Name: Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a monitorar esferoides tumorais tridimensionais usando tomografia de coerência óptica para quantificação volumétrica e detecção de tecido necrótico sem marcadores. Este método acelera a descoberta de fármacos anticâncer.

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Este trabalho foi apoiado pela NSF concede IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (PII-1640707), fundo de inicialização do NIH grants Lehigh University, R15EB019704 e R01EB025209 e R21EY026380.

1. preparação das células
<ol><li>Obter linhas de células de um fornecedor qualificado. Nota: Verifique se as células a partir das linhas de células de interesse podem formar esferoide nos meios de cultura ou com a ajuda de um substrato (matriz de membrana basal como Matrigel). Olhar para a literatura9 ou realizar uma rodada de um pre-experimento de para uma verificação.</li>
	<li>Descongele as células congeladas, seguindo o procedimento específico fornecido pelo fornecedor linha celular. Um procedimento geral pode ser encontrado em outro lugar43.</li>
	<li>Cultura de células para 1-2 passagens em frascos de cultura 25 cm2 . As células são então prontas para uso para cultura de células 3D.</li>
	<li>Monitorar o status de saúde das células todos os dias e mantê-las em uma incubadora em condições padrão (37 ° C, 5% de CO2, 95% de umidade). Atualize a mídia conforme necessário. Nota: O meio de cultura é composto por DMEM (glicose de 4,5 g/L), 1% de antibiótico antimicótico, 10% de soro fetal bovino. Células de subcultura antes que eles atinjam a confluência no frasco de cultura. Siga a orientação de cultura celular fornecida pelo fornecedor. Um procedimento geral pode ser encontrado elsehwhere44.</li>
	<li>Realize cultura de células 3D em placas multi bem com base no seguinte protocolo geral9.<ol>
<li>Retire o frasco de cultura com os meios de cultura e lavá-lo com soro fisiológico esterilizado tamponado de fosfato (PBS, aquecido a 37 ° C).</li>
		<li>Ressuspender as células, adicionando 1 mL de ácido etilenodiaminotetracético de tripsina (EDTA, 0,5%) para o balão por 3 min. Em seguida, adicione os meios de cultura para diluir a tripsina.</li>
		<li>Transferi a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar durante 5 min à x 500 g e a temperatura ambiente.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 4 mL de meio de cultura previamente aquecido. Pipete uma gota da amostra para um hemocytometer para a contagem de células determinar a concentração de células. Dilua as células de concentração adequada para semeadura (por exemplo, 3.000 células/mL). Nota: Otimize a concentração inicial de célula do spheroid para cada célula-linha e cada tipo de placa multi bem (96 poços, 384-bem ou bem-1536).</li>
		<li>Células de sementes em uma placa multi bem redondo de fixação ultra baixo (ULA). Adicione 200 µ l de suspensão de células em cada poço na concentração de 3.000 células/mL para que cada um, bem, tem cerca de 600 células.</li>
		<li>No RT, centrifugar o prato inteiro usando um adaptador de placa para 7 min, logo após a semeadura, a uma velocidade de 350 x g ou menor velocidade disponível. Nota: A centrífuga ajuda a reunir as células para o centro do poço para facilitar formando um esferoide único e uniforme. A etapa de centrifugação é executada apenas uma vez no início para formar os esferoides de tumor. Isso não se repetirá quando esferoides o tumor começarem a crescer.</li>
		<li>Manter a placa multi bem a 37 ° C e 5% CO2 em uma incubadora de cultura e atualizar os meios de cultura a cada 3 dias. Nota: O tempo de crescimento pode variar para condições diferentes de cultura 3D. Em nosso estudo, 3.000 células/mL é usado para ambos U-87 MG e HCT 116 linhas de células em placas de 96 poços, para que o spheroid pode crescer a ~ 500 μm em 4\u20127 dias para células 116 HCT. Considere a adição de suplementos de mídia e fatores de crescimento para os modelos diferentes de esferoide, com base no general protocolo de cultura 3D.</li>
		<li>Realize imagens de OCT de esferoides de tumor em dias de 3\u20124 para um estudo longitudinal do seu crescimento. Nota: Os pontos de tempo recomendado para a imagem latente OCT seria dia 4, dia 7, dia 11, dia 14, dia 18 e dia 21.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. elevado-throughput OCT plataforma de imagem
Nota: Ver referenciado trabalho29,30,31,32,33,34 para uma revisão aprofundada dos princípios e aplicações da OCT. Ver Figura 1 e Huang et al . 42 para obter detalhes da OCT Personalizada sistema utilizado neste estudo de imagem.
<ol><li>Escolha uma fonte de luz banda larga adequada para o sistema da OCT para a imagem latente de esferoide de tumor. Nota: Aqui, um diodo superluminescent (SLD, figura 1A,B) com um comprimento de onda central da ~ 1.320 nm e ~ 110 largura de banda nm foi usada como uma fonte de luz de banda larga.</li>
	<li>Construa a referência braço e braço de amostra do sistema OCT seguindo os esquemas (ver figura 1A,B para obter detalhes). Consulte a Tabela de materiais para obter uma lista de componentes ópticos para construir o sistema OCT. Certifique-se de que o comprimento do percurso óptico do braço de referência e braço de amostra são estreitamente alinhados.</li>
	<li>Construir o espectrômetro, incluindo um colimador, uma grade, uma lente F-theta e uma câmera de varredura de linha (ver Figura 1 para instalação34) para detalhes de design de espectrômetro de outubro como alternativa, selecione um espectrômetro comercial que corresponde a Centro comprimento de onda da fonte de luz. Certifique-se de que o espectrômetro está alinhado corretamente para cobrir a largura de banda inteira do laser, para alcançar a eficiência de coleta de fótons de alta e fornecer lento lavagem-fora do padrão de interferência.</li>
