Aplicações de mapeamento de espaço-temporal e técnicas de análise de partículas para quantificar intracelular Ca2 + sinalização em Situ
7 de janeiro de 2019
Ca2 + indicadores geneticamente codificados (GECIs) mudaram radicalmente como in situ Ca2 + imagem é executada. Para maximizar a recuperação de dados de tais gravações, a análise adequada dos sinais de Ca2 + é necessária. Os protocolos neste papel facilitam a quantificação de Ca2 + sinais gravados em situ usando spatiotemporal mapeamento e análise baseada em partículas.
A capacidade de adquirir grandes quantidades de dados de experimentos de imagem de cálcio melhorou drasticamente, especialmente com experimentos de imagem tecidual. Nossos protocolos descrevem técnicas de análise apropriadas para quantificar e descrever esses conjuntos de dados. Nossos protocolos geram uma gama de valores espaciais, temporais e de intensidade que são intrínsecos à sinalização de cálcio em tecidos inteiros e isso pode ser perdido em análises mais rudimentares.
Uma hora antes da transferência de imagem, um intestino delgado colhido de um rato com células intersticiais de Cajal ou ICC que expressam especificamente um indicador de cálcio geneticamente codificado para o estágio de um microscópio confocal de disco giratório. E perfundir continuamente o tecido com 37 graus Celsius Biocarbonato Krebs-Ringer ou solução KRB. Usando uma ampliação de 60 a 100 X localize o plexo mienterico em forma de stellate ICC ou ICC-MY entre as camadas musculares suaves circulares e longitudinais do intestino delgado.
Em seguida, localize o plexo muscular profundo em forma de fuso ICC ou ICC-DMP em um único plano entre a camada muscular suave circular e o plexo submucosal e salve os filmes como uma pilha de imagens TIFF. Para criar mapas espátulais ou STMs da atividade de cálcio ICC-DMP abra a pilha de imagens no ImageJ e clique em Imagem, Tipo e 32 bits para modificar a qualidade da imagem. Para criar uma varredura de linha clique com o botão direito do mouse na ferramenta de seleção de linhas e selecione linha segmentada.
Usando cliques únicos à esquerda, desenhe uma linha ao longo do acesso médio de um ICC-DMP individual, clicando duas vezes quando toda a célula foi delineada. Selecione Imagem, Pilhas e Reslice. Uma janela pop-up aparecerá.
Selecione Girar 90 graus para orientar a varredura de linha da esquerda para a direita para que possa ser calibrada e ler contra o tempo no eixo x com espaço no eixo y e clique em OK. O mapa espacial aparecerá. Para medir com precisão a amplitude dos sinais de cálcio do mapa, selecione a seleção retangular e desenhe uma região de interesse ao redor da área dentro do STM que exibe a área mais uniforme e menos intensa de fluorescência. Clique em Analisar e Histograma para obter um valor médio da intensidade dentro da região de interesse selecionada e clique em Editar, Selecionar Tudo para selecionar todo o STM.
Em seguida, clique em Process, Math e Divide e digite o valor médio da intensidade com a região stm selecionada de interesse na caixa pop-up. O STM vai ficar preto. Corrija isso clicando em Imagem, Ajuste, Brilho/Contraste e Auto na janela pop-up.
A varredura da linha será agora calibrada para a amplitude com a intensidade da fluorescência expressa como a fluorescência dividida pela fluorescência zero. O STM exibirá o número de quadros na pilha TIFF no eixo x e o número de pixels que representam o comprimento da célula no eixo y. Para quantificar os dados temporais e espaciais dos sinais de cálcio clique em Imagem e Propriedades e insira os valores apropriados para calibrar totalmente o STM para espaço e tempo na janela pop-up.
Para analisar os eventos individuais de cálcio clique em Linha Reta e clique e arraste no STM para desenhar uma linha horizontal reta através do centro de um evento de cálcio paralelo ao eixo x. Em seguida, clique em Analisar e Traçar perfil. Uma caixa aparecerá mostrando o perfil da trama do evento de cálcio.
Para análise baseada em partículas dos dados de sinalização de cálcio ICC-MY, abra o arquivo de filme em Volumetry e clique com o botão direito do mouse para selecionar O Filtro STK, Diferencie. Clique com o botão direito do mouse novamente para inserir um valor para diferenciar. Pressione Enter e clique à esquerda para iniciar a diferenciação.
Para criar partículas, use o botão do mouse do meio para percorrer o filme para selecionar uma seção de 20 a 40 quadros que inclui um período quiescente, seguido pela ocorrência de um cluster transitório de cálcio e 20 a 40 quadros que seguem logo após o cluster. Quando todos os quadros tiverem sido selecionados com o botão direito do mouse na janela do filme para acessar informações de partículas STK OPS Ramp DS e clique para executar uma rotina de análise de partículas que aumenta progressivamente o limiar do máximo para a intensidade mínima. Para garantir uma análise bem sucedida de partículas, certifique-se de incorporar o máximo de não-atividade de cluster transitório pré-cálcio e o máximo de não-atividade de cluster transitório pós-cálcio que puder.
