Name: Deteção de imunoglobulina Antiaquaporina-4 G de soro humano por ensaio baseados em células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Aprenda a detectar imunoglobulina G antiaquaporina-4 em soro humano por ensaio baseado em células. Este método oferece maior sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de transtornos do espectro da neuromielite óptica.

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Os autores são gratos pelo apoio de subsídios da Fundação Nacional de Ciências da China (n. º 31600820), a saúde e Comissão planejamento familiar da província de Jilin (não 2016Q036) e a ciência e tecnologia planejamento projeto da província de Jilin (n. º 20180520110JH).

Este procedimento foi aprovado pelo Comitê de ética da Universidade primeiro Hospital de Jilin e realizou-se em aproximadamente 1.500 indivíduos.
1. se o paciente registro e coleta de amostra de sangue
<ol><li>Aplica a detecção laboratorial de soro de que IgG anti-AQP4 aos pacientes da clínica com os principais queixas e sintomas listado abaixo. Realize exames físicos também. Neurite óptica: pacientes sofrem com déficits visuais, tais como a perda dos campos visuais e redução da acuidade visual. Mielite aguda: os pacientes podem apresentar com paralisia, déficits sensoriais e disfunção autonômica. Síndrome de área postrema: os pacientes podem ter sintomas de soluços inexplicados, náuseas ou vómitos. Síndrome de tronco cerebral aguda: lesões do tronco cerebral podem resultar em diferentes sintomas e sinais físicos, dependendo da localização das lesões. Narcolepsia sintomática ou aguda síndrome clínica diencephalic com lesões diencephalic NMOSD-típicas do MRI. Síndrome cerebral sintomático com lesões NMOSD-típicas do cérebro. Nota: De acordo com os critérios de diagnóstico de consenso internacional para NMOSD5, um diagnóstico de NMOSD pode ser feita se o paciente é soro anti-AQP4 IgG-positivo e tem pelo menos uma das características clínicas do núcleo acima mencionados. No entanto, não recomendamos teste de IgG anti-AQP4 em pacientes com neurite óptica apenas.</li>
	<li>
Coleta de amostra de sangue Nota: pacientes não precisa ser em jejum.<ol>
<li>Desenhe 2-3 mL de sangue venoso em um tubo de coleta de sangue do vácuo de 4 mL.</li>
		<li>Permitir que o soro coagular por 30 min à temperatura ambiente (RT). Nota: Prolongada de coagulação pode aumentar os níveis séricos devido ao escapamento de plaquetas.</li>
		<li>Centrifugar 2100 x g por 5 min., cuidadosamente, transferir o soro para um novo tubo.</li>
		<li>Analisar o soro imediatamente ou alíquota e armazenar a -20-80 ° c. Nota: Armazenamento-20 ° c é para o armazenamento de meses, enquanto a-80 ° C é para o armazenamento de anos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. pesquisa de anticorpos anti-AQP4
Atenção: As amostras dos doentes e dos reagentes utilizados devem ser considerados materiais infecciosos. Reagentes contendo azida de sódio no kit são tóxicos. Um gráfico de fluxo do protocolo é fornecido na Figura 1.
<ol><li>
Preparação
	<ol>
<li>Trazer o kit para RT antes do uso. Nota: Armazene o kit de 2-8 ° c.</li>
		<li>Preparar pelo menos 200 mL de tampão de lavagem PBS contendo 0,2% Tween 20. Despeje um copo de 500 mL, 100 mL de tampão de lavagem.</li>
		<li>Diluir o soro amostras x 10 com tampão de lavagem. Prepare os controles positivos e negativos de acordo com as instruções do distribuidor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubação da amostra
	<ol>
<li>Adicione 30 µ l do pre-diluídas amostras, controle positivo, controle negativo ou para os campos de reação da bandeja do reagente (Figura 2). Nota: Evite bolhas de ar.</li>
		<li>Remova a tampa protetora nas corrediças de biochip. Nota: Não toque os biochips para evitar o desprendimento e a contaminação de células fixas. Segure a slide lado a lado antes de remover a tampa.</li>
		<li>Aplica o slide de biochip para a bandeja do reagente (Figura 2). Começar uma incubação de 30 min a RT Nota: Cada amostra deve ser uma gota individual conectada para o biochip correspondente sem misturar com outras gotículas.</li>
		<li>Lave suavemente o slide de biochip que uma vez com o tampão de lavagem. Mergulhe o slide de biochip para o copo de 500 mL preenchido com 100 mL de tampão de lavagem durante pelo menos 5 min. lugar o copo num agitador se possível.</li>
		<li>Tire o slide biochip do tampão de lavagem. Cuidadosamente Limpe o tampão de lavagem residual fora os campos de reação com uma toalha de papel. Expor o slide de biochip que ao ar livre por 1-2 minutos evaporar o tampão de lavagem residual no campo de reação. Nota: Não seca os campos de reação. Não toque os biochips com toalha de papel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubação do anticorpo secundário
	<ol>
<li>Prepare a solução de anticorpo secundário de acordo com as instruções do distribuidor.</li>
		<li>Adicione 25 µ l de anticorpo secundário fluorescente para os campos de reação de uma bandeja limpa reagente.</li>
		<li>Aplica o slide de biochip para a bandeja de reagente carregada com anticorpo secundário. Incubar durante 30 min à RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montagem
	<ol>
<li>Deite fora o tampão de lavagem usado e adicionar 100 mL de tampão de lavagem fresca no copo medidor. Repeti a lavagem como descrito nos passos 2.2.4 e 2.2.5.</li>
		<li>Adicione cuidadosamente encastre médio para os campos de reação em um slide de biochip (uma gota por campo de reação). Sele o slide de biochip com um pedaço de vidro de tampa. Evite bolhas de ar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deteção de fluorescência
	<ol>
<li>Ligue a lâmpada fluorescente do microscópio e pré-aquecimento de 15 min. escolha um filtro de 488 nm.</li>
		<li>Software de fotografia aberta. Tire fotos das áreas transfectadas e untransfected de todos os campos de reação com diferentes ampliações. Primeiro, tirar uma foto com ampliação de 4x para uma visão geral e, em seguida, tirar mais fotos com 10x e 20 x de ampliações. Nota: O protocolo detalhado é mostrado na tabela 1. Interpretação dos resultados é discutida na seção resultados representativos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. o diagnóstico de pacientes
<ol><li>Se o paciente é soro anti-AQP4 IgG-positivo e mostra pelo menos uma característica clínica do núcleo de NMOSD (veja a seção de discussão), diagnosticar o paciente com NMSOD5. No entanto, se o paciente é anti-AQP4 IgG negativo, o diagnóstico de NMOSD não pode ser excluído.</li>
</ol>

