Name: Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprenda a isolar membrana plasmática, citoplasma e mitocôndrias de células U937 sem centrifugação de alta velocidade. Este método simplificado permite análises de localização proteica por imunoblotagem.

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O trabalho foi acompanhado pelo NIH-1R15HL135675-01 para Timothy J. LaRocca

1. preparar reagentes e Buffers
Nota: Consulte a tabela 1.
<ol><li>Prepare soluções de tampão A, B do lysis, amortecedor da amostra e digitonin.<ol>
<li>Prepare A reserva, acrescentando 8,77 g de NaCl e 50ml de HEPES (1 M, pH 7,4) a 900 mL de água desionizada, ajustar volume final para 1 L com água desionizada. Nota: Concentrações finais são 150 mM NaCl e 50 mM HEPES.</li>
		<li>Preparar o tampão de Lise B adicionando 20 mL de HEPES (1 M, pH 7,4), 0,75 g de KCl, 0,19 g de MgCl2, 2ml de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA 0,5 M), 2 mL do glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-ácido etilenodiaminotetracético (0,5 M EGTA) , 38,26 g de manitol e 23,96 g de sacarose a 900 mL de água desionizada, ajustar volume final para 1 L com água desionizada. Nota: Concentrações finais são 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, EDTA 1 mM, 1 mM EGTA, manitol 210mm e sacarose de 70 mM.</li>
		<li>Prepare o amortecedor da amostra adicionando 0,01 g de sulfato dodecyl de sódio (SDS) para 10 mL de tampão salino tris (TBS) para uma concentração final de 0,1% SDS.</li>
		<li>Prepare uma solução stock de digitonin adicionando 25 mg de digitonin para 100 mL de água desionizada (concentração final é de 250 µ g/mL).</li>
		<li>Armazene todas as soluções-tampão a 4 ° C e digitonin a-20 ° C até o início do experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare soluções novas de inibidores de protease e fosfatase para ser adicionado a soluções tampão antes da adição de células.<ol>
<li>Preparar uma solução de fluoreto de phenylmethanesulfonyl (PMSF) adicionando 17,4 mg de PMSF a 1 mL de etanol a 100% (concentração final é 100 mM). Atenção: Usar equipamento de protecção e de exercício cuidado ao manusear PMSF. PMSF é perigoso se ingerido e pouco perigoso em caso de contacto com a pele (irritante), contato com os olhos (irritante) ou inalação; é corrosivo para os olhos e pele.</li>
		<li>Preparar um coquetel de inibidor de protease disponíveis comercialmente (100 ×) de acordo com as instruções do fabricante (ver a Tabela de materiais).</li>
		<li>Prepare uma solução stock de ortovanadato de sódio (SOV) adicionando 92 mg de SOV para 1 mL de água desionizada (concentração final é de 500 mM). Atenção: Utilize equipamento de protecção adequado e tenha cuidado ao manusear. SOV é perigoso em caso de contato com os olhos (irritante), ingestão ou inalação. Excesso de exposição severo pode resultar em morte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PBS lavagem
<ol><li>Concentre-se e lavam-se células em tampão fosfato salino (PBS) antes do fracionamento.<ol>
<li>Centrifugar a suspensão de células em uma velocidade adequada para criar uma pelota. Por exemplo, centrifugar uma suspensão de células U937 a 400 × g por 10 min.</li>
		<li>Remover o sobrenadante, resuspenda o pellet celular em PBS de temperatura em uma concentração final de 4 × 106 células/mL e pipeta suavemente para quebrar aglomerados.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão celular de 400 × g por 10 min para células de Pelotas.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e ressuspender células num tampão de gelo frio A uma concentração final de 2 × 107 células/mL. Nota: Todas as etapas subsequentes devem ser efectuadas em 4 ° C ou em gelo e todos os buffers devem ser previamente refrigeradas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. isolamento da proteína citosólica
<ol><li>Extrair proteínas cytosolic pela incubação com o detergente digitonin.<ol>
<li>Imediatamente antes da ressuspensão das células (passo 3.1.3), adicionar 10 µ l de estoque PMSF (100 mM), 10 µ l de inibidor de protease (× 100), 2 µ l de estoque SOV (500 mM) e 100 µ l de digitonin ações (250 µ g/mL) a 878 µ l de tampão A (concentrações finais são 1 mM PMSF , 1 × inibidor da protease, 1mm SOV e 25 µ g/mL digitonin; ajuste o volume final conforme o número de células sendo usado). Manter a solução no gelo até adição de centrifugado.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão celular de 400 × g por 10 min e retirar o sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda o pellet de células em solução tampão A contendo inibidores e digitonin (preparado na etapa 3.1.1) em uma concentração final de 2 × 107 células/mL, pipeta suavemente para quebrar aglomerados.</li>
		<li>Incube a suspensão de células em um rotador completa sobre a 4 ° C por 20 min.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão celular de 400 × g por 10 min. recolher o sobrenadante e colocá-lo num tubo de centrífuga limpo.</li>
		<li>Centrifugue o sobrenadante coletado a 18.000 × g por 20 min para restos celulares de Pelotas.</li>
		<li>Transferi o sobrenadante para um tubo de centrifugação limpo.</li>
