Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade
18 de janeiro de 2019
Aqui, apresentamos um protocolo para isolar a membrana plasmática, citoplasma e mitocôndrias de células U937 sem o uso de centrifugação de alta velocidade. Esta técnica pode ser usada para purificar as fracções subcelulares para posterior exame de localização de proteínas através de immunoblotting.
Este protocolo permite que os pesquisadores obtenham frações distintas de uma célula sem o uso de equipamentos especializados, reagentes caros ou técnicas complexas. A principal vantagem deste protocolo é a simplicidade das técnicas que o tornam modificável e fácil de executar. Demonstrando o procedimento serão Matt Deragon, Rob Haluska e Alexa Hodges.três estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Para começar a centrifugar a suspensão celular preparada para criar uma pelota. Remova o supernatante e suspenda a pelota em temperatura ambiente PBS. Centrifugar a suspensão da célula a 400 xg por dez minutos. Em seguida, remova o supernasciente e suspenda novamente a pelota da célula no tampão gelado. Prepare o buffer Uma solução de acordo com o protocolo de texto. Centrifugar a suspensão da célula a 400 xg por dez minutos e remover o supernatante. Suspenda a pelota no buffer Uma solução para uma concentração final de 200 milhões de células por ml, e pipeta suavemente para quebrar qualquer aglomerado. Depois disso, incubar a suspensão da célula em uma rotadora final em 4
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para o isolamento da membrana plasmática, citoplasma e mitocôndrias de células U937 sem o uso de centrifugação de alta velocidade. A técnica permite a purificação de frações subcelulares para estudos de localização proteica por meio de imunoblotagem.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Bioquímica
- Neurociência
Antecedentes
- As células U937 são um modelo para estudar a função de monócitos humanos.
- O isolamento de componentes subcelulares é crucial para compreender os processos celulares.
- Métodos tradicionais frequentemente envolvem centrifugação em alta velocidade, o que pode ser agressivo para as células.
- Este protocolo tem como objetivo fornecer uma alternativa mais suave para a fracionamento subcelular.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para o isolamento de componentes celulares sem a utilização de centrifugação de alta velocidade.
- Permitir a análise subsequente da localização de proteínas.
- Aprimorar a compreensão dos mecanismos celulares em células U937.
Métodos Utilizados
- Isolamento de membrana plasmática, citoplasma e mitocôndrias.
- Uso de reagentes específicos para facilitar a fracionamento celular.
- Imunoblotting para análise de localização proteica.
- Comparação dos resultados com métodos tradicionais.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de frações subcelulares sem centrifugação de alta velocidade.
- Visualização clara da localização proteica por meio de imunoblotagem.
- Eficiência e suavidade demonstradas do novo protocolo.
- Potencial para aplicações mais amplas na pesquisa em biologia celular.
Conclusões
- O novo protocolo é eficaz para o isolamento de componentes celulares U937.
- Ele fornece uma alternativa viável aos métodos tradicionais.
- Estudos futuros podem utilizar esta técnica para diversas análises celulares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a fracionamento subcelular econômico de células U937 sem centrifugação de alta velocidade, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Ao isolar frações citoplasmáticas, mitocondriais e de membrana plasmática utilizando reagentes e equipamentos acessíveis, facilita estudos de localização proteica essenciais para a elucidação de vias e o desenvolvimento de ensaios. A abordagem reduz a dependência de infraestrutura especializada, aumentando a escalabilidade e reprodutibilidade em fluxos de trabalho de avaliação pré-clínica de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da localização subcelular de proteínas em um modelo de monócito humano relevante para imunologia e inflamação.
- Valor Operacional: Oferece uma alternativa mais suave à ultracentrifugação, preservando a integridade das proteínas e a formação de complexos para avaliação funcional de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer o envolvimento de vias e a sinalização específica por compartimento em células relevantes para doenças.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão para ensaio: Gera frações subcelulares purificadas adequadas para ensaios baseados em imunoblotting para avaliar o engajamento ou modulação do alvo.
- Reprodutibilidade: Utiliza condições padronizadas de tampão e etapas de centrifugação diferencial para garantir uma fracionamento consistente entre experimentos.
- Escalabilidade: O protocolo pode ser ajustado para acomodar diferentes números de células, permitindo preparações para triagem em média escala.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: As células U937 modelam a função de monócitos humanos, permitindo a exploração translacional de biomarcadores em contextos de doenças inflamatórias e infecciosas.
- Continuidade Pré-clínica: As frações isoladas apoiam a validação subsequente da localização do alvo e do mecanismo de ação antes de estudos in vivo.
- Avanço com Ajuste de Risco: Facilita a redução precoce de riscos dos alvos ao confirmar a acessibilidade subcelular e o potencial de interação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial da descoberta, apoiando a validação de alvos por meio da fracionamento bioquímico antes de avançar para o desenvolvimento de ensaios e avaliação pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses por meio da fracionamento subcelular para esclarecer a localização do alvo e o envolvimento em vias celulares em células U937.
- Triagem: Produz frações padronizadas de citoplasma, mitocôndrias e membrana para ensaios confiáveis de validação de alvos baseados em imunoblotagem.
- Análises: Gera dados quantitativos sobre a localização proteica por meio de imunoblotagem, permitindo a comparação da distribuição do alvo entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Apoia o alinhamento de biomarcadores ao confirmar a presença do alvo em compartimentos subcelulares relevantes para doenças em um modelo humano de monócitos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade de fracionamento reutilizável e de baixo custo, aplicável a múltiplos alvos e projetos na pesquisa de imunologia e inflamação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir ambiguidades mecanicistas por meio de evidências diretas de localização subcelular.
- Valor Operacional: Elimina a necessidade de ultracentrifugação, reduzindo custos com equipamentos e aumentando a acessibilidade em diferentes centros de pesquisa.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência das decisões de prosseguir/interromper ao fornecer dados precoces e confiáveis sobre a acessibilidade e compartimentalização do alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na localização subcelular validada em um modelo celular humano fisiologicamente relevante.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura celular, fracionamento subcelular e técnicas de imunoblotagem.
- Depende do acesso a centrífugas refrigeradas, agitadores rotativos e reagentes laboratoriais comuns, como digitonina e tampões hipotônicos.
- Necessita padronização da densidade celular, tempos de incubação e condições de lise para garantir um fracionamento reprodutível entre diferentes usuários.
- A adaptação a outros tipos celulares pode exigir otimização da composição do tampão de lise e dos parâmetros de centrifugação.
- As limitações práticas incluem a possível separação incompleta de organelas e a variabilidade no rendimento, dependendo da saúde celular e do número de passagens.
