Name: Espontâneas e evocadas medidas de dor em modelos murino de dor no joelho monoarticulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprenda a medir dor evocada e espontânea em modelos murinos de artrite monoarticular do joelho. Este protocolo sensível e reprodutível avalia tratamentos analgésicos e regenerativos em camundongos.

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Financiado pela departamento de veteranos dos assuntos de mérito 2 I01 RX000379-05.

Todos os animais procedimentos e protocolos foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado Animal institucional do Minneapolis sistema de cuidados de saúde de assuntos dos veteranos (VAHCS) e conformados com o "guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório" (nacional Academic Press, EUA) 12.
1. escolha de animais
Nota: Camundongos C57Bl6 são utilizados para todos os três modelos de artrite.
<ol><li>Usar ratos do sexo masculinos ou femininos, mas observe que a resposta à dor da artrite pode variar consoante o género e a patogênese do modelo a ser testado.</li>
	<li>Selecione os ratos que tenham atingido a maturidade sexual, já não estão crescendo rapidamente e não têm idade suficiente para desenvolveram artrite espontânea que poderia confundir as medições da dor. Nota: Doze semanas é uma idade ideal para a medição de dor nos modelos descritos, mas isso depende do projeto de estudo. Idade no início da artrite varia de acordo com a duração de tempo que o modelo leva a desenvolver. Artrite inflamatória aguda (modelo de carragenina) requer 3h para desenvolver, portanto, os animais são 12 semanas de idade no momento da indução. Artrite inflamatória crônica (modelo CFA) requer 3 semanas para se desenvolver, portanto, os animais são 9 semanas de idade no momento da indução. Artrite degenerativa crónica (modelo de colagenase) requer 4 semanas para desenvolver, portanto, os animais são 8 semanas no momento da indução. Um modelo mais crônico da artrite degenerativa pode ser usado através da indução de artrite com 6 semanas de idade. Isso permite que 6 semanas de desenvolvimento do dano comum. No entanto, artrite degenerativa crônica em ratos não produz dor significante evocada.</li>
	<li>Obter animais de uma fonte de criador comercial nacional.</li>
	<li>Animais de casa em grupos de até 8 animais em gaiolas de policarbonato padrão com dieta ad libitum de roedor e de água.</li>
	<li>Manter as condições ambientais a 72 ° C ± 1 ° C e 33% ± 1% umidade com ciclos de claro/escuro de 12 h.</li>
</ol>2. intra-articular injeções no joelho
<ol><li>Criar um 30 G 2.5 mm estéril cobrindo o comprimento de uma agulha de 0,5 polegadas com uma bainha feita de tubos de polietileno com um interior diâmetro de 0,38 mm e diâmetro externo de 1,09 mm, deixando apenas a 2,5 mm da agulha salientes. Isso impede que inserir a agulha profundamente e saída da articulação posterior.</li>
	<li>Escolher um único joelho para injetar, raspá-lo usando qualquer aparador de barba elétrico disponível comercialmente e esterilizar com esfoliante de providone iodada.</li>
	<li>Anestesia o mouse com 3% de isoflurano em 100% de O2 em 1 L/min. para 3 min ± 1 min. manter anestesia usando um cone de nariz durante o procedimento. Confirme a profundidade de anestesia por pitada de dedo do pé. Tome cuidado para monitorar o estado respiratório e minimizar a exposição de anestesia para manter a respiração adequada.</li>
	<li>Insira a articulação na linha através do tendão patelar só inferior à borda inferior da patela usando a agulha bainha estéril, uma vez que o mouse é totalmente anestesiado. Esta abordagem mediana anterior maximiza a precisão para inserir a articulação e injetando a substância de interesse.</li>
	<li>Use a mesma abordagem para injetar tanto substâncias indutoras artrite e substâncias analgésicas. Controles de Souza são produzidos, inserindo a agulha como acima, mas sem injeção de qualquer substância.</li>
</ol>3. produção de artrite
<ol><li>Anestesia o animal como na etapa 2.3 acima.</li>
	<li>Pesar o montante adequado (veja abaixo) de carragenina, adjuvante do completo de Freund e tipo IV colagenase e diluir com a concentração adequada com soro fisiológico normal em uma capa de fluxo laminar para segurança e esterilidade.</li>