		<li>Repita as etapas 3.1.5 e 3.1.6 até à não obtenção de nenhum sedimento após centrifugação.</li>
		<li>Recolher o sobrenadante contendo as proteínas cytosolic e armazená-lo em 4 ° C (curto prazo) ou a-20 ° C (longo prazo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova o excesso digitonin e proteínas cytosolic por centrifugação.<ol>
<li>Resuspenda o pellet de células digitonin-permeabilizado (da etapa 3.1.5) em tampão A em uma concentração final de 4 × 106 células/mL e pipeta suavemente para quebrar aglomerados.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de células digitonin-permeabilizado 400 × g por 10 min e retirar o sobrenadante. Nota: Lavagens repetidas em tampão A podem ser realizadas para remover contaminantes citosólico em excesso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. célula homogeneização
<ol><li>Incubar as células no gelo em tampão de Lise B e lyse-los por meios mecânicos.<ol>
<li>Imediatamente antes da ressuspensão das células (etapa 4.1.2), adicionar 10 µ l de estoque PMSF (100 mM) e 2 µ l de estoque SOV (500 mM) para 988 µ l de tampão de Lise B (concentrações finais são 1mm PMSF e 1mm SOV; ajustar volume final para acomodar o número de células sendo lysed) e manter a solu ção no gelo até adição de centrifugado.</li>
		<li>Ressuspender as células (da etapa 3.2.2) em solução-tampão B lise fria como o gelo contendo PMSF e SOV (preparado na etapa 4.1.1) em uma concentração final de 4 × 106 células/mL.</li>
		<li>Incube a suspensão de células no gelo por 30 min.</li>
		<li>Transferir a suspensão de células para um homogenizador homogenizacao pre-refrigerado (com um pilão de B apertadas) no gelo e executar 40 passes com o pilão homogenizador devagar, usando até mesmo traços. Nota: Em alternativa utilize outros meios de lise celular mecânica conforme detalhado na seção de discussão.</li>
		<li>Recolher o homogeneizado e transferi-lo para um tubo de centrifugação limpo.</li>
		<li>Lave o pilão homogenizador e tubo com um pequeno volume (1 a 2 mL) de tampão de Lise B e adicioná-lo para o homogeneizado.</li>
		<li>Centrifugue o homogeneizado em 400 × g (ou a velocidade mínima necessária para células ininterrupta de Pelotas) por 10 min.</li>
		<li>Transferi o sobrenadante para um tubo de centrifugação limpo. Nota: Se uma pelota de significativa permanece 4.1.4 através de 4.1.6 para aumentar o rendimento das frações como repita os passos detalhados na seção de discussão. O protocolo pode ser pausado aqui, e o homogenate armazenadas a 4 ° C para curto prazo (24 h).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. diferencial centrifugação
<ol><li>Centrifugue o homogeneizado em aumentar a velocidade para remover restos celulares, as mitocôndrias isoladas e fracções de membrana.<ol>
<li>Centrifugue o sobrenadante (da etapa 4.1.8) a 500 × g por 10 min. transferência de sobrenadante para um tubo limpo e descartar qualquer pelota.</li>
		<li>Sobrenadante (da etapa 5.1.1) a 1.000 × g por 10 min. transferência de centrifugação o sobrenadante para um tubo de centrifuga limpo e descartar qualquer pelota.</li>
		<li>Centrifugue o sobrenadante (da etapa 5.1.2) a 2.000 × g por 10 min. transferência o sobrenadante para um tubo limpo e descartar qualquer pelota.</li>
		<li>Centrifugue o sobrenadante (da etapa 5.1.3) a 4.000 × g durante 15 min. transferência de sobrenadante para um tubo de centrifugação limpo, manter pelota contendo mitocôndria.</li>
		<li>Resuspenda o pellet de mitocôndrias em um pequeno volume (0.5\u20121 mL) de tampão de Lise B.</li>
		<li>Centrifugue o sedimento suspenso a 4.000 × g durante 15 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o mitocondrial pelota em volume final desejado de tampão de amostra (por exemplo, 250 a 500 µ l, dependendo do tamanho da pelota e desejado concentração).</li>
		<li>Centrifugue o sobrenadante (da etapa 5.1.4) a 4.000 × g 15 min. Transfira o sobrenadante para um tubo de centrifugação limpo. Repita este passo até que nenhum sedimento é obtido após centrifugação.</li>
		<li>Gire o sobrenadante a 18.000 × g durante 3 h.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e manter o sedimento contendo proteínas da membrana. Resuspenda o pellet de membrana em um pequeno volume (0,5 – 1 mL) do lysis buffer de B.</li>
		<li>Centrifugue o sedimento suspenso a 18.000 × g por 1h.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e ressuspender a membrana do volume final desejado de tampão de amostra (250 a 500 µ l, dependendo do tamanho da pelota e concentração desejada).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proceda à sonicação as pelotas de amostra para 3 s em um banho de gelo em uma configuração de energia de 5 (50% da potência máxima de 125 W a 20 kHz, consulte A tabela de materiais).</li>
	<li>Armazene as amostras em 4 ° C (curto prazo) ou a-20 ° C (longo prazo).</li>
	<li>Examinar as amostras para a pureza de fracionamento, realizando um western blot utilizando anticorpos contra marcadores de proteína encontradas nos compartimentos citoplasma, mitocôndrias e membrana da célula (consulte a seção resultados representativos).</li>
</ol>

