Name: Cultura primária de células Adrenocortical rato e ensaios das funções reguladora (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 33 s
Description: Aprenda a cultura primária de células adrenocorticais de ratos para estudar esteroidogênese e resposta ao estresse. Este método permite investigar a produção de corticosterona e doenças relacionadas ao estresse.

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Este trabalho foi financiado por um subsídio da Taiwan Nacional de Conselho de ciência (NSC102-2320-B-037-008-MY3) e um Nacional Cheng Kung University Hospital Research Grant (NCKUH-10102045).

Todos os procedimentos, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê de Kaohsiung médica da Universidade.
1. procedimento experimental
<ol><li>Sacrifica os ratos de SD fêmea/macho adulto (8 a 12 semanas de idade) por eutanásia de CO2 .</li>
	<li>Aplicar o etanol a 70% e deixá-lo ser absorvido pela pele e em seguida, limpe a pele com um papel absorvente.</li>
	<li>Coloque o rato em um prato plástico limpo na posição supina.</li>
	<li>Levantar a pele com pinças curvas "externas" na linha e executar uma dissecção romba, criando uma forma de "Y" (do nível da coxa para o ângulo subcostal).<ol>
<li>Enxágue a tesoura com etanol a 70% e, em seguida, cortar o músculo, criando também uma forma de "Y".</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Encontre a glândula adrenal esquerda atrás do estômago. Nota: a supra-renal direita encontram-se profundamente atrás do fígado.<ol>
<li>Use um par de pinças para levantar o estômago ou fígado e isolar as supra-renais com outra pinça curvada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois de colocar as glândulas adrenais em um prato estéril, remova cuidadosamente a cápsula supra-renal com pinça fina.</li>
	<li>Com um delicado par de tesouras, cortar as supra-renais em pedaços pequenos com um pouco de soro livre Dulbecco modificada do meio da águia (DMEM) / F-12 médio.</li>
	<li>
Preparar três pipetas Pasteur de poro de tamanho diferentes e use a primeira pipeta Pasteur para aspirar todas as peças de adrenais em um tubo cônico de 50 mL contendo meio com colagenase II (~0.5–0.8 mg/mL).
	<ol>
<li>Delicadamente, Triture os pedaços de tecido cerca de 10x. Use o resto das pipetas e repita os passos acima até que todas as peças tornam-se menores. Nota: Os tamanhos diferentes do pore das pipetas Pasteur podem ser criados por aquecimento com fogo. A primeira pipeta é o tamanho original (cerca de 1 mm), o tamanho dos poros do segundo é de cerca de 0,8 mm, e a terceira pipeta Pasteur é cerca de 0,5 mm. Durante a digestão, as peças da adrenal se tornará menores. Assim, através do procedimento mecânico, as supra-renais podem ser digeridas mais completo. Incubar o tubo em um banho de água (a 37 ° C) e agite-a cada 5 min, 4x no total.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a incubação de 20 min, adicione meio fresco e fresco (sêxtupla volume; por exemplo, 5 mL de tecido + 25 mL de meio legal de DMEM/F-12) contendo 2,5% bovina soro fetal (FBS) e 5% de soro de cavalo para parar o efeito da enzima.</li>
	<li>Recolha as pelotas de célula por centrifugação a 800 x g durante 10 minutos.</li>
	<li>Adicione um volume adequado de meio para suspender as células. Nota: Cada glândula pode fazer cerca de 3 ~ x 105 ~ 4 x 105 células.</li>
	<li>As células em chapas desejadas ou pratos da placa com meio de cultura (mistura 1:1 [v/v] do meio de F-12 DMEM e do presunto, suplementado com 25mm HEPES e 1% penicilina e estreptomicina) durante a noite (dia 0) a 37 ° C, em um ambiente umidificado de 95% de ar e 5% CO2. Nota: Normalmente, nós chapear células em placas de 24 poços (quatro glândulas/placa) para o ensaio de corticosterona e em 35 milímetros pratos (uma glândula/aproximadamente um ou dois pratos) para western blot análise.</li>
	<li>Lavar cuidadosamente as células 2 x com isento de soro morno meio DMEM/F-12 (dia 1). Substitua o novo meio de crescimento.</li>
	<li>Manter as células a 37 ° C, em um ambiente umidificado de 95% de ar e 5% CO2 até dia 3.</li>
</ol>