	<li>Caracteriza o desempenho do sistema OCT, incluindo as seguintes métricas tais como poder de braço de amostra, total profundidade profundidade dependente sensibilidade, resolução axial, profundidade de foco e lateral resolução de imagem. Coloque um refletor fraco (por exemplo, um espelho com um filtro de densidade neutra) como uma amostra para medir a profundidade dependente sensibilidade, resolução axial e a profundidade de foco. Coloque um alvo de gráfico de teste de resolução USAF como amostra para verificar a resolução lateral. Nota: Ver referências34,45 para definições de métricas de desempenho da OCT e protocolos para caracterizar essas métricas45. Consulte a tabela 1 para obter uma lista de parâmetros medidos para o sistema de OCT personalizado utilizado em nosso estudo.</li>
	<li>Selecione uma etapa de tradução motorizado para fornecer o movimento horizontal da placa multi bem de esferoides de tumor de imagem em diferentes poços (ver figura 1B). Use um palco com uma gama de viagens maior que 108 x 72 mm para garantir uma varredura completa de todas as cavidades da placa multi bem. Use um estágio da tradução motorizado 2D ou 3D com software de controle para permitir a localização precisa de cada poço e automação do sistema OCT para a imagem latente de alta produtividade.</li>
	<li>Use um adaptador de placa ou projetar um suporte da placa (por impressão 3D) para segurar a placa multi bem em uma posição fixa.</li>
	<li>Corrigi a inclinação e a rotação da placa multi bem usando um 2D inclinando o palco e uma fase de rotação montada no palco translacional (ver Figura 1 D), antes de realizar qualquer OCT de imagens para minimizar a variação do plano de foco de diferentes poços. Use D2 D11, B6, D6, G6 como orientadores poços ao monitorar suas posições relativas nas imagens OCT (figura 1A).</li>
	<li>Ajuste a rotação da placa para garantir que as bordas da placa são paralelas com a direção do movimento do palco para que os poços permanecem na mesma posição horizontal nas imagens OCT (Figura 1E). Ajuste a inclinação da placa para ser paralela à tabela óptica, para que os poços permanecem nos mesmos locais, verticais para PTU de imagem (Figura 1F). Nota: O ajuste do ângulo de inclinação e foco ajudam a otimizar a qualidade de imagem da OCT para todos os poços. No entanto, variações da altura de meios de cultura em diferentes poços podem causar alterações no trajecto óptico que pode levar a desfocagem da imagem esferoide. Foco automático pode ser implementado para controlar o plano focal da OCT imaging para alcançar a qualidade de imagem otimizada. O passo de ajuste não resolver má qualidade de imagem de OCT do spheroid tumor devido as seguintes questões: o descentramento esferoide devido à localização de semeadura inicial; elevação de esferoide quando incorporado em matrizes extracelulares de biofabricated; qualidade de placa pobre com grandes variações da altura de fundos bem. Controle de software adicional, com funções de foco automático ou auto alinhamento pode ser implementada para otimizar o desempenho do sistema de imagem PTU.</li>
	<li>Use um programa de computador personalizado para controlar a aquisição de imagens da OCT e o movimento de palco para coletar dados de cada bem sequencialmente.</li>
</ol>3. out digitalização e processamento de esferoides de Tumor
<ol><li>No dia da imagem de OCT de esferoides de tumor, leve o prato multi bem da incubadora. Transferi a placa multi bem sob a OCT sistema de imagem. Coloque-o em cima do adaptador de placa. Nota: Imagem de OCT de esferoides de tumor pode ser realizada com a tampa de poliestireno placa on ou off. No entanto, a condensação de água na tampa devido a evaporação dos poços pode afetar a transmissão de luz e distorcer o trajeto da luz, rendendo menos imagens OCT ideais dos esferoides.</li>
	<li>Ajuste a altura da placa, movendo ao longo da z-direção da fase de tradução. Manter a posição de plano focal em ~ 100-200 μm abaixo da superfície superior de cada spheroid, para minimizar o efeito do não-uniforme depth-wise perfil focal.</li>
	<li>Defina um OCT digitalização intervalo adequado (por exemplo, 1 x 1 mm) no software personalizado para cobrir o spheroid tumor inteiro de acordo com seus estágios de desenvolvimento. Clique em Salvar parâmetros para salvar a configuração.</li>
	<li>Use o software personalizado para adquirir imagens em 3D OCT de esferoides tumor um por um, para todos os poços da placa contendo esferoides. Clique no botão Preview para ver a imagem de visualização e clique no botão adquirir para adquirir a imagem da OCT. Nota: Certifique-se que os dados de esferoide OCT são coletados quando a fase não está em movimento. O spheroid é geralmente localizado no centro do U-fundo bem. No entanto, o esferoide pode ser deslocada nos meios de cultura quando o palco está acelerando ou desacelerando devido a inércia do spheroid nos meios de cultura.</li>
	<li>Processo 3D OCT datasets de esferoides de tumor para gerar imagens estruturais de OCT com um código personalizado processamento de C++. Ver Figura 2A para um fluxograma de pós-processamento de dados OCT. Nota: Ver Figura 4A para 3D OCT estruturais imagens geradas.<ol>
<li>Consulte o capítulo 5 de Drexler e Fujimoto34 e Jian et al 46 para descrições de detalhes das etapas de pós-processamento de dados OCT. Calibre o tamanho do pixel em todas as três dimensões. Re-dimensione as imagens estruturais OCT em escalas corrigidas. Nota: A distância na direção axial (direção z) de imagens OCT é uma medida da diferença entre o braço de referência e o braço de amostra caminho óptico. Assim, o índice de refração da amostra (n) deve ser tomado em consideração quando calibrar o tamanho do pixel na direção axial reescalar. Em nosso estudo, usamos n = 1.37 como o índice de refração do tumor esferoide42.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gere a colagem de imagens de esferoide usando imagens 2D OCT em três planos XY, XZ e YZ transversais através do centroide do spheroid. Ver Figura 3–E para a saída de representante de colagens de imagens de esferoide. Execute o registro de imagem para todos os esferoides, usando o MATLAB função dftregistration47, para garantir que os centroides de todos o spheroid estão localizados aproximadamente no mesmo local.</li>