Isso ajudará a aumentar a relação sinal-ruído. A análise será exibida graficamente na janela da parcela como enredo de ruído e na janela de traços como três traços de cor com o traço verde representando o número de partículas, o traço vermelho representando o tamanho médio da partícula, e o traço azul representando o limiar de intensidade absoluta. Para equilibrar o gráfico de ruído de partículas pressione H no teclado.
Em seguida, pressione a tecla de suporte direito para percorrer esquemas de cores até que o fundo esteja branco com os traços de cor na parte superior. Pressione F no teclado uma vez para trazer uma ferramenta de medição. Em seguida, pressione F uma segunda vez para marcar uma única linha vertical na barra de rolagem da janela de traços na trama no cruzamento onde as parcelas coloridas começam a mudar para o lado direito.
Dentro da janela de traços use o botão do mouse do meio para rolar do ponto de inflexão do traço vermelho para a linha vertical branca marcada. Depois de notar a média Y exibida, clique novamente no botão do mouse do meio dentro da janela de traços para desmarcar o traço azul. Na janela do filme clique em C para trazer uma roda colorida e D para ajustar o limiar.
Partículas válidas serão agora mostradas em vermelho, e aquelas que saturam serão brancas. Use o botão do mouse esquerdo para rolar até que as áreas brancas sejam removidas e use o botão do mouse médio para ajustar o valor numérico amarelo na roda de cor ao valor médio de Y para atribuir tudo em vermelho como uma partícula transitória de cálcio ativa no ponto de limiar determinado. Para salvar os dados como um arquivo de partículas baseado em coordenadas clique com o botão direito do mouse para acessar o STK 3D, salve a partícula zero e clique à esquerda para salvar o arquivo.
Para criar mapas de calor de atividade de partículas abra o arquivo de partículas salvo e clique com o botão direito do mouse na janela do filme para acessar STKops de partículas, StatMap Flag e digitar atribuições de bandeira para analisar. Clique para aplicar a análise e um mapa de calor mostrando as partículas totais para todo o comprimento da gravação com cores diferentes representando a porcentagem de ocorrência ao longo do registro. Clique com o botão direito do mouse para salvar o mapa de calor como um arquivo TIFF.
Em seguida, clique com o botão direito do mouse na janela do filme para acessar a medida de partículas, as estatísticas de partículas STK são iguais e digite uma atribuição de bandeira para a análise. Uma série de vestígios serão gerados na janela de rastreamento. A análise stm fornece a capacidade de monitorar e registrar as características espaciais da sinalização de cálcio, como a propagação espacial e a velocidade de propagação.
Essas informações podem ser acumuladas para fornecer uma visão bastante completa dos comportamentos de sinalização de cálcio dentro das células em seus ambientes nativos. Por meio da análise de partículas, informações quantitativas sobre a sinalização de cálcio podem ser calculadas medindo a área de partículas e a contagem de partículas, que juntas podem ser usadas para determinar as faixas espaciais de ativação de sinal de cálcio dentro de um campo de visão especificado. A análise de partículas também permite a quantificação aprofundada da sinalização subcelular de cálcio através do exame do local e das probabilidades de disparo de locais de disparo de cálcio.
Ao alocar as partículas em diferentes bandeiras com base em suas características temporais, as partículas iniciantes podem ser mapeadas com precisão. E uma riqueza de dados concretos adquiridos sobre o número de locais de iniciação, o tamanho do site em pixels e micrômetros, a probabilidade de cada local de iniciação disparar uma ou várias vezes durante cada aglomerado transitório de cálcio, e a porcentagem de locais de disparo que disparam durante cada ciclo de cluster transitório de cálcio podem ser obtidos. Consistência é a chave para o sucesso neste protocolo.
Todos os conjuntos de dados e todos os filmes devem ser tratados exatamente da mesma forma para garantir resultados confiáveis e repetíveis. Isso é especialmente verdade quando se lida com arquivos de partículas. Nossos protocolos permitem uma caracterização profunda da sinalização de cálcio in situ, e uma série de métodos estatísticos, quando usados adequadamente, podem avaliar diferenças entre uma gama de parâmetros espaciais e temporais.
Essas técnicas de análise em nosso protocolo permitiram que os pesquisadores fizessem e respondessem perguntas antes não abordadas relacionadas ao ritmo intestinal e à inervação intestinal, bem como ao controle neuronal do trato urinário inferior.
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Visão Geral
Este estudo foca-se na melhoria da análise de dados de imagem de cálcio em experimentos com tecidos, especificamente utilizando indicadores genéticamente codificados de Ca2+ (GECIs). Ele fornece protocolos detalhados que facilitam a quantificação de sinais de cálcio por meio de técnicas analíticas avançadas.