<ol><li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 2 (4), 110(2015).</li>
<li>Ho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+aquaporin+4+at+1.8+A+and+its+mechanism+of+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neuromyelitis+optica-IgG+at+the+blood-brain+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22in+vitro.Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro.</a> in vitro.Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (1), 311(2016).</li>
<li>Sato, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinction+between+MOG+antibody-positive+and+AQP4+antibody-positive+NMO+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Distinction between MOG antibody-positive and AQP4 antibody-positive NMO spectrum disorders.</a> Neurology. 82 (6), 474-481 (2014).</li>
<li>Wingerchuk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+consensus+diagnostic+criteria+for+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">International consensus diagnostic criteria for neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Neurology. 85 (2), 177-189 (2015).</li>
<li>Ruiz-Gaviria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sensitivity+of+aquaporin+4+antibody+detection+tests+in+patients+with+neuromyelitis+optica%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Specificity and sensitivity of aquaporin 4 antibody detection tests in patients with neuromyelitis optica: A meta-analysis.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 4 (4), 345-349 (2015).</li>
<li>Waters, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicentre+comparison+of+a+diagnostic+assay%3A+aquaporin-4+antibodies+in+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery%2C+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Multicentre comparison of a diagnostic assay: aquaporin-4 antibodies in neuromyelitis optica.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 87 (9), 1005-1015 (2016).</li>
<li>Fryer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AQP4+autoantibody+assay+performance+in+clinical+laboratory+service%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">AQP4 autoantibody assay performance in clinical laboratory service.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 1 (1), 11(2014).</li>
<li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+antibody+in+neuromyelitis+optica%3A+re-testing+study+in+a+large+population+from+China%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 antibody in neuromyelitis optica: re-testing study in a large population from China.</a> The International Journal of Neuroscience. 127 (9), 790-799 (2017).</li>
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<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+characteristics+of+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%3A+an+international+update%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">MRI characteristics of neuromyelitis optica spectrum disorder: an international update.</a> Neurology. 84 (11), 1165-1173 (2015).</li>
<li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOG+encephalomyelitis%3A+international+recommendations+on+diagnosis+and+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">MOG encephalomyelitis: international recommendations on diagnosis and antibody testing.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 134(2018).</li>
<li>Narayan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOG+antibody+disease%3A+A+review+of+MOG+antibody+seropositive+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">MOG antibody disease: A review of MOG antibody seropositive neuromyelitis optica spectrum disorder.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 25, 66-72 (2018).</li>
<li>Ogawa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOG+antibody-positive%2C+benign%2C+unilateral%2C+cerebral+cortical+encephalitis+with+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">MOG antibody-positive, benign, unilateral, cerebral cortical encephalitis with epilepsy.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 322(2017).</li>
<li>Valentino, P., Marnetto, F., Granieri, L., Capobianco, M., Bertolotto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+antibody+titration+in+NMO+patients+treated+with+rituximab%3A+A+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 antibody titration in NMO patients treated with rituximab: A retrospective study.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 317(2016).</li>
<li>Kessler, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-aquaporin-4+titer+is+not+predictive+of+disease+course+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%3A+A+multicenter+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Anti-aquaporin-4 titer is not predictive of disease course in neuromyelitis optica spectrum disorder: A multicenter cohort study.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 17, 198-201 (2017).</li>
<li>Mealy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+serostatus+does+not+predict+response+to+immunotherapy+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 serostatus does not predict response to immunotherapy in neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Multiple Sclerosis. , (2017).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+aquaporin-4+antibodies+in+Chinese+patients+with+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica.</a> Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).</li>
<li>Kitley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+and+disease+course+in+aquaporin-4+antibody-positive+patients+with+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder+from+the+United+Kingdom+and+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors and disease course in aquaporin-4 antibody-positive patients with neuromyelitis optica spectrum disorder from the United Kingdom and Japan.</a> Brain. 135 (6), 1834-1849 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Descrevemos um método amplamente acessível para detectar IgG anti-AQP4 no soro humano. IgG anti-AQP4 está intimamente relacionado com NMOSD, e que estabelece um método de deteção de IgG anti-AQP4 confiável é fundamental para o diagnóstico clínico de NMOSD. Primeiro, o IgG anti-AQP4 é específico para NMOSD. Esclerose múltipla é também uma doença imune-mediada do sistema nervoso central e compartilha muitas semelhanças com NMOSD12. No entanto, o IgG anti-AQP4 só é positivo em NMOSD...