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<li>Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+adipocyte+biology.+The+perilipin+family+of+structural+lipid+droplet+proteins%3A+stabilization+of+lipid+droplets+and+control+of+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis.</a> Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).</li>
<li>Hoeflich, A., Bielohuby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+adrenal+gland+growth%3A+signal+integration+by+extracellular+signal+regulated+kinases1%2F2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).</li>
<li>O'Hare, M. J., Neville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+responses+to+corticotrophin+and+cyclic+AMP+by+adult+rat+adrenocortical+cells+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture.</a> Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Glândulas supra-renais desempenham um papel chave na adaptação ambiental3. O hormônio pelo qual o córtex adrenal secreta pode regular e ajustar as funções fisiológicas e homeostase3. O modelo in vivo reflete os efeitos fisiológicos real no corpo. No entanto, ainda é influenciado por muitos fatores complexos, causando efeitos instáveis em experimentos. Em contraste, o modelo de células in vitro tem vantagens que o torna incomparável para o modelo animal. Primeiro, a condição...

O sistema endócrino é responsável pela regulação de atividades fisiológicas e homeostase1. Glândulas supra-renais localizadas no polo cranial dos rins são os principais órgãos do sistema endócrino que segregam mineralocorticoides, glicocorticoides e androgênios2,3. Há duas partes distintas da glândula supra-renal: o córtex e a medula. O córtex adrenal consiste em três camadas: o exterior glomerulosa, fasciculada a intermediário e o reticular interno3. A zona glomerulosa é o site original secretando de aldosterona, um mineralocorticoide, que auxilia na reabsorvendo o íon de sódio e água nos rins3. A zona fasciculada principalmente produz um nível basal de glicocorticoides em condições fisiológicas normais3. Corticosteroides em roedores e cortisol em humanos agir para ajudar o corpo em lidar com o estresse, regulando a glicose de sangue3. Em certa medida, eles podem inibir respostas inflamatórias e regular o sistema imunológico4,5. Em contraste com outros mamíferos, camundongos e ratos não têm um funcional zona reticular devido à falta de uma expressão de 17α-hidroxilase na glândula adrenal6,7. Assim, as glândulas supra-renais de camundongos e ratos são desprovido de secreção de esteroides adrenais de C-19 (cortisol e andrógenos adrenais).
Culturas de células adrenocortical primárias foram mostradas para ser útil para investigar mecanismos controlando a fisiologia renal8. Como outros tecidos esteroidogênica, cada zona adrenal sintetiza seus esteroides de colesterol livre9. Após estimulação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), o colesterol livre é liberado de gotículas lipídicas de repartição e, assim, aumenta a produção de esteroides na10fasciculada e reticular.
Muitos grupos têm tentado estabelecer linhas de célula estável de carcinomas de adrenocortical. No entanto, várias preocupações têm limitado a utilização de linhas de célula adrenocortical, como na vitro modelos8. As respostas de esteroides de linhas celulares podem diferir entre passagens, número de lote do soro e a qualidade do soro, etc. Além disso, linhas de células adrenais comercial (Y1 e SW13) não secretam corticosterona, tornando mais difícil para estudar a esteroidogênese adrenal8. Bovinas e equinos supra-renais usando como ex vivo modelos podem ser uma boa escolha, mesmo que os tecidos de nesses mercados podem obscurecer alguns riscos desconhecidos. Comparado a eles, gerenciar as glândulas supra-renais do rato é mais fácil e a fonte é relativamente mais estável e isentos de agentes patogénicos. Tomados em conjunto, o presente método descrito aqui pode ser usado para investigar o mecanismo relacionado da síntese de corticosterona em células adrenais fasciculata de rato.