	<li>Obter a renderização 3D do spheroid usando um software comercial ou personalizado. Nota: As etapas a seguir mostram como obter a renderização 3D de esferoides tumor usando um software comercial.<ol>
<li>Carrega os dados de OCT 3D no software.</li>
		<li>Clique no painel Surpass . Em seguida, clique em Adicionar novo Volume. Escolha o Blend mode para usar para renderização 3D.</li>
		<li>Ajuste o ângulo de visão, arrastando a imagem usando o ponteiro do mouse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. quantificação morfológica do Tumor 3D esferoides
Nota: Um código personalizado escrito em MATLAB processa esta quantificação. Clique no botão executar para iniciar o processo. Ver Figura 2B para o fluxograma das etapas de quantificação morfológica dos esferoides.
<ol><li>Quantificar os volumes baseado em diâmetro, altura e diâmetro de esferoide.<ol>
<li>Selecione imagens 2D OCT em três planos XY, XZ e YZ transversais que cruzam o centroide do spheroid.</li>
		<li>Medir o diâmetro e a altura do spheroid em planos XY e XZ, respectivamente.</li>
		<li>Cálculo baseado no diâmetro esferoide volume usando: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59020/59020eq1v2.jpg"> , com a presunção da forma esférica do tumor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificar volume de esferoide baseada em voxel.<ol>
<li>Aplica um filtro médio 3D de dados estruturais OCT de esferoide para remover manchas.</li>
		<li>Segmento de esferoides tumor usando o filtro de48 de deteção de borda Canny, quadro a quadro, com um limite adequado, separa a região de esferoide tumor bem fundo.</li>
		<li>Grupo conjuntivo voxels de dados 3D (ver função built-in: bwconncomp).</li>
		<li>Calcule a distância média entre cada voxel conectivo no grupo e o centroide de esferoide (escolhido manualmente), para cada grupo. Identifica a região de esferoide como o grupo com a distância média mínima.</li>
		<li>Contar o número de voxels dentro da região de esferoide e então multiplicar pelo volume real de um voxel individual (volume/voxel), rendendo o volume total do spheroid.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. mortos-célula região deteção de esferoides Tumor 3D
Nota: Em um meio homogêneo, intensidade de dispersão traseira OCT detectada em função da profundidade (eu(z)) pode ser descrita pela lei de Beer-Lambert49: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59020/59020eq2v2.jpg"> , onde z representa a profundidade, μ é a atenuação óptica coeficiente, e 0 a intensidade incidente à amostra. Portanto, o coeficiente de atenuação óptica derivada pode ser expressa como: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59020/59020eq3v2.jpg"> . Desde imagens OCT frequentemente são plotadas em uma escala logarítmica, a inclinação do perfil OCT intensidade pode ser recuperada para derivar o coeficiente de atenuação óptica. Consulte a Figura 2 para um fluxograma da geração de mapas de atenuação óptica.
<ol><li>Realize segmentação para remover regiões indesejadas fora o spheroid. Execute 3D filtro médio para suprimir o ruído speckle inerente em imagens da OCT.</li>
	<li>Obter pixel-wise coeficientes de atenuação óptica por linear encaixe o perfil de intensidade-escala logarítmica OCT durante um determinado intervalo de profundidade (janela em movimento), extrair sua encosta e multiplique a inclinação por -1/2. Nota: O coeficiente de atenuação em cada voxel dentro da região segmentada esferoide é calculado com base na encosta do perfil de intensidade OCT em uma janela de profundidade de 10-voxel (~ 40 μm em profundidade), com o voxel localizado no meio da janela.</li>
	<li>Aplica os métodos acima (etapas 5.1 e 5.2) a cada varredura axial em um frame e cada frame em um conjunto de dados 3D contendo região segmentada esferoide até calculam-se os coeficientes de atenuação óptica para todos os voxels da região segmentada esferoide.</li>
	<li>Execute a binária limiarização para destacar a região de alta atenuação. Nota: Ver Huang et al. 42 para a determinação do limiar da região alta-atenuação usando análise de histograma.</li>
	<li>Destaca-se o mapa de atenuação óptica binarized na imagem original para rotular a região mortos-célula (mistura). Gere a imagem em 3D-rendered do mapa para visualizar a distribuição 3D da região mortos-célula atenuação misturado.</li>
</ol>6. histologia e imunohistoquímica
Nota: Histologia e imunohistoquímica (IHC) manchado imagens de esferoides de tumor são obtidos para correlacionar com os resultados correspondentes da OCT.
<ol><li>Nos pontos de tempo selecionado, selecione esferoides de tumor de 1-2 da placa de multi bem para histologia e IHC coloração. Use uma pipeta com as pontas de pipeta de 1 mL para transferir o spheroid do poço para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Nota: Corte a ponta da pipeta de 1 mL antes da transferência para garantir que a abertura da ponta é maior que o tamanho do spheroid do tumor para não danificar a estrutura do spheroid.</li>
	<li>Recolha cada esferoide de tumor em um tubo de microcentrifuga único 1,5 mL cheio com formol 10% e correção para 48 h.</li>
	<li>Execute os processos IHC e histologia para cada esferoide, usando padrão parafina incorporando técnicas. Nota: Mancha 5 μm espessas seções de esferoides de tumor por hematoxilina e eosina (H &amp; E) e terminal deoxynucleotidyl transferase do dUTP nick fim rotulando a deteção de apoptosis (TUNEL). Um counterstaining de hematoxilina é aplicado ao TUNEL. Um scanner de slides digital foi usado para digitalizar a amostra manchada e obter alta resolução histológica e imagens IHC.</li>
</ol>