Soro AQP4 IgG é um biomarcador de diagnóstico de núcleo para Neuromielite optica espectro transtornos (NMOSD)1. O ensaio de baseada em célula (CBA) é um método de deteção de IgG anti-AQP4 amplamente utilizado com alta sensibilidade e especificidade. Aqui, um protocolo detalhado para a CBA é introduzido.
AQP4, uma proteína de canal de água, possui seis unidades de membrana que mede e dois domínios helicoidais em torno um aquosa pore2. IgG anti-AQP4 está envolvida na patogênese da NMOSD por meio de ligação ao seu alvo AQP4, que situa-se principalmente sobre o endfeet de astrócitos3. Tem sido demonstrado que IgG anti-AQP4 é positivo em cerca de dois terços dos pacientes NMOSD4. Nos mais recentes critérios diagnósticos internacionais para NMOSD, IgG anti-AQP4 é considerado ser um biomarcador diagnóstico do núcleo5. A este respeito, é fundamental estabelecer um protocolo confiável para detectar soro humano IgG anti-AQP4 e facilitar o diagnóstico clínico de NMOSD.
Atualmente, vários métodos de deteção de IgG anti-AQP4 estão disponíveis, tais como a CBA, ensaio baseado em tecido, ensaio imunoenzimático e citometria de fluxo6,7. CBA emprega EU90 células, que são transfected com AQP4 humano, para capturar IgG anti-AQP4. O IgG anti-AQP4 capturado é detectado pelos anticorpos secundários fluorescentes e posteriormente visualizado por microscopia. Acumular evidências tem mostrado que a CBA é mais sensível e específico do que outros anti-AQP4 IgG deteção métodos6,7. De acordo com uma meta-análise, a sensibilidade e especificidade do CBA foram mostrados para ser de 76% e 99%, que eram superiores baseados em tecido e ensaios de enzima-lig da imunoabsorção6. Além disso, uma comparação multicêntrico de ensaios de diagnósticos de IgG anti-AQP4 foi realizado7. Um total de 193 estudo sujeitos de 15 centros de diagnósticos europeus foram matriculados7. Quatro diferentes métodos foram utilizados para detectar soro de IgG anti-AQP47. Foi demonstrado que a CBA foi mais sensível e específico do que os outros métodos7. Como AQP4 é expressa em duas isoformas principais (AQP4-M1 e M23-AQP4), célula de captura de IgG anti-AQP4 é transfectada com AQP4-M1 ou AQP4-M23. No entanto, o tipo de célula de captura é melhor permanece controverso. Uma investigação apoiou AQP4-M1 baseado CBA8, enquanto outros têm indicado que AQP4-M23 baseado CBA é melhor7,9,10. No entanto, CBA AQP4 M23-baseados pode produzir resultados falso-positivos devido a inespecíficos IgG ligação8. Jarius et al.. 11 relataram que não houve significativa diferença em taxas de detecção de IgG anti-AQP4 entre AQP4-M1 e CBAs AQP4-M23-baseado.
Em resumo, soro anti-AQP4 IgG é um biomarcador de núcleo para NMOSD. CBA tem maior especificidade e sensibilidade que outros métodos de deteção de IgG anti-AQP4. Permanece controverso se AQP4-M1-AQP4 M23-baseado ou CBA é melhor. Neste artigo, um protocolo detalhado para a CBA AQP4 M1-baseada é descrito, que pode aplicar para o diagnóstico clínico e estudos de NMOSD.