<table><tbody><tr><td>Ratos fêmeas/machos, SD/Wistar (8-12 semanas)</td><td>Ratos machos ou femal BioLASCO</td><td></td><td>são adequados para experimentos. As glândulas supra-renais das fêmeas são maiores do que as dos ratos machos, no entanto, as ratas possuem os ciclos estrais que podem influenciar os experimentos</td></tr><tr><td>Colagenase, tipo II</td><td>Sigma</td><td>C-6885</td><td>isolamento de células supra-renais</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12800-017</td><td>meio em pó para células adrenais</td></tr><tr>Meio em pó F12 <td>ThermoFisher</td><td>21700-075</td><td>da Ham's</td><td>para células adrenais</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>JT.baker</td><td>4018</td><td>tampão (pó)</td></tr> <tr><td>NaHCO 3</td> <td>JT.baker</td><td>3506-1</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Hyclone</td><td>16050014</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>SAFC</td><td>12103C</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina (10.000 U) -estreptomicina (10.000 ug / mL)</td> <td>Antibióticos Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Pinça curva</td><td>BRAUN</td><td>BD343R</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>BRAUN</td><td>BD331R</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>BRAUN</td><td>BC224R</td><td>corte pele e músculo de rato</td></tr><tr><td>Tesoura delicada</td><td>BRAUN</td><td>BC101R</td><td>corte glândulas supra-renais</td></tr><tr><td>Proteína relacionada à diferenciação adiposa</td><td>Abcam</td><td>ab108323</td><td>anticorpo para proteína associada a gotículas lipídicas</td></tr><tr><td>Corticosterona ELISA kit</td><td>cayman</td><td>500655</td><td>ensaio para síntese de corticosterona</td></tr><tr><td>Microscopia de luz invertida</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT.baker</td><td>X198-07</td><td>para coloração de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho IgG Alexa 488 Anticorpo secundário de fluorescência</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11034</td><td>para coloração de</td></tr> <tr><td>imunofluorescênciaAnti-ADFP</td><td>Abcam</td><td>108323</td><td>para coloração de imunofluorescência</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td>para coloração de imunofluorescência</td></tr></tbody></table>

cultura primária de células adrenocortical rato e ensaios das funções reguladora

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

O hormônio que segrega o córtex adrenal é vital para os animais contra estresse e doenças. O método descrito aqui é o procedimento de células adrenais primários rato culta e relacionados ensaios funcionais (mancha da imunofluorescência de proteína gotículas lipídicas, bem como análise de corticosterona). Ao contrário de um modelo in vivo, a variação de interexperiments em culturas de monocamada adrenal é menor e a condição experimental é fácil de controlar. Além disso, a fonte de ratos também é mais estável do que outros animais, como bovinos ones. Existem também várias linhas de célula humana adrenal (NCI-H295 NCI-H295R, SW13, etc) que podem ser usadas em estudos de adrenais. No entanto, a produção de esteroides dessas linhas será ainda influenciada por inúmeros fatores, que incluem o número de lote de soro, número de passagem, mutante/perda de genes distintos, etc. Exceto por falta de 17α-hidroxilase, a cultura primária de células de rato adrenocortical é uma técnica melhor e mais conveniente para estudar fisiologia renal. Em resumo, culturas adrenal primária rato poderiam ser uma boa plataforma in vitro por pesquisadores investigar os mecanismos do reagente de interesse no sistema de glândula adrenal.

Usando o procedimento descrito aqui, o principais culturas células adrenais poderiam ser distinguidas sob um microscópio de contraste de fase (figura 1A). Para confirmar que as vesículas no citoplasma são gotículas lipídicas, a mancha da imunofluorescência de proteínas relacionadas com diferenciação adiposa (ADRP) pode efectuar-se dia-3 culturas (figura 1B). As células foram cultivadas sobre as lamelas de vidro. As células foram ...

O hormônio secretado pelo córtex adrenal é vital para os animais contra doenças e estresse. Aqui, apresentamos um protocolo para cultura o rato primário células adrenais. Pode ser uma boa plataforma in-vitro para investigar os mecanismos do reagente de interesse na esteroidogênese adrenal e biossíntese de lipídios.

Cultura primária de células Adrenocortical rato e ensaios das funções reguladora

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

O protocolo apresentado é muito fácil e ajudará os pesquisadores a preparar culturas suprarrenais primárias. Ele fornece um procedimento fácil para iniciar a esterilnese adrenal. Esta técnica pode ser aplicada na triagem das doenças relacionadas ao estresse, todos os potenciais das respostas inflamatórias inibidas pelo agente.Demonstrando o procedimento estará Wei-Chang Lee, um estudante de mestrado do meu laboratório. Comece esterilizando o rato SD de tamanho eutanizado usando 70% de etanol e deixando-o ser absorvido na pele. Depois de limpar a pele com o papel de tecido, coloque o rato sobre uma placa de plástico limpa na posição supina.Em seguida, use fórceps curvos externos para levantar a pele na linha média. Use a tesoura para realizar uma dissecção contundente da pele, criando uma forma Y do nível da coxa até o ângulo subcostal. Depois de enxaguar a tesoura com 70% de etanol, corte o músculo, criando também uma forma Y.Localize a glândula suprarrenal esquerda atrás do estômago na direita atrás do fígado. Com um par de fórceps padrão e um par de fórceps curvos, levante o estômago e o fígado e, em seguida, isole as suprarrenais com outra fórceps curvas e coloque-as em um prato

