Engenharia genética de células de Dictyostelium discoideum com base na seleção e crescimento de bactérias
25 de janeiro de 2019
Dictyostelium discoideum é um organismo modelo popular para o estudo de complexos processos celulares como migração celular, endocitose e desenvolvimento. O utilitário do organismo está dependente da viabilidade de manipulação genética. Aqui, apresentamos métodos para transfect células de Dictyostelium discoideum que superar limitações existentes de cultivo de células em meio líquido.
O valor deste protocolo é que permite que quase qualquer cepa de dictyostelium discoideum seja manipulada pela genética molecular, independentemente de essa cepa crescer axenicamente em meio líquido ou não. A outra vantagem dessa técnica é que ela é rápida e simples. Transponha para transfectar células com um plasmídeo exocromosomal antes de começar a misturar dictyosteliums.
Os resultados já podem ser validados dois dias após a transfecção usando microscopia. É incomum trabalhar com células de dictyostelium e suspensão de bactérias. A visualização ajudará a dar aos experimentadores uma ideia de como as diferentes etapas dos protocolos são realizadas.
Demonstrando o procedimento comigo será Soudabeh Imanikia, um pós-doutor do meu laboratório. Para começar, prepare 1000 mililitros de solução de trabalho tampão sorensen com cloreto de magnésio e cloreto de cálcio de acordo com o protocolo de texto. Depois disso, use uma única colônia de k aerogenes para inocular um litro de meio LB.
Permita que as bactérias cresçam durante a noite a 37 graus celsius com tremor. Gire as células em dois tubos de centrífuga de 500 mililitros para colher as células. Em seguida, lave as bactérias uma vez com 500 mililitros de tampão.
Resuspende a pelota em 20 mililitros de tampão. Use um fotômetro para verificar a densidade óptica da amostra e diluir a amostra com buffer até que a densidade óptica seja de cerca de 100. Depois disso, prepare o tampão de eletroporação H40 de acordo com o protocolo de texto.
Cresça aerogenes K para confluência de um meio SM durante a noite à temperatura ambiente. Adicione 400 microliters de suspensão bacteriana a uma placa de ágar SM e espalhe-a uniformemente. Em seguida, pegue um laço estéril e inocula-o com células de dictyostelium e espalhe as células em uma borda da placa.
Incubar a placa a 22 graus Celsius por dois dias, para garantir que as zonas de crescimento sejam grandes o suficiente para transfecção. Adicione 10 mililitros de suspensão de aerogene K a uma placa de Petri tratada com cultura de tecido de 10 centímetros. Em seguida, use um laço de inoculação descartável de 10 microliter para raspar as células das zonas de crescimento da placa de cultura.
Transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro, contendo tampão H40 gelado. Gire as células por dois segundos a 10.000 vezes a gravidade. Em seguida, descarte o supernasciente e resuspenque as células no buffer H40.
Em seguida, adicione 100 microliters das células a um tubo contendo um a dois microgramas de DNA. Pipeta para cima e para baixo para misturar e transferir a mistura de DNA celular para um cuvette de eletroporação pré-refrigerado. Não adicione mais de dois microgramas de DNA.
Maior concentração de DNA são tóxicas para as células e reduzem a eficiência. Após a eletroporação, transfira imediatamente as células para uma placa de Petri preparada de 10 centímetros e permita que as células se recuperem por cinco horas. Para selecionar um transfetante para um knock-out, knock-in, ou um ato cinco knock-in, desprender as células da placa de Petri por pipetizar líquido sobre a superfície.
Em seguida, configure três diluições do agente seletivo de acordo com o protocolo de texto. Finalmente, distribua 150 microliters das diluições preparadas em cada poço de 96 placas de cultura de tecido de fundo plano. Neste protocolo, foi demonstrado um sistema plasmídeo extracromosomal de repórter duplo.
32 horas após a transfecção, a maioria das células expressou ambas as proteínas de fusão rotuladas fluorescentes. Um ato de cinco M cherry knock-in e um NC4 também foi tentado. Duas bandas foram obtidas depois de executar o digestão em um gel de agarose.
A banda de par de base 4127 contém a construção desejada. O DNA purificado foi usado para a transfecção de células NC4. Dois clones da transfecção NC4 foram analisados via PCR e ambos mostraram os padrões de banda previstos.
A mancha sulista foi então usada para validar os resultados da PCR. O NC4 cresceu mais rápido em gramados bacterianos do que as células Ax2. Depois de quatro horas, mais células NC4 foram capazes de rastejar sob a agarose do que as células Ax2.
As células NC4 eram mais rápidas e apresentavam resposta quimotactica mais forte ao folato do que as células Ax2. Use sempre células de placas SM recém-configuradas. Nunca use células com mais de quatro dias, caso contrário a eficiência cairá.
Cepas de HAP brancas recém-isoladas, não atenuantes, são comumente usadas para abordar questões relativas a um comportamento ruching ou social de dictyosteliums. Nossa permite aplicar genética molecular através desses isolados.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para transfectar células de Dictyostelium discoideum, permitindo a manipulação genética independentemente das condições de crescimento da linhagem. O método é eficiente e simples, possibilitando a rápida validação de resultados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Manipulação genética
- Organismos modelo
Antecedentes
- Dictyostelium discoideum é um organismo modelo amplamente utilizado para o estudo de processos celulares.