<ol><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li>
<li>Hwang, S. II, Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers%3A+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li>
<li>Song, Y., Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+project+for+the+subcellular+proteome+of+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver.</a> Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).</li>
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<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAPDH+as+a+housekeeping+gene%3A+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li>
<li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li>
<li>Therien, aG., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).</li>
<li>Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2CK-ATPase+transport+from+endoplasmic+reticulum+to+Golgi+requires+the+Golgi+spectrin-ankyrin+G119+skeleton+in+Madin+Darby+canine+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).</li>
<li>McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55(2018).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogenization+of+Mammalian+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Homogenization of Mammalian Tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram não haverá conflito de interesses

O desenvolvimento do presente protocolo surgiu de uma incapacidade de se separar mitocondrial e amostras de membrana, usando kits comercialmente disponíveis, para análise da localização da proteína durante necroptosis14. As limitações primárias de kits do premade são sua incapacidade de ser adaptado às necessidades dos investigadores individuais, o custo por amostra e número limitado de amostras capazes de serem processados. O método apresentado aqui pode ser realizado sem a utilização de reagente...

Identificação fiável de localização da proteína é muitas vezes necessária, ao examinar as vias moleculares em células eucarióticas. Métodos para obter fracções subcelulares são utilizados pelos pesquisadores para examinar mais de perto os componentes celulares de interesse.
A maioria dos métodos existentes de fracionamento celular geralmente caem em duas categorias amplas, baseado em detergente1,2 e baseada em ultracentrifugação3,4,5, que pode ser diferenciadas por velocidade, precisão e custo. Protocolos baseados em detergente contam com o uso de buffers com crescente força detergente para solubilizar componentes distintos da célula. Este é um método rápido e conveniente para o processamento de amostras e pode ser rentável se o número e o tamanho das amostras são pequenas. Detergente com base em kits podem ser adquiridos para isolar citoplasmática membrana/organela (fração mista) e frações nucleares de células. No entanto, vários inconvenientes associados a estes kits limitam sua utilidade para pesquisadores. Eles são projetados para isolar facilmente um ou dois componentes da célula, mas são incapazes de isolar todas as frações de uma amostra simultaneamente. O uso de detergentes significa que a membrana plasmática e organelas de membrana-incluido vão ser igualmente solubilizadas e, portanto, incapaz de ser separados uns dos outros. Uma complicação adicional decorre os componentes proprietários nesses kits que impede que os investigadores alterando as condições para aplicações específicas. Por último, eles são limitados em número de usos e podem ser proibitivamente caros para experiências em maior escala. Kits de non-detergente com base existem para o isolamento de mitocôndrias, no entanto, eles não são projetados para isolar a membrana plasmática e o rendimento da amostra é significativamente menor do que a da centrifugação densidade com base em protocolos de isolamento6,7 .
Métodos que utilizam a ultracentrifugação para obter fracções são mais tempo consumindo, mas muitas vezes resultam em frações mais puras do que jogos baseados em detergente. Para isolar as membranas do plasma de células sem primeiro solubilizing-los (resultando em contaminação com organelas de membrana) os obriga a ser lysed por um método não-detergente seguido de separação de componentes celulares através do diferencial centrifugação — com isolamento de membrana plasmática que exigem velocidades de 100.000 × g para realizar. Em muitos casos, centrifugação diferencial deve ser seguida por isopícnica centrifugação de densidade gradiente para ainda mais a separação das frações celulares ou remoção de contaminantes. Enquanto esses métodos são minuciosos e modificável, desvantagens incluem a necessidade de um se para separação das frações e ainda mais purificação através de densidade gradiente centrifugação, consumo de tempo e custo. A maioria das centrífugas de alta velocidade são a um custo que é proibitivo dos investigadores individuais e são frequentemente partilhados, núcleo equipamentos em instituições acadêmicas. Assim, a disponibilidade se torna-se proibitivo nessas situações.
Neste protocolo de fracionamento, demonstramos o isolamento de frações subcelulares, sem o uso de detergentes de solubilizing e sem centrifugação de alta velocidade. Este método permitirá que pesquisadores isolar a membrana plasmática, mitocôndrias e componentes citoplasmáticos de uma célula eucariótica com contaminação mínima entre frações.

