Name: Imobilização de indivíduos ao vivo Caenorhabditis elegans , usando um Chip de Microfluidic polidimetilsiloxano ultrafino com retenção de água (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Aprenda a imobilizar Caenorhabditis elegans vivos usando chips microfluídicos ultrafinos de polidimetilsiloxano com retenção de água. Este método permite irradiação microfeixe direcionada e observação comportamental de longo prazo.

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Os autores agradecer Dr. Atsushi Higashitani Conselho em relação ao tratamento de c. elegans e DRS Yuya Hattori, Yuichiro Yokota e Yasuhiko Kobayashi para discussões valiosas. Os autores agradecer o centro de genética Caenorhabditis pelo fornecimento de cepas de c. elegans e e. coli. Agradecemos a tripulação do ciclotron de TIARA no QST-Takasaki por sua gentil assistência com os experimentos de irradiação. Agradecemos o Dr. Susan Furness para edição de um projecto deste manuscrito. Este estudo foi suportado em parte pela KAKENHI (Grant números JP15K11921 e JP18K18839) de JSPS para M.S.

<ol><li>Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy-Ion+microbeams-development+and+applications+in+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Plasma+Science%22%5BJournal%5D)">Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies.</a> IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).</li>
<li>Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+biological+effects+of+ion+beams+on+lethality%2C+molecular+nature+of+mutation%2C+mutation+rate%2C+and+spectrum+of+mutation+phenotype+for+mutation+breeding+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants.</a> Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).</li>
<li>Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbeam+evolution%3A+from+single+cell+irradiation+to+pre-clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies.</a> International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).</li>
<li>Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+irradiation+system+with+heavy-ion+microbeam+for+active+individuals+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).</li>
<li>Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy-ion+microbeam+system+at+JAEA-Takasaki+for+microbeam+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology.</a> Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).</li>
<li>Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+and+apoptosis+in+Caenorhabditis+elegans+germline+cells+following+heavy-ion+microbeam+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation.</a> International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).</li>
<li>Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+irradiation+method+for+the+first+instar+silkworm+larvae+using+locally+targeted+heavy-ion+microbeam%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam.</a> Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).</li>
<li>Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscopal+activation+of+microglia+in+embryonic+fish+brain+following+targeted+irradiation+with+heavy-ion+microbeam%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).</li>
<li>Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ultra-thin+chips+for+immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+in+microfluidic+channels+during+irradiation+and+selection+of+buffer+solution+to+prevent+dehydration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus%5BTitle%5D)+AND+%22Worm%22%5BJournal%5D)">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1 (1), 12-14 (2012).</li>
<li>Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+chemotaxis+revealed+by+paired+presentation+of+a+chemoattractant+and+starvation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).</li>
<li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+locomotory+rate+is+modulated+by+the+environment+through+a+dopaminergic+pathway+and+by+experience+through+a+serotonergic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li>
<li>Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+calcium+leakage+causes+mitochondrial+damage+in+Caenorhabditis+elegans+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles.</a> Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).</li>
<li>Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. 2, 1-13 (2006).</li>
<li>Aubry, G., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+optical+developments+in+microfluidic+platforms+for+Caenorhabditis+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research.</a> Biomicrofluidics. 8, 011301(2014).</li>
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<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).</li>
<li>Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+dirt%3A+Microfluidic+substrates+for+nematode+neurobiology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior.</a> Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).</li>
<li>Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+microfluidics+device+for+mechanical+stimulation+and+high+resolution+imaging+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56530(2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Imobilização no chip de c. elegans sob condições ao vivo usando um pó molhável PDMS microfluidic chip permite a irradiação de eficiente microbeam alvo de vários animais. A facilidade de manipulação e recursos para evitar a secagem fazer este sistema apropriado para aplicações não só na irradiação microbeam, mas também em vários ensaios comportamentais. Estas folhas de verme já tem sido comercializadas e podem ser facilmente obtidas. Fichas de microfluidic convencionais, tais como fichas olfativas, são associadas...

