Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Esferoides de tumor tridimensionais podem imitar propriedades específicas de tecidos de tumores in vivo, fornecendo dados mais clinicamente relevantes para a descoberta de medicamentos anticâncológicos do que a simples cultura celular 2D. Nossa técnica de imagem, tomografia de coerência óptica, pode facilmente visualizar a estrutura 3D de um único nervo tumoroso, com um tamanho de várias centenas de mícrons, e fornecer uma caracterização mais precisa de sua morfologia e infestação de trabalho, muitas vezes em poucos segundos. Usando o modelo esférico 3D, podemos potencialmente encurtar o cronograma de descoberta de medicamentos, reduzir o custo e trazer novos medicamentos aos pacientes de forma mais eficaz.

Formar a forma esférica do aglomerado tumoral é um passo crítico em nosso experimento. É importante escolher a placa de fixação ultra-baixa direita com o fundo redondo, e a velocidade de centrifugação adequada após a semeadura celular. Inicie este experimento cultivando células interessantes em um frasco de cultura como descrito no manuscrito.

Mantenha as células em uma incubadora em condições padrão e monitore seu estado de saúde todos os dias. Atualize a mídia conforme necessário. Para executar a cultura celular 3D em placas multi-poço, primeiro remova o meio do frasco de cultura celular, e lave as células com PBS pré-aquecido de 33 graus Celsius.

Em seguida, adicione um mililitro de Trypsin-EDTA para resuspencar as células e incubar por três minutos a 37 graus Celsius. Adicione três mililitros de cultura para diluir o Trypsin. Transfira esta suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 500G e temperatura ambiente por cinco minutos.

Em seguida, remova o supernaspe e resuspenque a pelota celular com quatro mililitros de meio de cultura pré-aquecido. Para determinar a concentração celular, hypat uma gota de amostra em um hemócito, e contar as células. Diluir à concentração de semeadura desejada.

Semente 200 microliters de suspensão celular em cada poço de um acessório ultra-baixo, placa multi-bem de fundo redondo, a uma concentração de 3.000 células por mililitro, para alcançar cerca de 600 células por poço. Imediatamente após a semeadura, centrifufique toda a placa na menor velocidade disponível, em temperatura ambiente, por sete minutos. Coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius e 5%CO2, certificando-se de refrescar o meio a cada três dias.

Primeiro, construa o braço de referência e o braço amostral do sistema OCT, seguindo os esquemas deste manuscrito. Em seguida, construa o espectrômetro, incluindo um quilômetro, uma classificação, uma lente F-Theta e uma câmera de varredura de linha. Use um adaptador de placa para segurar a placa multi-bem em uma posição fixa.

Antes da imagem, corrija a inclinação e a rotação da placa multi-poço usando um estágio de inclinação 2D, e um estágio de rotação montado no estágio de transição para minimizar a variação do plano focal de diferentes poços. Em seguida, ajuste a rotação para garantir que as bordas da placa estejam paralelas à direção do movimento do palco, de modo que os poços permaneçam nas mesmas posições horizontais nas imagens DE OUTUBRO. Em seguida, ajuste o estágio de inclinação para garantir que a placa esteja paralela à tabela óptica, de modo que os poços permaneçam nos mesmos locais verticais para a imagem.

No dia da imagem dos esferoides tumorais, remova a placa multi-bem da incubadora. Transfira-o sob o sistema de imagem OCT e coloque-o no adaptador de placa. Para ajustar a altura da placa, mova-a ao longo da direção Z do estágio de tradução.

No software de imagem personalizado, defina uma faixa de varredura oct desejada para cobrir todo o esferide do tumor, dependendo de seus estágios de desenvolvimento, e clique em salvar parâmetros para salvar a configuração. Em seguida, mostre as visualizações otimizadas de XZ e YZ OCT de esferoides tumorais. Adquira imagens 3D OCT de esferoides tumorais um a um para todos os poços da placa contendo esferoides.

Para ver a imagem de visualização, clique no botão de visualização. E para adquirir a imagem OCT, clique no botão adquirir. Registo o processo global de movimentação de etapas da aquisição de dados oct.

Para garantir a qualidade ideal da imagem para todos os esferoides tumorais, o adaptador de placa precisa ser ajustado com precisão e o volume médio precisa ser o mesmo. Use um código de processamento C+personalizado para processar conjuntos de dados 3D OCT de esferoides tumorais para gerar imagens estruturais oct. Use imagens 2D OCT em três planos transversais, XY, XZ e YZ através do centroide do esferoide para gerar a colagem de imagens esferoides.

Para obter renderização 3D do esferoide usando um software desejado, primeiro carregue os dados SD OCT no software. Clique no painel de superação e, em seguida, adicione novo volume e escolha o modo de mistura para usar para renderização 3D. Para ajustar o ângulo de visão, use o ponteiro do mouse para arrastar a imagem e proceder com quantificação conforme descrito no manuscrito.

Uma colagem de imagens OCT não inquietas de esferoides de linha celular HCT116 foi gerada a partir dos dados processados, com resultados comparáveis com imagens de outros sistemas de imagem de alto rendimento 2D. Além disso, a colagem de imagens esferoides transversais 2D de 96 poços foi gerada para monitorar alturas esferoides e visualizar a inhomogeneidade esferoide na direção vertical. Uma colagem de imagens esferoides renderizadas em 3D pode ser gerada a partir de qualquer ângulo pré-definido para visualizar a forma 3D geral e avaliar a arredondamento do esferoide.

Após o pós-processamento geral de OUTUBRO, foram obtidas imagens estruturais de 3D OCT de um esferoide tumoral. A partir dos dados oct, um post de superfície 3D e fatias ortogonais XZ, YZ e XY foram geradas para visualizar a estrutura do esferoide tumoral em qualquer direção. O monitoramento longitudinal de um único esferoide tumoral foi realizado para caracterizar seu diâmetro, altura e volume à base de voxel, gerando as curvas de crescimento em tamanho e volume durante os 21 dias de desenvolvimento.

Aqui, o esferoide foi interrompido no dia 11, e entrou em colapso no dia 21. O rastreamento longitudinal mostrou o aumento das áreas de células mortas no esferoide tumoral. Imagens renderizadas em 3D do esferoide tumoral mostraram o aparecimento e o crescimento de regiões de células mortas do sétimo ao dia 14, como mostra o aumento das áreas necrosadas destacadas vermelhas.

À medida que a porcentagem das áreas necróticas aumentava, o esferoide tumoral não conseguia manter sua forma perfeita e, portanto, colapsou. Com esta plataforma de imagem podemos explorar ainda mais outros modelos complexos da esfera tumoral, como modelo de imagem 3D, modelo de criatura vasta e modelos de co-cultura para simular melhor tumores in vivo. Nosso sistema de imagem OCT de alta throughput pode fornecer uma abordagem alterativa para o rastreamento de drogas na descoberta de drogas contra o câncer.

Isso também é algo caracterizado, amostras biofabricadas 3D para várias aplicações biomédicas.