<table><tbody><tr>Produtos químicos <td>D0540</td> de <td>Digitonin</td><td>TCI</td><td>para a extração do citoplasma</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td>para o tampão B da lise</td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>VWR</td><td>22877-282</td> de Dounce para o <td></td></tr><tr><td>rotador fim-a-fim</td><td>Barnstead</td><td>N/A</td> da homogeneização <td>para a extração do citoplasma</td></tr> etileno <tr><td>glicol-bis(&beta;-éter aminoetílico)-N, N, N' ,Ácido N'-tetracético (EGTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61721</td><td>Para tampão de lise B</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td>Para tampão de lise B</td></tr><tr><td>GAPDH (14C10)</td><td>Cell Signalling Technologies</td><td>2118</td><td>Para detecção de frações citoplasmáticas em western blot, diluição: 1:10000</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>J848</td><td>Para tampões de lise A e B</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Para tampão de lise B</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Alfa Aesar</td><td>12315</td><td>Para tampão de lise B</td></tr><tr><td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td><td>Cell Signalling Technologies</td><td>23565</td><td>Para detecção de frações da membrana plasmática em western blot, diluição: 1:1000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>Para tampão de lise A</td></tr><tr><td>fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF)</td><td>VWR</td><td>M145</td><td>para extração de citoplasma e homogeneização</td></tr><tr><td>Sonda tampão sonicador</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td>Para amostras finais</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de protease, uso geral</td><td>VWR</td><td>M221-1ML</td><td>para extração de citoplasma</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Beckman-Coulter</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>VWR</td><td>227</td><td>Para tampão de amostra</td></tr><tr><td>ortovanadato de sódio (SOV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>450243</td><td>Para tampões de lise A e B</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Para tampão de lise B</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com tris (TBS)</td><td>VWR</td><td>788</td><td>Para tampão de amostra</td></tr><tr><td>VDAC (D73D12)</td><td>Tecnologias</td> <td>de sinalização celular4661</td><td>Para detecção de frações mitocondriais em western blot, diluição: 1:1000</td></tr></tbody></table>

fracionamento celular de células u937, na ausência de centrifugação de alta velocidade

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Neste protocolo, detalhamos um método para obter fracções subcelulares de células U937 sem o uso de ultracentrifugação ou detergentes indiscriminados. Este método utiliza buffers de hipotônicas, digitonin, Lise mecânica e centrifugação diferencial para isolar o citoplasma, mitocôndrias e membrana plasmática. O processo pode ser dimensionado para acomodar as necessidades dos investigadores, é barato e simples. Este método permitirá que os investigadores determinar a localização da proteína nas células sem centrifugadores especializados e sem o uso de kits comerciais, ambos dos quais podem ser proibitivamente caros. Com sucesso usamos este método para separar citosólica, membrana plasmática e proteínas mitocondriais em linhagem celular de monócitos humanos U937.

Bem sucedido fraccionamento de células indiferenciadas de8 U937 crescido em suspensão foi realizado utilizando o protocolo detalhado acima e ilustrado na Figura 1. As amostras obtidas com este método foram submetidas a mancha ocidental9 utilizando um método de transferência molhado para uma membrana (PVDF) de fluoreto de polivinilideno. A membrana foi posteriormente analisada com anticorpos contra citoplasmática...