Os autores não divulgar nenhum interesse de concorrente.

Atividade de tumor é altamente relevante para sua estrutura morfológica. Semelhante à curva de crescimento característica de culturas celulares 2D de monitoramento, acompanhamento da curva de crescimento de esferoides tumor 3D é também uma abordagem convencional para caracterizar o comportamento de crescimento a longo prazo do esferoide para linhas celulares diferentes. Notavelmente, nós pode caracterizar a resposta de drogas através da análise de degradação de tumor ou tumor regrowth reflectida diretamente na curva de c...

Câncer é a segunda principal causa de morte no mundo1. Desenvolvimento de medicamentos, alvejando câncer é de importância crucial para os pacientes. No entanto, estima-se que mais de 90% das novas drogas anti-câncer falhar na fase de desenvolvimento devido à falta de eficácia e toxicidade inesperada em ensaios clínicos2. Parte do motivo pode ser atribuída ao uso de modelos de cultura simples bidimensional (2D) célula para triagem composta, que fornecem resultados com valores preditivos limitados de compostos eficácia e toxicidade para as fases seguintes da droga descoberta2 , 3 , 4. recentemente, foram desenvolvidos modelos de esferoide tridimensional (3D) tumor para fornecer dados fisiológicos e farmacológicos clinicamente relevantes para drogas anti-câncer descoberta3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Desde que esses esferoides podem imitar propriedades específicas do tecido de tumores no vivo, como nutrientes e oxigênio núcleo gradiente, hipóxico, bem como drogas resistência19, o uso desses modelos pode potencialmente encurtar cronogramas de descoberta de drogas, reduzir os custos de investimento e trazer novos medicamentos para pacientes mais efetivamente. Uma abordagem crítica para avaliar composta eficácia no desenvolvimento de tumor 3D esferoide é monitorar o crescimento de esferoide e recorrência sob tratamentos9,26. Para fazer isso, caracterizações quantitativas da morfologia do tumor, envolvendo o seu diâmetro e volume, com modalidades de imagem de alta resolução, são imperativas.
Modalidades de imagem convencionais, como campo claro, contraste fase7,9,22,de24e fluorescência microscopia8,9,16, 18,22 pode fornecer uma medida do diâmetro do spheroid, mas não é possível resolver a estrutura geral do spheroid em espaço 3D. Muitos fatores contribuem para essas limitações, incluindo penetração da luz sondagem no spheroid; difusão dos corantes fluorescentes para o spheroid; emitindo sinais fluorescentes de corantes fluorescentes animados no interior ou na superfície oposta do spheroid devido à forte absorção e espalhamento; e profundidade-resolução destas modalidades de imagem. Isto conduz frequentemente a uma medida de volume imprecisas. Desenvolvimento do núcleo necrótico em esferoides imita necrose na vivo tumores6,10,15,19,25. Esta característica patológica é improvável reproduzida na célula 2D culturas19,25,,27,28. Com um tamanho de esferoide superior a 500 µm de diâmetro, uma estrutura de três camadas concêntrica, incluindo uma camada exterior de pilhas proliferating, uma camada intermediária de células quiescentes e um núcleo necrótico, pode ser observado no esferoide6,10 ,15,19,25, devido à falta de oxigênio e nutrientes. Imagem latente da fluorescência de pilha de vivo e morto é a abordagem padrão para rotular o limite do núcleo necrótico. No entanto, outra vez, Penetrações tanto destes corantes fluorescentes e luz visível impedem o potencial para sondar sobre o núcleo necrótico para monitorar seu desenvolvimento em sua forma real.
Uma modalidade de imagem de 3D alternativa, tomografia de coerência óptica (OCT) é introduzida para caracterizar os esferoides de tumor. OCT é uma técnica de imagem biomédica que é capaz de adquirir dados 3D etiqueta-livre, não-destrutiva de até 1-2 mm de profundidade em tecidos biológicos29,30,31,32,33 ,34. OCT emprega interferometria de baixa coerência para detectar sinais espalhados por trás de diferentes profundidades da amostra e fornece imagens reconstruídas profundidade-resolvido em nível de mícron resoluções espaciais nas direções laterais e verticais. OCT foi adotado extensamente em oftalmologia35,36,37 e angiografia38,39. Estudos anteriores têm usado a OCT para observar a morfologia do in vitro esferoides de tumor na matriz da membrana basal (por exemplo, Matrigel) e avaliar suas respostas a terapia fotodinâmica40,41. Recentemente, nosso grupo estabeleceu uma plataforma de imagem da OCT do elevado-throughput para sistematicamente monitorar e quantificar a cinética de crescimento de esferoides tumor 3D em placas multi bem42. Precisa quantificação volumétrica de esferoides tumor 3D usando um voxel contando a abordagem e deteção de tecido necrótico rótulo livre nos esferoides baseado no contraste intrínseco atenuação óptica foram demonstradas. Este artigo descreve os detalhes de como a plataforma de imagem OCT foi construída e utilizada para obter imagens 3D de alta resolução de esferoides de tumor. Os passo a passo análises quantitativas da cinética de crescimento de esferoides tumor 3D, incluindo medições precisas de diâmetro esferoide e volumes, é descrita. Além disso, o método da detecção não-destrutiva de regiões do tecido necrosado usando a OCT, baseado no contraste a atenuação óptica intrínseca é apresentado.