Radiação, incluindo raios x, raios gama e o feixe de iões pesados, é amplamente utilizada para aplicações biológicas, tais como no tratamento e diagnóstico de câncer e para a reprodução de feixes de iões. Numerosos estudos e desenvolvimentos técnicos atualmente estão focando os efeitos da radiação1,2,3. Microbeam irradiação é um poderoso meio de identificar sites radiosensitive em vida organismos4. Takasaki avançado radiação pesquisa Instituto de institutos nacionais de Quantum e radiológica de ciência e tecnologia (QST-Takasaki) tem vindo a desenvolver uma tecnologia para a irradiação de células individuais, sob observação microscópica usando pesado-íon microbeams5e estabeleceu-se métodos para habilitar o alvo microbeam irradiação de vários animais de modelo, como o nematódeo Caenorhabditis elegans,4,6, bichos da seda7e Oryzias latipes (medaka japonês)8. Microbeam alvo irradiação do nemátodo c. elegans permite o nocaute eficaz de regiões específicas, tais como o anel de nervo na região da cabeça, ajudando assim a identificar as funções destes sistemas em processos como a locomoção.
Um método para a em-microplaqueta imobilização de indivíduos de c. elegans , sem necessidade de anestesia foi desenvolvido para permitir a irradiação de microbeam4. Além disso, para melhorar microfluidic fichas utilizadas no estudo anterior4, recentemente desenvolvemos fichas de microfluidic molháveis, íon-penetrável, polidimetilsiloxano (PDMS), conhecidas como worm folhas (ver Tabela de materiais), para imobilização de indivíduos de c. elegans 9. Estes são compostos por folhas macias ultra-fino (espessura = 300 µm; Largura = 15 mm; comprimento = 15 mm) com múltiplos canais de microfluidic reta (20 ou 25) (profundidade = 70 µm; Largura = 60 µm ou 50 µm; comprimento = 8 mm) na superfície (Figura 1A-D). Os canais microfluídicos são abertos e permitem que vários animais ser incluído entre eles simultaneamente (Figura 1E). As folhas são flexíveis para permitir que os canais microfluídicos ser expandido (por ~ 10%, Figura 1,F), e a elasticidade permite que os animais ser envolto suavemente. Também, devido a capacidade de adsorção independente do PDMS, animais podem ser selados nos canais, cobrindo a superfície da folha com um filme de capa fina, em que os animais não são empurrados para os canais para o compartimento de verme. Girando a tampa filme sobre, você pode facilmente acumular os animais.
Os canais não machuque os vermes quando eles estão sendo fechados ou quando eles são coletados. Além disso, as folhas são feitas de PDMS, que é essencialmente hidrofóbicas, mas retenção de água pode ser conseguida transmitir Hidrofilia ao material. A retenção de água e a espessura são características favoráveis das folhas do worm. A capacidade de retenção de água impede a desidratação dos animais após a imobilização prolongada e permite que a longo prazo observações a efectuar.
Além disso, conforme descrito anteriormente,9, as folhas são apenas 300 µm de espessura, permitindo íons pesados tais como íons de carbono (com um intervalo de cerca de 1 mm de água) para passar através da folha, juntando os animais. Isso permite que as partículas de iões para ser detectado e a dose de radiação aplicada para ser medido com precisão. Além disso, as folhas do worm podem ser reutilizadas e, portanto, são econômicas. Com o método de injeção convencional, os animais fechados às vezes estão mortos e que não pode ser tomado fora do canal; seus ovos também podem entupir os canais. Isso torna o chip inutilizável. Chips são, portanto, basicamente descartável e o custo-benefício relação é pobre.
O presente trabalho, descrevemos detalhadamente uma série de métodos para a imobilização em-microplaqueta ao vivo c. elegans indivíduos usando folhas de verme. Através de ensaios de locomoção dos animais 3 h após a imobilização em-microplaqueta, avaliamos o filme de cobertura adequado. Além disso, mostramos exemplos de imobilização em-microplaqueta para observações de imagens e microbeam irradiação.