<table><tbody><tr><td>Anti-aquaporina-4 IIFT</td><td>Euroimmun</td><td>FA 1128-2005-50</td><td>Contém lâminas de biochip revestidas com células EU 90 transfectadas e não transfectadas com AQP4-M1, IgG anti-humana marcada com fluoresceína, anticorpo anti-AQP4 como controle positivo, amostra negativa para anticorpo, sal para PBS pH 7.2, Tween 20 e meio de inclusão.&nbsp;</td></tr><tr><td>Software de fotografia CellSens Dimension</td><td>OLYMPUS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo ativador de gel e coágulo</td><td>Melhore a</td><td>623040202</td> médica <td>De uma empresa chinesa local</td></tr></tbody></table>

deteção de imunoglobulina antiaquaporina-4 g de soro humano por ensaio baseados em células

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Antiaquaporina-4 (AQP4) Imunoglobulina G (IgG) é o biomarcador de núcleo diagnóstico para transtornos do espectro do Neuromielite optica (NMOSD). O ensaio de baseada em célula (CBA) é um método amplamente utilizado para detectar IgG anti-AQP4 no soro humano com alta sensibilidade e especificidade. Brevemente, soro anti-AQP4 IgG é capturado pela célula AQP4-transfectadas que é fixada sobre o biochip então detectada por um anticorpo secundário marcado com fluoresceína. Microscopia de fluorescência é utilizada para visualizar a fluorescência, e a intensidade da fluorescência é avaliada pelo menos dois médicos experientes. Um diagnóstico final de NMOSD pode ser feito com base na combinação de resultados de deteção de IgG anti-AQP4, manifestações clínicas e achados neurorradiológica. De acordo com estudos anteriores, a CBA é mais sensível e específica do que outros métodos de deteção de IgG anti-AQP4, e pode ser aplicada para diagnóstico clínico e estudos de NMOSD. O método tem limitações; por exemplo, a escala internacional para avaliar a concentração de IgG do soro anti-AQP4 é ainda insuficiente. Aqui, um protocolo detalhado para a deteção de IgG anti-AQP4 soro humano usando CBA é descrito.

Usando o procedimento descrito aqui, anti-AQP4 específicos IgG no soro é detectável. Durante o procedimento, pre-diluídas amostras, um controle positivo e um controle negativo foram adicionados aos campos de reação, que contêm áreas transfectadas e untransfected (Figura 2). Fluorescência do controlo negativo numa área transfectada indicado principalmente a vinculação não específico do anticorpo secundário às células transfectadas em biochips (<strong class="x...

Baseada em célula de ensaio é um método amplamente utilizado para detectar imunoglobulina de soro antiaquaporina-4 G. Esse método pode ser aplicado para o diagnóstico clínico e pesquisas científicas de transtornos do espectro óptico Neuromielite.