	<li>Injecte 10 µ l de carragenina 2,5% diluída em solução salina estéril 0,9% no joelho como acima, utilizando uma seringa de Hamilton para produzir artrite inflamatória aguda. Artrite picos 3h após a injeção.</li>
	<li>Injete, 30 µ l (30 µ g) do Freund completo adjuvante (CFA) no joelho para produzir artrite inflamatória crônica. Existe uma fase inflamatória aguda inicial que picos em 1 semana depois uma fase crônica que picos em 3 semanas depois da injeção.</li>
	<li>Injecte 10 µ l contendo 10 colagenase tipo IV de IU para produzir artrite degenerativa crónica. Dor de artrite picos 4 semanas após a injeção.</li>
</ol>4. medição da dor articular evocada
<ol><li>Sempre examine o joelho normal comparador primeiro para minimizar a resposta de dor cruzado (conclusão) do joelho doloroso13.</li>
	<li>Treinar o examinador para aplicar uma pressão firme e consistente de 700 gf/cm2 = 10 psi usando um Palpometer nível 4; o dispositivo emitirá 4 bips quando este nível de pressão é aplicada. Esta quantidade de pressão consistentemente irá provocar uma resposta de dor maior de uma artrítica conjunta do que de uma articulação normal. Nota: O aparelho é calibrado na fábrica para eliciar 4 bips quando o nível apropriado de pressão é aplicado. Usar o dispositivo para treinamento Não usar em animais, mas ao examinar os animais, aplicar a quantidade de pressão que aprendi através do treinamento.</li>
	<li>Contenha o mouse firmemente o suficiente para evitar o movimento casual segurando a nuca do pescoço com o dedo indicador e o polegar e usando 4th e 5th dedos para segurar a cauda. O rato deve ser capaz de fazer movimentos discretos, breves com esforço e quando estimulado, mas não deve ser capaz de se mover livremente ou continuamente.</li>
	<li>Administre repetidas apalpação de firme (Palpometer nível 4) simultaneamente para os lados medial e laterais de cada joelho em aproximadamente a interlinha articular com o polegar e o dedo indicador da mão livre uma vez por segundo durante um minuto enquanto o mouse de restrição. Não use o Palpometer para o exame do mouse; Ele é usado apenas para treinamento.</li>
	<li>Tem um segundo observador contar o número de vezes que o animal vocaliza e luta para escapar da retenção durante este período de tempo de um minuto. A soma das lutas e vocalizações é o escore de dor evocada.</li>
	<li>Sempre nos mesmo examinador ao longo do estudo e confirmar o examinador e o observador estão cego quanto à condição experimental.</li>
</ol>5. medição da dor articular espontânea.
Nota: O dispositivo avançado dinâmico peso rolamento (ADWB) calcula a porcentagem do tempo total que o animal gasta em cada membro e a porcentagem de peso total suportado em cada membro.
<ol><li>Encha um copo de plástico com 2 L de água. Coloque a almofada de espuma e painel de fibras de média densidade que estão incluídos com o equipamento juntamente com o copo cheio em escala de laboratório e registrar o peso combinado.</li>
	<li>Abra o programa ADWB e selecione o tipo de sensor de ratos .</li>
	<li>Calibre o sistema antes de cada experimento:<ol>
<li>Selecione calibração completa sob os menus de calibração . Digite 0.00 como um valor da Tara e o peso da almofada de espuma, painel de fibras de média densidade, copo plástico e água como o peso de calibraçãoe, em seguida, seleccione seguinte.</li>
		<li>Selecione Tara antes de colocar qualquer coisa no sensor. Antes de selecionar obter visualização, cobrir os sensores com a almofada de espuma fornecido, painel de fibras de média densidade e copo plástico preenchido com 2 litros de água, nessa ordem. Selecione visualização de ganhar uma vez que o peso de calibração é no sensor.</li>
		<li>Ajustar o peso de calibração, então é distribuída uniformemente entre os sensores individuais, e quando o valor do indicador de calibração é acima de 95, selecione ganhar definição. Este processo produz uma média normalizada para os sensores individuais e confirma a integridade dos sensores individuais. Finalmente, selecione próximo.</li>
		<li>Salve o arquivo de calibragem para a pasta de calibração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione novo e, se fornecido, digite o nome do projeto e o nome do Animal para o primeiro rato a ser testado.</li>