primary-culture-rat-adrenocortical-cells-assays-steroidogenic

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Biologia

Adrenal medular cromafins sistemas de cultura de células são extremamente úteis para o estudo da secreção de excitação de acoplamento em uma configuração em vitro. Este protocolo ilustra o método utilizado para dissecar as supra-renais e, em seguida, isolar a região medular, removendo o córtex adrenal. A digestão da medula em células cromafins único é então demonstrada.

Rato de isolamento de células Adrenal Cromafim

Neste artigo, descrevemos uma forma típica para isolar e cultura miócitos adulto coração de rato. Colagenase e protease são usadas para digerir e isolar miócitos único. Miócitos cultivadas seguir este protocolo de responder às necessidades mais experiência.

Cultura primária de Miócitos Coração Adulto Rat

Hepatócitos primários proporcionar uma ferramenta valiosa para avaliar as funções bioquímicas, moleculares, e metabólicas em um sistema fisiologicamente relevante experimental. Nós descrevemos um protocolo confiável para rato em perfusão de fígado in situ, que sempre gera hepatócitos viáveis ​​até to1.0 ×...

Isolamento e cultura primária de células hepáticas de ratos

Arginina-vasopressina (AVP) controla o ajuste fino da homeostase de água do corpo, facilitando a reabsorção de água pelas células principais renais. Aqui, apresentamos um protocolo para o cultivo de rato principal coletor medular interno células do duto adequados para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à reabsorção de água AVP-mediada.

Cultura primária Rat coletor medular interno células dos ductos

células de Sertoli primária são necessários para o estudo de testículo-imune privilégio, transdução de sinal durante a inflamação ou infecção, e a utilização das suas propriedades imunoprotectoras. Aqui, descrevemos um protocolo com base em enzima para o isolamento de células de Sertoli primário altamente purificadas e células peritubulares a partir de testículos de rato.

Isolamento de células de Sertoli e as células de rato peritubular Testículos

Os oligodendrócitos são as células mielinizantes do sistema nervoso central. Este protocolo descreve um método para o isolamento e cultivo de seus precursores, células progenitoras de oligodendrócitos, a partir de córtices de ratos, bem como um método quantitativo rápido e confiável para avaliar a oligodendrogênese in vitro em resposta a fatores experimentais.

Preparação de culturas de Rat Oligodendrocyte progenitoras e quantificação de Oligodendrogenesis Usando Scanning Fluorescência Dual-infravermelho

Aqui nós apresentamos um método para isolar as glândulas adrenal de ratos, corrigir os tecidos, seção-los e executar a mancha da imunofluorescência.

Isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de Mouse

Este protocolo tem como objetivo isolar mRNAs ribossomais de tradução específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP.

Isole RNAs específicos do tipo celular de amostras de tecido heterogêneo congeladas sem triagem celular

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar células-tronco epiteliais endometriais (reESCs) de ratos, gerando organoides endometriais de ratos. Este método facilita estudos in vitro de doenças endometriais, permitindo a edição de genes e outras manipulações celulares.

Geração e caracterização de organoides de útero de rato a partir de células-tronco epiteliais endometriais de rato

Uma abordagem robusta e reprodutível para estabelecer culturas primárias 2D de células enriquecidas com zona glomerulosa e zona fasciculata foi desenvolvida para o córtex adrenal do camundongo. Esse sistema preserva características moleculares e funcionais chave de cada zona, permitindo uma investigação focada das vias de sinalização, produção de hormônios e comportamento das células corticais adrenais ex vivo.

Estabelecimento de Culturas Primárias Enriquecidas em Zona a partir do córtex adrenal do camundongo

Aprenda a cultura primária de células adrenocorticais de ratos para estudar esteroidogênese e resposta ao estresse. Este método permite investigar a produção de corticosterona e doenças relacionadas ao estresse.

Cultura primária de células Adrenocortical rato e ensaios das funções reguladora

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