Deteção de imunoglobulina Antiaquaporina-4 G de soro humano por ensaio baseados em células

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

De acordo com os recentes critérios de diagnóstico internacional para distúrbios do espectro neuromielite optica, o IgG anti-AQP4 é considerado um biomarcador de diagnóstico central. A detecção de IgG anti-AQP4 por ensaio baseado em células pode facilitar o diagnóstico clínico. Assim, o ensaio baseado em células é mais sensível e específico do que outros métodos de detecção.E pode ser aplicado tanto ao diagnóstico clínico quanto aos estudos científicos. Primeiro, leve as amostras de soro do paciente, o slide biochip, o pó PBS e o TWEEN 20 do kit de ensaio à base de células refrigeradas à temperatura ambiente. Em seguida, prepare mais de 200 mililitros de tampão de lavagem PBS contendo 0,2% de TWEEN 20 para cada slide de biochip.Use o tampão de lavagem para fazer diluições seriais de 10 vezes de cada amostra de soro. Prepare controles positivos e negativos de acordo com as instruções do fabricante. Adicione 30 microliters de diluições seriais de 10 vezes da amostra, o controle positivo e o controle negativo, a cinco campos de reação individuais na bandeja de reagentes.Segure o slide biochip por seus slides e remova sua tampa protetora sem tocar em seus campos de reação. Coloque o slide em cima da bandeja de reagente e incubar a configuração em temperatura ambiente por 30 minutos. Enxágue suavemente o slide de biochip com o tampão de lavagem.Em seguida, mergulhe-o em um béquer de 500 mililitros cheio de 100 mililitros do tampão de lavagem, e deixe-o na temperatura ambiente por 10 minutos. Retire o slide biochip do tampão de lavagem. Use uma toalha de papel para limpar cuidadosamente qualquer tampão restante fora dos campos de reação.Deixe o deslizamento secar por um a dois minutos. Na sala escura, adicione 25 microliters de anticorpo secundário fluorescente a cada campo de reação da bandeja de reagente. Coloque o slide em cima da bandeja de reagente e incubar a configuração em temperatura ambiente por 30 minutos.Enxágue suavemente o slide de biochip com o tampão de lavagem. Em seguida, mergulhe-o em um béquer de 500 mililitros cheio de 100 mililitros do tampão de lavagem fresco, e deixe-o na temperatura ambiente por 10 minutos. Retire o slide biochip do tampão de lavagem.Use uma toalha de papel para limpar cuidadosamente qualquer tampão restante fora dos campos de reação. Deixe o deslizamento secar por um a dois minutos. Adicione cuidadosamente uma gota do meio de incorporação a cada campo de reação no slide biochip.Por fim, sele o slide biochip com um vidro de cobertura, evitando bolhas de ar e proceda com imagens. A intensidade fraca de fluorescência do controle negativo observado na área infectada indica a ligação inespecífica do anticorpo secundário. A comparação entre as intensidades detectadas de fluorescência do controle positivo nas áreas infectadas e não infectadas indica a ligação específica do IgG anti-AQP4 ao AQP4M1 nas células infectadas.O soro negativo IgG anti-AQP4 mostra padrões de ligação semelhantes ao controle negativo em áreas infectadas e não infectadas. O soro positivo mostra padrões de ligação semelhantes ao controle positivo em áreas infectadas e não infectadas. As amostras são consideradas anti-AQP4 IgG positivas quando a fluorescência aumenta heterogeneamente na área infectada.A intensidade da fluorescência está correlacionada com o título anti-AQP4 IgG no soro. As amostras são consideradas provavelmente positivas quando apenas um pequeno número de células na área transfeinada mostram intensidades detectáveis de fluorescência. Uma amostra deve ser considerada como anti-AQP4 IgG negativa quando sua intensidade na área infectada é apenas homogêneamente mais forte do que na área não infectada.Evitar bolhas de ar é vital e difícil. Para eliminar bolhas de ar, primeiro use uma pipeta para evitar bolhas de ar em gotículas. Em segundo lugar, ao aplicar o slide biochip na bandeja do reagente, primeiro deixe um lado do slide tocar as gotículas e, em seguida, nivele o slide lentamente.Além disso, não toque nos campos de reação durante todo o experimento.

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Imunologia e Infecção

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Aprenda a detectar imunoglobulina G antiaquaporina-4 em soro humano por ensaio baseado em células. Este método oferece maior sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de transtornos do espectro da neuromielite óptica.

Deteção de imunoglobulina Antiaquaporina-4 G de soro humano por ensaio baseados em células

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