	<li>Selecione Browse e abra o arquivo de calibração que foi criado para o projeto. Selecione próximo, certifique-se de habilitar a captura de vídeo é selecionado e selecione Okey.</li>
	<li>Pesar o animal, selecione capturare registrar o peso no software. Selecione Okey.</li>
	<li>Não aclimate ratos para a câmara antes da coleta de dados, porque este dispositivo mede o comportamento espontâneo.</li>
	<li>Posicione o mouse na câmara por um período de 5 min de teste. Quando o animal está na câmara, selecione Iniciar. O software irá gravar a atividade do animal durante este tempo, capturar um vídeo e sincronizar com os dados do sensor e particionar automaticamente este vídeo em segmentos não-analisáveis e analisáveis. Nota: O software considera segmentos analisáveis quando pelo menos uma zona estável é detectada. Uma zona estável é criada quando os sensores detectam ≥2 g em um sensor com um mínimo de um sensor adjacente detectando ≥ 1 g e quando a distribuição de peso de uma zona é estável por mais de 0,38 s.</li>
	<li>Antes da primeira análise de uma série, selecione Marcar fácil e que independente de patas de configuração. Nota: Marcar fácil permite validação de iteração dos segmentos onde a zona estável não muda com base na validação da primeira zona estável desse segmento. As patas independentes configuração fornece o observador com acesso para os atalhos de teclado que permitem a identificação individual de cada pata. As zonas de cessionários de observador que atendem a critérios mínimos como certo hind, deixaram traseira, certo frente, esquerda frente, tanto dianteiras, outra parte do corpo ou ignoram zona usando os atalhos de teclado, mantendo o cursor sobre o segmento de pelo vídeo e escalado mapa de ativado sensores.</li>
	<li>Selecione >> para mover para o primeiro segmento analisáveis. Se uma zona estável não tem a pata correta identificada em seguida, mantenha o cursor sobre essa zona e pressione o atalho (direito hind, s; hind esquerda, um; direito dianteiro, w; esquerda dianteira, q; ambas as dianteiras, e; outra seção do corpo, z, ignorar zona, x) que corresponde com a parte do corpo correta. Nota: Um mínimo de 1,5 min de tempo analisáveis é necessário conhecer os limites de análise. Segmentos analisados são adicionados e calculados automaticamente para a saída por paw(s) pelo software.</li>
	<li>O software ADWB então calcula automaticamente a percentagem do tempo analisado e do peso corporal (g), colocada em cada uma das opções dos quatro membros. Exporte esses valores em uma nova planilha selecionando resultados, Exportar, selecionar Sim para a pergunta prompt perguntando se apenas as cinco primeiras linhas de resumo devem ser exportadas, e selecionando o local da saída.</li>
	<li>Eutanásia em animais por inalação de CO2 seguida por toracotomia no final do período de estudo.</li>
	<li>Para cada animal adicional no mesmo grupo, selecione novo e digite um nome exclusivo de animais mas não altere o nome do projeto. Selecione próximo, certifique-se de habilitar a captura de vídeo é selecionado e selecione Okey. Siga os passos de 5.5 a 5.12 quanto o primeiro animal.</li>
</ol>

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<li>Meziane, H., Ouagazzal, A. -M., Aubert, L., Wietrzych, M., Krezel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrous+cycle+effects+on+behavior+of+C57BL%2F6J+and+BALB%2FcByJ+female+mice%3A+implications+for+phenotyping+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Estrous cycle effects on behavior of C57BL/6J and BALB/cByJ female mice: implications for phenotyping strategies.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6, 192-200 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Medição da dor articular em modelos pré-clínicos de artrite inflamatória e de doença articular degenerativa é uma ferramenta cada vez mais valiosa para avaliar novos tratamentos para a dor da artrite e para restaurar a função da articulação9,10. Comportamentos de dor em ratos com doença crônica de articular degenerativa de medição é um desafio. Como quadrúpedes, eles podem descarregar um membro doloroso para qualquer combinação de outros três membros ou cauda. Diminuição da função em um membro não podem ser exibidos como obviamente, como é em humanos bípedes. Como os animais de rapina, os ratos têm um benefício de sobrevivência para minimizar comportamentos de dor.
