividade são mapeadas por ensaios de inibição de crescimento e de microscopia de fluorescência.

Peptídeos antimicrobianos produzidos pela incorporação de pressão seletiva de aminoácidos não-canônicos

Antibióticos fluorescentes são ferramentas poderosas que podem ser usadas para estudar múltiplos aspectos da resistência antimicrobiana. Este artigo descreve a preparação de antibióticos fluorescentes e sua aplicação para estudar a resistência a antibióticos em bactérias. As sondas podem ser usadas para estudar mecanismos de resistência bacteriana (por exemplo, efflux) por espectrofotometria, citometria de fluxo e microscopia.

Visualização da resistência bacteriana usando sondas de antibióticos fluorescentes

O meio de escarro de fibrose cística sintética (SCFM2) pode ser utilizado em combinação com microscopia de varredura a laser confocal e classificação celular ativada por fluorescência para observar agregados bacterianos em alta resolução. Este artigo detalha métodos para avaliar populações agregadas durante o tratamento antimicrobiano como uma plataforma para estudos futuros.

Ferramentas para a avaliação em tempo real de um modelo de infecção por pseudomonas aeruginosa

A resistência a antibióticos entre cepas invasivas de Escherichia coli em aderentes apresenta desafios para avaliar a invasão bacteriana usando o tradicional ensaio de proteção com gentamicina. Um método aprimorado para avaliar a invasão bacteriana quantitativamente, enumerando unidades formadoras de colônias e qualitativamente por meio da visualização das células infectadas por microscopia confocal de imunofluorescência, é descrito.

Ensaio de Proteção Amikacina para Quantificação e Visualização da Invasão de Células de Escherichia coli

Aprenda a medir a susceptibilidade antibiótica de Neisseria gonorrhoeae em agregados usando ensaios de ATP e coloração vivo/morto. Este método quantifica a sobrevivência bacteriana após tratamento com ceftriaxona.

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