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar a membrana plasmática, citoplasma e mitocôndrias de células U937 sem o uso de centrifugação de alta velocidade. Esta técnica pode ser usada para purificar as fracções subcelulares para posterior exame de localização de proteínas através de immunoblotting.

Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Este protocolo permite que os pesquisadores obtenham frações distintas de uma célula sem o uso de equipamentos especializados, reagentes caros ou técnicas complexas. A principal vantagem deste protocolo é a simplicidade das técnicas que o tornam modificável e fácil de executar. Demonstrando o procedimento serão Matt Deragon, Rob Haluska e Alexa Hodges.três estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Para começar a centrifugar a suspensão celular preparada para criar uma pelota. Remova o supernatante e suspenda a pelota em temperatura ambiente PBS. Centrifugar a suspensão da célula a 400 xg por dez minutos. Em seguida, remova o supernasciente e suspenda novamente a pelota da célula no tampão gelado. Prepare o buffer Uma solução de acordo com o protocolo de texto. Centrifugar a suspensão da célula a 400 xg por dez minutos e remover o supernatante. Suspenda a pelota no buffer Uma solução para uma concentração final de 200 milhões de células por ml, e pipeta suavemente para quebrar qualquer aglomerado. Depois disso, incubar a suspensão da célula em uma rotadora final em 4

cell-fractionation-u937-cells-absence-high-speed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve a preparação de frações subcelulares de células leucêmicas, que é um método para gerar frações celulares e nucleares de células leucêmicas. As frações nuclear e citoplasmática podem ser usadas para análises posteriores a jusante.

Preparação de Frações Subcelulares de Células Leucêmicas: Um Método para Gerar Frações Celulares e Nucleares de Células Leucêmicas

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células mononucleares de lâmina própria do tecido colônico murino por digestão enzimática usando colagenase E e separação de gradiente de mídia de separação de densidade à base de sílica. As células mononucleares isoladas podem ser usadas para análise subsequente a jusante.

Isolamento de células mononucleares da lâmina própria: uma técnica de centrifugação por gradiente de densidade à base de sílica para obter células mononucleares do cólon murino

O vídeo demonstra o isolamento de células mononucleares do sangue periférico que se infiltram em tumores a partir de um cérebro de camundongo usando dissociação mecânica e digestão enzimática. Isso é seguido pela centrifugação do gradiente de densidade para coletar as células imunes para análise posterior.

Isolando células imunes infiltrantes de tumor de um cérebro murino

Este protocolo descreve a dissociação rápida não enzimática de fragmentos de tecido humano fresco para avaliação qualitativa e quantitativa de células CD45+ (linfócitos/leucócitos) presentes em vários tecidos humanos normais e malignos. Além disso, o sobrenadante obtido do homogeneizado de tecido primário pode ser coletado e armazenado para análise ou experimentação posterior.

Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Este protocolo descreve o uso de centrífuga elutriation para separar as células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular.

Preparação de células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular por Elutriation centrífuga

Este protocolo permite a otimização e a geração eficiente subseqüente de frações nucleares e cytoplasmic das pilhas crônicas primárias da leucemia lymphocytic. Estas amostras são usadas para determinar a localização da proteína assim como mudanças no tráfico da proteína que acontecem entre os compartimentos nucleares e cytoplasmic em cima da estimulação da pilha e do tratamento da droga.

Fraccionamento subcelular de células crônicas primárias de leucemia linfocítica para monitorar o tráfico de proteínas nucleares/citoplasmáticas

Este protocolo de fracionamento permitirá que os pesquisadores isolem proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriais e de membrana de células de mamíferos. As duas últimas frações subcelulares são ainda purificadas através do gradiente de densidade isopícnico.

Fracionamento Celular de Células U937 por Purificação de Gradiente de Densidade Ipopínica

Apresentamos uma técnica para estabilizar rapidamente complexos translacionais (biossíntese de proteínas) com formaldeído interligando em leveduras vivas e células mamíferas. A abordagem permite dissecar intermediários transitórios e interações dinâmicas de RNA:protein. Os complexos interligados podem ser usados em vários aplicativos a jusante, como em métodos de perfil baseados em sequenciamento profundo, microscopia e espectrometria de massa.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

Este trabalho descreve um protocolo para quantificação de modificações globais de histonas utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada. O trabalho também contém o protocolo de isolamento da micróglia que foi utilizado para a coleta de dados.

Quantificação de modificações pós-traducionais globais de histona utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada de camundongos

Aprenda a isolar membrana plasmática, citoplasma e mitocôndrias de células U937 sem centrifugação de alta velocidade. Este método simplificado permite análises de localização proteica por imunoblotagem.

Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade

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