Principais Componentes do Estudo
Área de Pesquisa
- Imagem de cálcio
- Quantificação do sinal
- Análise de tecido
Antecedentes
- Aquisição aprimorada de dados a partir de experimentos de imagem de cálcio
- Importância de técnicas de análise precisas na captura da sinalização de cálcio
- Uso de indicadores geneticamente codificados para imagem in situ
Métodos Utilizados
- Mapeamento espaço-temporal
- Análise baseada em partículas
- Técnicas de microscopia (microscópio confocal)
Resultados Principais
- Os protocolos geram dados espaciais, temporais e de intensidade essenciais para compreender a sinalização de cálcio
- Maior precisão na medição de eventos de cálcio e suas propriedades
- Estabelecimento de uma estrutura para análise de agrupamentos de transientes de cálcio em amostras de tecido
Conclusões
- O estudo demonstra métodos avançados para quantificar sinais de cálcio em tecidos
- Destaca a importância de abordagens analíticas aprimoradas para obter melhores insights biológicos na sinalização de cálcio
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação precisa da sinalização de Ca2+ intracelular em ambientes teciduais nativos é fundamental para reduzir os riscos na validação de alvos em descoberta de fármacos gastrointestinais e neuromusculares. O mapeamento espaço-temporal e a análise baseada em partículas permitem extrair parâmetros espaciais, temporais e de intensidade de dados de imagem de Ca2+ de alta resolução, reduzindo a dependência de medidas simplistas de ROI que ignoram a complexidade da sinalização. Esta abordagem fornece compreensão mecanicista da atividade de marcapasso e das vias de controle neuronal, contribuindo para maior confiança preditiva nos estágios iniciais da descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de padrões de sinalização de Ca2+, como frequência, duração, velocidade de propagação e amplitude em tecidos intactos.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio da caracterização detalhada da atividade das células intersticiais de Cajal (ICC), um regulador-chave da motilidade gastrointestinal.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao associar a dinâmica da sinalização de Ca2+ ao marcapasso intestinal e ao controle neuronal do trato urinário inferior.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho subsequentes, gerando saídas quantitativas a partir de agrupamentos de transientes de Ca2+ in situ.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio de mapas espaciotemporais calibrados (STMs) e análise baseada em partículas, com protocolos definidos de limiarização e atribuição de marcadores.
- Escalabilidade: Permite prontidão para triagem por meio de arquivos de partículas baseados em coordenadas e mapas de calor, que possibilitam o processamento de grandes volumes de dados e a comparação entre experimentos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a análise da sinalização de Ca2+ na fase de descoberta em CCI intestinais à validação pré-clínica de distúrbios da motilidade e disfunções do trato urinário.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a quantificação detalhada da sinalização subcelular de Ca2+ por meio da análise da localização dos sítios de início, probabilidade de disparo e dinâmica dos aglomerados.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de avançar ou interromper projetos ao fornecer dados concretos sobre o número de sítios de início, tamanho dos sítios em pixels/micrômetros e porcentagem de sítios ativos por ciclo de aglomerado transitório.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a Descoberta Inicial até a Identificação de Fármacos e trabalhos Pré-clínicos, fornecendo dados quantitativos de sinalização de Ca2+ que orientam a validação de alvos e a preparação de ensaios.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao capturar a propagação espacial e a velocidade de propagação de sinais de Ca2+ por meio da análise de STM.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio da quantificação reprodutível da área e contagem de partículas, permitindo a determinação da amplitude espacial da ativação do sinal de Ca2+ em um campo de visão definido.
- Análises: Gera resultados estatísticos sobre as características temporais das partículas, permitindo sua classificação em categorias para mapear partículas iniciadoras e avaliar probabilidades de disparo.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao permitir a análise de padrões de sinalização de Ca2+ associados às vias de marcação intestinal e controle neuronal.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para analisar a sinalização de Ca2+ em diferentes sistemas modelo por meio de protocolos padronizados para calibração de STM, análise de partículas e geração de mapas de calor.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da redução da ambiguidade mecanicista nas dinâmicas de sinalização de Ca2+.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade alcançadas por meio de STM calibrados, análise baseada em partículas com ajuste de limiar e saída de dados baseada em coordenadas.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre prosseguir ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados, permitindo a detecção precoce de padrões de sinalização inconsistentes ou não reprodutíveis.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, apoiadas por dados quantitativos sobre densidade, tamanho e confiabilidade dos sítios de iniciação.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária em microscopia confocal, ImageJ e volumetria para a geração de STM e análise de partículas.
- Os requisitos de instrumentação e infraestrutura analítica incluem microscópio confocal de disco giratório, manipulação de pilhas de imagens em formato TIFF e software para recorte longitudinal, balanceamento de histograma e ajuste de limiar.
- Os requisitos de padronização entre equipes envolvem o tratamento consistente de todos os conjuntos de dados e vídeos para garantir resultados confiáveis e repetíveis, especialmente na geração de arquivos de partículas e na análise baseada em marcadores.
- As considerações de adaptação entre diferentes sistemas modelo incluem o ajuste da orientação do recorte longitudinal, seleção de quadros para períodos quiescentes e ativos e calibração do limiar com base em perfis de intensidade de fluorescência.
- As limitações práticas incluem a necessidade de seleção cuidadosa de seções de 20–40 quadros que abranjam períodos quiescentes, aglomerados de transientes de Ca2+ e atividade pós-aglomerado, para assegurar uma análise de partículas bem-sucedida e uma relação sinal-ruído ideal.