<table><tbody><tr><td>C. elegans estirpe de tipo selvagem</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, EUA</td><td>Estirpe de</td><td>tipo selvagem N2 C. elegans geralmente utilizada neste estudo</td></tr><tr><td>C. elegans unc-119(e2498) III mutante estirpe</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, EUA</td><td>CB4845</td><td>C. elegans cepa empregada apenas como exemplo de mutantes com forma corporal anormal&nbsp;</td></tr><tr><td>Cepa transgênica C. elegans HBR4</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, EUA</td><td>HBR4</td><td>O genótipo desta cepa transgênica C. elegans é HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54&ndash; 3' utr, unc-119(+)]V. Essa cepa foi empregada apenas para observação por imagem.</td></tr><tr><td>Cepa E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, EUA Cepa</td><td>OP50</td><td>E. coli usada como alimento para C. elegans</td></tr><tr><td>Worm Sheet IR (50/60)</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japão</td><td>BCM17-0001</td><td>Chip microfluídico com 25 50/60-&micro retos; m canais de largura usados em todos os experimentos e observações neste artigo&nbsp;</td></tr><tr><td>Worm Sheet 60</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japão</td><td>BCM18-0001</td><td>Microfluídica chip com 20 retos 60 &micro; canais de largura m. Isso é possível para adultos 3-5 dias após a eclosão a 20 graus Celsius.</td></tr><tr><td>Worm Sheet 50</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japão</td><td>BCM18-0002</td><td>Microfluídica chip com 20 retos 50 &micro; canais de largura m. Isso é possível para jovens adultos ~3 dias após a eclosão a 20 graus C.</td></tr><tr><td>MICRO VIDRO DE COBERTURA</td><td>MATSUNAMI GLASS IND. LTD.</td><td>C030401</td><td>Tampa de vidro (espessura: 130-170 &micro; m) usado em ensaios de locomoção no Protocolo 3</td></tr><tr><td>Polystyrene Film</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japão</td><td>BCM18-0001 / BCM18-0002</td><td>Itens agrupados de folhas de minhoca. PS filim (espessura: ~ 130 &micro; m) usado em ensaios de locomoção no Protocolo 3.</td></tr><tr><td>Filme de Poliéster Lumirror</td><td>TORAY INDUSTRIES, INC., Tóquio, Japão</td><td>Lumirror T60 (t 125 &micro; m)</td> <td>PET filim (espessura: 125 &micro; m) usado em ensaios de locomoção no Protocolo 3</td></tr><tr><td>IWAKI 60 mm/prato não tratado</td><td>AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japão).</td><td>1010-060</td><td>Prato não tratado usado na incubação de C. elegans no Protocolo</td></tr><tr><td>1 IWAKI 35 mm/prato não tratado</td><td>AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japão).</td><td>1010-035</td><td>Prato não tratado usado em ensaios de locomoção no Protocolo 3</td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Merck, França</td><td></td><td>Água ultrapura</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tóquio, Japão</td><td>62020</td><td>120 mm x 215 mm; 200 folhas/caixa</td></tr><tr><td>WormStuff Worm Pick</td><td>Genesee Scientific Corporation, CA, EUA)</td><td>59-AWP</td><td>Platina picker specilized para coleta C. elegans</td></tr><tr><td>Sistema de Microscópio Estereoscópico de Pesquisa</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tóquio, Japão</td><td>SZX16</td><td>Micriscópio usado em todos os experimentos e observações neste artigo</td></tr><tr><td>Suporte de foco motorizado para SZX16</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tóquio, Japão</td><td>SZX2-ILLB</td><td>Isso foi usado para observação de campo brilhante no Protocolo 3-8.</td></tr><tr><td>Lente objetiva (&times; 1)</td> <td>OLYMPUS CORPORATION, Tóquio, Japão</td><td>SDFPLAPO1 e vezes; PF</td><td>NA: 0,15; W.D.: 60 mm. Isso empresta foi usado para observação de campo claro no Protocolo 3-8.</td></tr><tr><td>Lente objetiva (&times; 2)</td> <td>OLYMPUS CORPORATION, Tóquio, Japão</td><td>SDFPLAPO2XPFC</td><td>NA: 0,3; W.D.: 20 mm. Este&nbsp; empresta foi usado para observações de imagem.</td></tr><tr><td>Fonte de luz de mercúrio</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tóquio, Japão</td><td>U-LH100HG</td><td>O amplo espectro de emissão permite que uma variedade de experimentos de imagem de fluorescência seja conduzida usando todos os fluoróforos comuns.</td></tr><tr><td>Unidade de filtro fluorescente SZX16 (alto desempenho para YFP)</td> <td>OLYMPUS CORPORATION, Tóquio, Japão</td><td>SZX2-FYFPHQ</td><td>Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. Isso foi usado para observação de imagem da cepa HBR4.</td></tr><tr><td>Câmera digital de alta velocidade EXILIM</td><td>CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tóquio, Japão</td><td></td><td>EX-F1 Figura 1B, 1E, 1F, Figura 2A-C e Vídeo 1 foram obtidos usando esta câmera digital.</td></tr><tr><td>Office 2013</td><td>Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, EUA</td><td></td><td>EXCEL Software usado para análises estatísticas</td></tr></tbody></table>

imobilização de indivíduos ao vivo caenorhabditis elegans , usando um chip de microfluidic polidimetilsiloxano ultrafino com retenção de água