<table><tbody><tr><td><forte>Sistema de imagem OCT de domínio espectral personalizado</forte></td><td></td><td></td><td>Desenvolvido em nosso laboratório</td></tr><tr><td>Diodo superluminescente (SLD)</td><td><forte>Thorlabs</forte></td><td><forte>SLD1325</forte>fonte de</td> <td>luz</td></tr><tr><td>2 vezes; 2 acopladores de fibra fundida de modo único, taxa de divisão de 50:50</td><td>AC Photonics</td><td>WP13500202B201</td><td></td></tr><tr><td>Reference Arm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lens Tube</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adapter</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collimating Lens</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-020-C</td><td></td></tr><tr><td>Lente de focagem</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Montagem de espelho cinemático</td><td>Thorlabs Espelho Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1D Estágio Translacional</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de densidade neutra contínua</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poste Pedestrial</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Garfo de fixação</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sample Arm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lens Tube</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adaptador</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collimating Lens</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-020-C</td><td></td></tr><tr><td>Galvanômetro</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Relay Lens</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-C</td><td>duas lentes de relé para fazer uma configuração de telescópio</td></tr><tr><td>Triângulo Espelho Montagem</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espelho</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetivo</td><td>Mitutoyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pedestrial Post</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Garfo de Fixação</td><td>Thorlabs Controlador de Polarização Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30mm Montagem em Gaiola</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaiola Rod</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D motorizado estágio de tradução</td><td>Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>JTH360XY</tr> Suporte de placa <tr><td></td> de estágio <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de rotação de estágio</td><td></td><td></td><td></td>de inclinação</tr><tr><td></td><td>2D impresso em 3D</td> < forte > espectrômetro< / forte > tubo de lente Adaptador Thorlabs Lente colimadora Thorlabs <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td>Lente de grade <td>Thorlabs</td><td>AC080-020-C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>G</td><td></td><td>= 1145 lpmm</td></tr><tr><td>F-theta</td><td>Thorlabs</td><td>FTH-1064-100</td><td></td></tr><tr><td>InGaAs Sensor de câmera de varredura de linha</td><td>Unlimited</td><td>SU1024-LDH2</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número do catálogo</td><td> Comentários</td></tr><tr><td>Componente de cultura celular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCT 116 Linha celular</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura celular</td><td>SPL Life Sciences</td><td>70025</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Fisherbrand</td><td>14388100</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>10340</td><td></td></tr><tr><td>Gibco GlutaMax DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino, certificado, origem americana</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Corning Microplaca de Fixação Ultrabaixa de Fundo Redondo Transparente de 96 poços</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Tripsina-EDTA (0,5%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Forma Série II 3110 Incubadoras de CO2 com camisa de água</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120</td><td></td></tr><tr><td>Luvas</td><td>VWR</td><td>89428-750</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Globe Scientific</td><td>138080</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5702 R</td><td>Para centrifugar o tubo de 15 mL</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>NUAIRE</td><td>AWEL CF 48-R</td><td>Para centrifugar o microscópio de placas de 96 poços</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Histologia & IHC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanner de lâminas digital</td><td>Leica</td><td>Aperio AT2</td><td>Obter imagens histológicas de alta resolução</td></tr><tr><td>Serviço</td> de <td>Histologia Histowiz</td><td></td><td>Solicitar serviço para coloração histológica e imuno-histológica de esferoides tumorais</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Lista de PTU Comerciais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SD-OCT system</td><td>Thorlabs</td><td>Telesto Series</td><td></td></tr><tr><td>SD-OCT system</td><td>Wasatch Photonics</td><td>WP OCT 1300 nm</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software para análise de dados</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basic Image Analysis</td><td>NIH</td><td></td><td>ImageJ Fiji também funciona.</td></tr><tr><td>Renderização 3D</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Amira</td><td>Software comercial. Opção 1</td></tr><tr><td>Renderização 3D</td><td>Bitplane</td><td>Imaris</td><td>Software comercial. Opção 2. Utilizado no protocolo</td></tr><tr><td>OCT software</td><td></td><td></td><td>de aquisição desenvolvido sob medida em C++.</td></tr><tr><td>Controle de palco</td><td>Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.</td><td>MRC_3</td><td>Incorporado ao código de aquisição de OCT personalizado</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> de processamento de OCT <td>desenvolvido em C++. Utilize GPU. Incorporado ao código de aquisição personalizado da OCT.</td></tr><tr><td>Análise Morfológica e Fisiológica</td><td></td><td></td><td>desenvolvida sob medida no MATLAB</td></tr></tbody></table>

longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Esferoides de tumor foram desenvolvidas como um modelo de cultura tridimensional (3D) célula na descoberta de medicamentos de investigação e anti-câncer de câncer. No entanto, atualmente, elevado-throughput modalidades de imagem utilizando a deteção de campo ou fluorescência brilhante, são incapazes de resolver a estrutura geral 3D do spheroid tumor devido à limitada penetração de luz, difusão de corantes fluorescentes e profundidade-resolução. Recentemente, nosso laboratório demonstrou o uso de tomografia de coerência óptica (OCT), um rótulo livre e não-destrutiva de imagem 3D modalidade, para realizar a caracterização longitudinal de esferoides multicelulares tumor em uma placa de 96 poços. OCT foi capaz de obter informações morfológicas e fisiológicas 3D de esferoides de tumor que cresce até cerca de 600 µm de altura. Neste artigo, vamos demonstrar um sistema de imageamento de OCT (HT-OCT) de alto rendimento que verifica a placa toda multi bem e obtém os dados 3D OCT de esferoides tumor automaticamente. Descrevemos os detalhes das orientações de construção e sistema de HT-OCT no protocolo. A partir dos dados de OCT 3D, se pode visualizar a estrutura geral do spheroid com 3D renderizados e fatias ortogonais, caracterizar a curva de crescimento longitudinal do spheroid tumor baseado na informação morfológica de tamanho e volume e monitorar o crescimento de as regiões de mortos-célula no spheroid tumor baseado no contraste óptico atenuação intrínseca. Mostramos que, HT-OCT pode ser usado como uma modalidade de imagem de alto rendimento para droga triagem, bem como a caracterização de amostras de biofabricated.

Imagem de tomografia computadorizada coerência óptica alto Throughput de esferoides em uma placa de 96 poços
A Figura 3 exibe o resultado de HT-OCT digitalização de uma placa de 96 poços com 116 HCT esferoides de tumor no dia 3. A varredura sequencial da placa inteira começa a partir do poço do canto inferior direito (H12). Figura 3B mostra o fluxograma da implementação do...

Tomografia de coerência óptica (OCT), uma tecnologia de imagem tridimensional, foi usada para monitorar e caracterizar a cinética de crescimento de esferoides tumor multicelulares. Precisa quantificação volumétrica de esferoides tumor usando um voxel contando a abordagem e deteção de tecido livre de rótulo morto nos esferoides baseado no contraste intrínseco atenuação óptica, foram demonstradas.

Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Esferoides de tumor tridimensionais podem imitar propriedades específicas de tecidos de tumores in vivo, fornecendo dados mais clinicamente relevantes para a descoberta de medicamentos anticâncológicos do que a simples cultura celular 2D. Nossa técnica de imagem, tomografia de coerência óptica, pode facilmente visualizar a estrutura 3D de um único nervo tumoroso, com um tamanho de várias centenas de mícrons, e fornecer uma caracterização mais precisa de sua morfologia e infestação de trabalho, muitas vezes em poucos segundos. Usando o modelo esférico 3D, podemos potencialmente encurtar o cronograma de descoberta de medicamentos, reduzir o custo e trazer novos medicamentos aos pacientes de forma mais eficaz.Formar a forma esférica do aglomerado tumoral é um passo crítico em nosso experimento. É importante escolher a placa de fixação ultra-baixa direita com o fundo redondo, e a velocidade de centrifugação adequada após a semeadura celular. Inicie este experimento cultivando células interessantes em um frasco de cultura como descrito no manuscrito.Mantenha as células em uma incubadora em condições padrão e monitore seu estado de saúde todos os dias. Atualize a mídia conforme necessário. Para executar a cultura celular 3D em placas multi-poço, primeiro remova o meio do frasco de cultura celular, e lave as células com PBS pré-aquecido de 33 graus Celsius.Em seguida, adicione um mililitro de Trypsin-EDTA para resuspencar as células e incubar por três minutos a 37 graus Celsius. Adicione três mililitros de cultura para diluir o Trypsin. Transfira esta suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 500G e temperatura ambiente por cinco minutos.Em seguida, remova o supernaspe e resuspenque a pelota celular com quatro mililitros de meio de cultura pré-aquecido. Para determinar a concentração celular, hypat uma gota de amostra em um hemócito, e contar as células. Diluir à concentração de semeadura desejada.Semente 200 microliters de suspensão celular em cada poço de um acessório ultra-baixo, placa multi-bem de fundo redondo, a uma concentração de 3.000 células por mililitro, para alcançar cerca de 600 células por poço. Imediatamente após a semeadura, centrifufique toda a placa na menor velocidade disponível, em temperatura ambiente, por sete minutos. Coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius e 5%CO2, certificando-se de refrescar o meio a cada três dias.Primeiro, construa o braço de referência e o braço amostral do sistema OCT, seguindo os esquemas deste manuscrito. Em seguida, construa o espectrômetro, incluindo um quilômetro, uma classificação, uma lente F-Theta e uma câmera de varredura de linha. Use um adaptador de placa para segurar a placa multi-bem em uma posição fixa.Antes da imagem, corrija a inclinação e a rotação da placa multi-poço usando um estágio de inclinação 2D, e um estágio de rotação montado no estágio de transição para minimizar a variação do plano focal de diferentes poços. Em seguida, ajuste a rotação para garantir que as bordas da placa estejam paralelas à direção do movimento do palco, de modo que os poços permaneçam nas mesmas posições horizontais nas imagens DE OUTUBRO. Em seguida, ajuste o estágio de inclinação para garantir que a placa esteja paralela à tabela óptica, de modo que os poços permaneçam nos mesmos locais verticais para a imagem.No dia da imagem dos esferoides tumorais, remova a placa multi-bem da incubadora. Transfira-o sob o sistema de imagem OCT e coloque-o no adaptador de placa. Para ajustar a altura da placa, mova-a ao longo da direção Z do estágio de tradução.No software de imagem personalizado, defina uma faixa de varredura oct desejada para cobrir todo o esferide do tumor, dependendo de seus estágios de desenvolvimento, e clique em salvar parâmetros para salvar a configuração. Em seguida, mostre as visualizações otimizadas de XZ e YZ OCT de esferoides tumorais. Adquira imagens 3D OCT de esferoides tumorais um a um para todos os poços da placa contendo esferoides.Para ver a imagem de visualização, clique no botão de visualização. E para adquirir a imagem OCT, clique no botão adquirir. Registo o processo global de movimentação de etapas da aquisição de dados oct.Para garantir a qualidade ideal da imagem para todos os esferoides tumorais, o adaptador de placa precisa ser ajustado com precisão e o volume médio precisa ser o mesmo. Use um código de processamento C+personalizado para processar conjuntos de dados 3D OCT de esferoides tumorais para gerar imagens estruturais oct. Use imagens 2D OCT em três planos transversais, XY, XZ e YZ através do centroide do esferoide para gerar a colagem de imagens esferoides.Para obter renderização 3D do esferoide usando um software desejado, primeiro carregue os dados SD OCT no software. Clique no painel de superação e, em seguida, adicione novo volume e escolha o modo de mistura para usar para renderização 3D. Para ajustar o ângulo de visão, use o ponteiro do mouse para arrastar a imagem e proceder com quantificação conforme descrito no manuscrito.Uma colagem de imagens OCT não inquietas de esferoides de linha celular HCT116 foi gerada a partir dos dados processados, com resultados comparáveis com imagens de outros sistemas de imagem de alto rendimento 2D. Além disso, a colagem de imagens esferoides transversais 2D de 96 poços foi gerada para monitorar alturas esferoides e visualizar a inhomogeneidade esferoide na direção vertical. Uma colagem de imagens esferoides renderizadas em 3D pode ser gerada a partir de qualquer ângulo pré-definido para visualizar a forma 3D geral e avaliar a arredondamento do esferoide.Após o pós-processamento geral de OUTUBRO, foram obtidas imagens estruturais de 3D OCT de um esferoide tumoral. A partir dos dados oct, um post de superfície 3D e fatias ortogonais XZ, YZ e XY foram geradas para visualizar a estrutura do esferoide tumoral em qualquer direção. O monitoramento longitudinal de um único esferoide tumoral foi realizado para caracterizar seu diâmetro, altura e volume à base de voxel, gerando as curvas de crescimento em tamanho e volume durante os 21 dias de desenvolvimento.Aqui, o esferoide foi interrompido no dia 11, e entrou em colapso no dia 21. O rastreamento longitudinal mostrou o aumento das áreas de células mortas no esferoide tumoral. Imagens renderizadas em 3D do esferoide tumoral mostraram o aparecimento e o crescimento de regiões de células mortas do sétimo ao dia 14, como mostra o aumento das áreas necrosadas destacadas vermelhas.À medida que a porcentagem das áreas necróticas aumentava, o esferoide tumoral não conseguia manter sua forma perfeita e, portanto, colapsou. Com esta plataforma de imagem podemos explorar ainda mais outros modelos complexos da esfera tumoral, como modelo de imagem 3D, modelo de criatura vasta e modelos de co-cultura para simular melhor tumores in vivo. Nosso sistema de imagem OCT de alta throughput pode fornecer uma abordagem alterativa para o rastreamento de drogas na descoberta de drogas contra o câncer.Isso também é algo caracterizado, amostras biofabricadas 3D para várias aplicações biomédicas.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Longo prazo Cultura de Amostras de mama Humano do Câncer e sua análise por meio de tomografia óptica de Projeção