- A manipulação genética é fundamental para explorar diversas questões biológicas.
- Os métodos existentes apresentam limitações com base nas condições de crescimento de diferentes linhagens.
- Este protocolo tem como objetivo superar essas limitações.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para transfectar diversas linhagens de Dictyostelium discoideum.
- Facilitar aplicações em genética molecular em linhagens que não crescem axenicamente.
- Demonstrar a eficiência do processo de transfeção.
Métodos Utilizados
- Preparação de soluções bacterianas e tampão para transfeção.
- Eletrroporação de células de Dictyostelium discoideum com DNA plasmidial.
- Validação dos resultados de transfeção utilizando microscopia e PCR.
- Avaliação do comportamento e crescimento celular em resposta à transfeção.
Resultados Principais
- Transfecção bem-sucedida de múltiplas linhagens de Dictyostelium discoideum.
- Expressão de proteínas fluorescentes observada 32 horas após a transfeção.
- Células NC4 demonstraram crescimento mais rápido e resposta quimiotática comparadas às células Ax2.
- Validação das modificações genéticas por meio de PCR e análise de Southern blot.
Conclusões
- O protocolo permite a manipulação genética eficaz de cepas de Dictyostelium discoideum.
- Ele fornece uma estrutura para estudos futuros sobre comportamento celular e genética.
- Cepas recém-isoladas apresentam os melhores resultados em termos de eficiência de transfeção.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a manipulação genética de linhagens selvagens de Dictyostelium que crescem em bactérias, superando as limitações das linhagens adaptadas a meios axênicos com sinalização Ras perturbada. Ele fornece um método escalonável e rápido para validação de alvos em um sistema modelo relevante para doenças, apoiando a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. A abordagem estende a genética molecular a linhagens isoladas do ambiente, aumentando a continuidade translacional e a confiança preditiva nos fluxos de trabalho de triagem fenotípica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em vias de sinalização e motilidade não alteradas, utilizando cepas não axênicas com sinalização Ras intacta.
- Valor Operacional: Reduz complicações experimentais decorrentes de defeitos na macropinocitose e alterações na migração observadas em cepas axênicas.
- Valor Preditivo: Apoia a validação funcional de alvos e a redução de riscos biológicos, permitindo a mutagênese em condições fisiologicamente relevantes de crescimento.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera células recombinantes expressando repórteres fluorescentes duplos em até 32 horas, permitindo leituras rápidas de ensaios para triagem de compostos.
- Valor Operacional: Padroniza o fluxo de trabalho de transfeção utilizando gramados bacterianos e eletroporação, melhorando a reprodutibilidade entre laboratórios.
- Escalabilidade: Acelera o cronograma de transfeção a clones validados em dias, em vez de semanas, apoiando a engenharia de cepas em alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita o estudo da quimiotaxia e do comportamento social em cepas selvagens recém-isoladas, melhorando a relevância do modelo de doença.
- Valor Operacional: Permite a aplicação direta de genética molecular a isolados ambientais sem necessidade de adaptação axênica prévia.
- Continuidade Translacional: Conecta a validação de alvos na fase de descoberta a fenótipos pré-clínicos por meio de parâmetros mensuráveis, como quimiotaxia induzida por folato e ensaios de penetração em agarose.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere nas fases iniciais de descoberta até a identificação de compostos líderes, fornecendo modelos geneticamente manipuláveis para interrogatório de vias e triagem fenotípica.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses em quimiotaxia, macropinocitose e sinalização de desenvolvimento utilizando cepas selvagens intactas.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas de fluorescência e crescimento em gramados bacterianos para avaliação confiável de compostos.
- Análises: Permite a validação baseada em PCR, Southern blot e microscopia de modificações genéticas em 32–48 horas após a transfeção.
- Pesquisa Translacional: Conecta a manipulação genética a ensaios funcionais como quimiotaxia e crescimento sob agarose, orientando o avanço com ajuste de risco.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para engenharia de qualquer cepa de Dictyostelium, independentemente da fonte de isolamento ou condição de crescimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao eliminar artefatos decorrentes da adaptação axênica e restaurar vias de sinalização nativas.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de preparações padronizadas de tampão, parâmetros de eletroporação e protocolos de seleção.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao reduzir os prazos de engenharia de linhagens e permitir decisões rápidas de prosseguir ou interromper na validação de alvos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao gerar modelos com risco mecanicista reduzido e modificações genéticas validadas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microbiologia para o preparo de culturas bacterianas e manipulação de Dictyostelium em gramados bacterianos.
- Depende do acesso a equipamentos de eletroporação e infraestrutura estéril de cultura de tecidos para as etapas de transfeção e recuperação.
- Necessita padronização da densidade do inóculo bacteriano (OD ~100) e do preparo do tampão H40 entre diferentes usuários.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o protocolo a diferentes isolados selvagens ou cepas ambientais.
- Limitado a cepas capazes de crescer em gramados bacterianos; a eficiência diminui com células com mais de quatro dias após o isolamento.