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiação é amplamente utilizada para aplicações biológicas e para reprodução de feixes de iões, e entre esses métodos, irradiação microbeam representa um poderoso meio de identificar sites radiosensitive em organismos vivos. Este artigo descreve uma série de métodos de imobilização no chip desenvolvido para a irradiação do alvo microbeam dos indivíduos ao vivo de Caenorhabditis elegans. Notavelmente, o tratamento dos chips microfluídicos polydimethylsiloxane (PDMS) que desenvolvemos anteriormente para imobilizar a indivíduos de c. elegans , sem necessidade de anestesia é explicada em detalhes. Este chip, referido como uma folha de verme, é resistente para permitir que os canais microfluídicos ser expandido, e a elasticidade permite que os animais ser envolto suavemente. Também, devido a capacidade de adsorção independente do PDMS, animais podem ser selados nos canais, cobrindo a superfície da folha com um filme de capa fina, em que os animais não são empurrados para os canais para o compartimento de verme. Girando a tampa filme sobre, você pode facilmente acumular os animais. Além disso, a folha do verme mostra a retenção de água e permite que os indivíduos de c. elegans ser submetido a observação microscópica por longos períodos em condições ao vivo. Além disso, a folha é apenas 300 µm de espessura, permitindo íons pesados tais como íons de carbono para passar através da folha de delimitador dos animais, permitindo assim que as partículas de iões ser detectado e a dose de radiação aplicada para ser medido com precisão. Porque a seleção dos filmes capa usada para colocar os animais é muito importante para a imobilização a longo prazo bem sucedida, nós realizou a seleção dos filmes tampa apropriada e mostrou um recomendado entre alguns filmes. Como um exemplo de aplicação do chip, introduzimos a observação de imagens das atividades musculares de animais encerram o canal microfluidic da folha de minhoca, bem como a irradiação microbeam. Estes exemplos indicam que os lençóis de verme tem ampliadas as possibilidades de experimentos biológicos.

Ativo c. elegans indivíduos poderiam ser imobilizados com êxito usando um PDMS ultra-fino, pó molhável, microplaqueta microfluidic (folha do verme). Nós investigamos a adequação de filmes de capa diferente para selar a folha do verme, conforme descrito na seção 3 de protocolo. Para avaliar os efeitos da selagem dos filmes tampa, determinamos a motilidade dos animais 3 h após a imobilização em-microplaqueta usando a tampa de vidro (espessura: 130-170 µm), películas PET (espessura:...

Estabeleceu-se uma série de métodos de imobilização para permitir a irradiação de alvo de viver elegans de Caenorhabditis indivíduos usando um polidimetilsiloxano ultra-fino recentemente desenvolvidos microfluidic chip com retenção de água. Este romance imobilização no chip também é adequada para imagens observações. O tratamento detalhado e exemplos de aplicação do chip são explicados.

Imobilização de indivíduos ao vivo Caenorhabditis elegans , usando um Chip de Microfluidic polidimetilsiloxano ultrafino com retenção de água