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/59020/longitudinal-morphological-physiological-monitoring-three-dimensional'&gt;Huang, Y. et. al., Monitoramento morfológico e fisiológico longitudinal de esferoides tumorais tridimensionais usando tomografia de coerência óptica. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o uso da tomografia de coerência óptica (OCT) para monitorar esferoides tumorais em uma placa de vários poços, capturando imagens transversais de alta...

Monitoramento morfológico e fisiológico de esferoides tumorais por meio de tomografia de coerência óptica 

-Tracking microrheology partícula pode ser usada para quantificar de forma não destrutiva e espacialmente mapear as alterações nas propriedades mecânicas da matriz extracelular em modelos de tumor em 3D.

Medição Longitudinal de Matriz Extracelular Rigidez em 3D tumorais modelos com o uso de rastreamento de partículas Microrheology

Nós apresentamos uma aplicação de alto rendimento software de análise de imagens para medir o tamanho de esferóides tumorais tridimensionais fotografada com microscopia de campo claro. Esta aplicação fornece uma maneira rápida e eficaz para examinar os efeitos de drogas terapêuticas em esferóides, o que é benéfico para os pesquisadores que desejam usar esferóides em telas de drogas.

De alta capacidade Análise de Imagem de esferóides tumorais: uma aplicação de software de fácil utilização para medir o tamanho de esferóides automaticamente e com precisão

A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Aqui, descrevemos o uso da tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) para visualizar estruturas retinianas e oculares in vivo em modelos de degeneração da retina, glaucoma, retinopatia diabética e miopia.

Avaliações estruturais in vivo de doenças oculares em modelos de roedores utilizando tomografia de coerência óptica

Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de um dispositivo de imagem esferoide. Este dispositivo permite imagens de fluorescência dinâmica ou longitudinal de esferoides de células cancerosas. O protocolo também oferece um simples procedimento de processamento de imagem para a análise da invasão de células cancerosas.

Imagem e análise de fluorescência resolvidas no modelo 3D spheroid

O presente protocolo desenvolve uma técnica baseada em imagem para a densidade celular regional rápida, não destrutiva e livre de rótulos e a medição da viabilidade dentro dos agregados tumorais 3D. Os achados revelaram um gradiente de densidade celular, com densidades celulares mais altas em regiões centrais do que camadas externas no desenvolvimento de agregados e morte celular predominantemente periférica em agregados HER2+ tratados com Trastuzumab.

Avaliação não destrutiva da densidade celular regional dentro dos agregados tumorais após o tratamento medicamentoso

Os esferoides tumorais estão se tornando cada vez mais utilizados para avaliar as interações de microambientes de células tumorais e a resposta terapêutica. O presente protocolo descreve um método robusto, mas simples, para imagens semi-de alta produtividade de esferoides tumorais 3D usando limpeza óptica rápida.

Limpeza óptica rápida para análise semi-de alto rendimento de esferoides tumorais

Este artigo demonstra um método padronizado para a construção de esferoides tumorais tridimensionais. Uma estratégia para observação esferoide e análise de aprendizagem profunda baseada em imagens usando um sistema de imagem automatizado também é descrita.

Geração de esferoides tumorais 3D para estudos de avaliação de fármacos

A tradução dos achados da microscopia intravital é desafiada por sua penetração em profundidade rasa no tecido. Aqui, descrevemos um modelo de camundongo com câmara de janela dorsal que permite o co-registro de microscopia intravital e modalidades de imagem clinicamente aplicáveis (por exemplo, TC, RM) para correlação espacial direta, potencialmente simplificando a tradução clínica dos achados da microscopia intravital.

Um modelo de camundongo tumoral de câmara de janela de dobra cutânea dorsal para microscopia intravital combinada e ressonância magnética na pesquisa translacional do câncer

Aprenda a monitorar esferoides tumorais tridimensionais usando tomografia de coerência óptica para quantificação volumétrica e detecção de tecido necrótico sem marcadores. Este método acelera a descoberta de fármacos anticâncer.

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Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

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