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Uma vantagem deste protocolo é que a folha de vermes é fácil de manusear. A folha possui características que impedem a secagem, permitindo-nos realizar a irradiação de micróbios para animais vivos, realizar vários ensaios comportamentais e observação a longo prazo. Os canais microfluidos nesta folha de vermes estão abertos, facilitando a coleta de animais.Essas folhas de vermes também podem ser usadas repetidamente, tornando-as mais econômicas. Quando estávamos desenvolvendo essa técnica, queríamos irradiar apenas uma parte dos animais com um micróbio sob um microscópio. Então precisávamos de fichas claras e finas capazes de segurar os animais.Para começar, coloque uma folha fina e transparente no palco para ser usada como uma foto de capa inferior. Posicione suavemente uma folha de vermes na tampa inferior com pinças planas. Coloque pelo menos três gotículas de solução tampão na superfície de uma placa de Petri de 6 centímetros, não tratada.Em seguida, escolha vários C.elegans adultos com um catador platina de uma placa de cultura. Transfira os animais para uma gotícula com o colhedor de platina e permita que os animais nadem em tampão para remover qualquer bactéria. Lave os animais em duas gotículas separadas e enxágue os animais em outra gota.Em seguida, coloque uma gota de solução tampão na superfície da folha de vermes. Remova os animais lavados da gotícula do buffer e transfira-os para uma gota na folha de vermes. Use pinças planas para colocar uma película de capa PS sobre a folha de vermes e pressione suavemente sobre os canais de uma extremidade da folha para a outra.Ou simplesmente solte animais em gotículas e sele suavemente com o filme de capa para que a gota se espalhe entre a tampa e os lençóis de vermes com os animais dentro do canal. Confirme se os animais estão vivos verificando se há movimento com um microscópio na ampliação de 1-2x. Regissão das posições dos animais e observe especificamente o número do canal em que cada animal está fechado, e a posição de cada animal no canal.Para coletar animais imobilizadores, use pinças planas para remover o filme de capa da folha de vermes e, em seguida, solte 10-15 microliters de solução tampão em um dos canais microfluidos que incluem os animais. Sob o estereótipo, observe os animais quando eles começam a girar. Em seguida, use o catador platina para pegar os animais de natação e transferi-los para uma placa de ensaio.Após o acocluamento dos animais como demonstrado anteriormente, observe manchas fluorescentes nos animais com um microscópio de farinha. Em seguida, imagem propagação de ondas de íons de cálcio usando aquisição de vídeo para observar atividades dinâmicas. Coloque a folha de vermes usados em uma placa de petri de seis centímetros e coloque cerca de 100 microliters de água ultra-pura esterilizada na folha.Use dedos enluvados para espalhar água na superfície da folha e lavar quaisquer contaminantes. Em seguida, use lenços descartáveis para remover a umidade da folha de vermes. Distribua cinco mililitros de 70% de etanol na placa de Petri e use dedos enluvados para espalhar o etanol sobre a folha de vermes.Finalmente, depois que a folha estiver seca, coloque a folha em uma placa de Petri estéril e cubra. Usando este protocolo, a adequação de diferentes filmes de capa foi investigada. Não houve diferença significativa na motilidade entre animais de controle e animais envoltos em canais microfluidos com filme PS.Em contraste, a motilidade foi significativamente reduzida em animais fechados sob um vidro de cobertura. A motilidade dos animais fechados com um filme de estimação também foi significativamente diminuída. É importante selecionar filmes de capa para a vedação de canais microfluidos cuidadosamente.Usando este protocolo, avaliamos a adequação de diferentes filmes de capa através de ensaios de locomoção dos animais três horas após a imobilização no chip. Usando esta técnica, pretendemos desenvolver um chip de umidade ultrafina apenas para irradiação de micróbios. No entanto, essas folhas de vermes já foram usadas para imagens e ensaios comportamentais além de suas aplicações originais.

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Comportamento de imagem e atividade neural em longas escalas de tempo sem imobilização do animal é um pré-requisito para entender o comportamento. A imagem das câmaras microfluídicas de agarose (IAM) pode ser usada para obter imagens da atividade neural e do comportamento de todos os estágios da vida de Caenorhabditis elegans.

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Novas ferramentas para pesquisa de mechanobiology são necessários para compreender o estresse mecânico como ativa vias bioquímicas e elicia respostas biológicas. Aqui, vamos mostrar um novo método para a estimulação mecânica seletiva dos animais imobilizados com uma armadilha de microfluidic permitindo imagens de alta resolução de respostas celulares.

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Aprenda a imobilizar Caenorhabditis elegans vivos usando chips microfluídicos ultrafinos de polidimetilsiloxano com retenção de água. Este método permite irradiação microfeixe direcionada e observação comportamental de longo prazo.

Imobilização de indivíduos ao vivo Caenorhabditis elegans , usando um Chip de Microfluidic polidimetilsiloxano ultrafino com retenção de água (Vídeo) | JoVE Journal

Imobilização de indivíduos ao vivo Caenorhabditis elegans , usando um Chip de Microfluidic polidimetilsiloxano ultrafino com retenção de água

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