Este relatório demonstra que a dor nas articulações de diferentes mecanismos patológicos pode ser medido em camundongos com métodos simples e relativamente baratos. Dor articular inflamatória provoca maiores mudanças no suporte a tempo e a distribuição de peso e, portanto, pode ser um modelo mais sensível para a detecção de analgesia. No entanto, outros modelos de dor nas articulações será importantes ao avaliar novos analgésicos potenciais desde que os mecanismos de iniciação da dor e manutenção são provavelmente diferentes com diferente patologia. Encontramos diferenças nos padrões de descarga entre machos e fêmeas e entre diferentes modelos de dor da artrite.
É importante reconhecer que lá pode ser tensão bem como as diferenças no comportamento de dor em ratos14,15,16de gênero. Também é conhecido que existem diferenças de tensão distintos em limiares de dor. Nós achamos que em camundongos C57/Bl6, fêmeas demonstraram significativamente mais espontâneos comportamentos de dor (aumento de peso e altura de membros dianteiros) do que os ratos masculinos com crônica dor articular degenerativa (Figura 2 e Figura 3). Nós não determinar a fase de estro por esses ratos fêmeas, então não podemos dizer se isso tinha qualquer efeito sobre os nossos resultados, mas outros determinaram essa fase estro não explicou sexo observadas diferenças de camundongos C57/Bl617.
Comportamento de dor evocada é sensível para todos os tipos de dor articular testado e tem boa reprodutibilidade. É crucial que o examinador é treinado para fornecer pressão de palpação consistente, padronizada e utilizar métodos de contenção consistente que permite que a gama de comportamento de dor para detectar dor e analgesia. É importante sempre examinar o joelho normal primeiro para minimizar a resposta de dor no joelho normal devido a um efeito de cruzamento e maximizar a diferença na resposta de dor entre o joelho normal e doloroso. Usando um segundo observador para calcular as respostas de dor que compõem o EPS é necessário para que o examinador centra-se na palpação consistente e assim vocalizações e lutas consistentemente são computadas. Pode ser necessário para a prática do método de contenção em particular para garantir que o animal pode reagir à dor adequadamente mas não reage muito facilmente a fim de diluir a resposta de dor. Uma vantagem da medição EPS é que é análoga à medição conjunta ternura em pacientes humanos.
Sentimos que esses métodos são superiores aos métodos existentes em que medem diretamente a dor vem as articulações de joelho de ratos, eles podem ser usados em modelos diferentes de dor de monoartrite, eles incluem ambas as respostas de dor espontânea e evocado e são relativamente barato mas confiável e reprodutível. Como terapias são desenvolvidas para tratar mais eficazmente a artrite, esses métodos serão úteis para confirmar se os tratamentos são realmente eficazes para o resultado mais incapacitante da artrite, dor.
Nossos métodos têm algumas limitações. Principalmente, a medida do EPS é limitada pela exigência por um único examinador e observador e a necessidade de técnica muito consistente. As medidas de dor evocados são mais automatizadas e não como sujeitas a diferenças inter observador. Aperfeiçoamento da medida EPS pode incluir métodos automatizados para a contagem de vocalizações em resposta à palpação, como o uso de um detector ultra-sônico morcego contar vocalizações. Este método precisa ser comparado ao nosso método atual para confirmar a sensibilidade e especificidade, antes que ele pudesse ser implementado amplamente.
Em resumo, nós descrevemos duas medidas de comportamento de dor diferente para quantificar a dor articular em ratos. Diferenças de gênero e a tensão devem ser consideradas antes de escolher um modelo experimental. Medidas de dor evocada requerem treinamento cuidadoso e uma aplicação coerente por parte do examinador. Ambos os comportamentos de dor espontânea e evocados são recomendados para avaliar a intensidade da dor e limitação funcional e devem ser utilizados para avaliar totalmente os efeitos dos analgésicos potenciais novos.

A dor é a principal causa de incapacidade de artrite1,2. Atualmente disponíveis analgésicos são frequentemente ineficazes, tóxicos e potencialmente contribuam para o problema de estupefacientes de toda a nação3. Cirurgia não é sempre uma opção para artrite de estágio final, especialmente em idosos, que podem ter múltiplas co-morbidades. Viscosupplementation e esteroides intra-articulares pode ser eficaz na doença de início mas normalmente perde sua eficácia na doença de estágio final4. Há uma grande necessidade insatisfeita por eficazes analgésicos para a dor de artrite que não podem ser resolvidos com tratamentos atualmente disponíveis.
Modelos pré-clínicos são úteis para a compreensão do mecanismo de ação das terapias de dor e de previsão toxicidades limitantes, mas medição da dor em animais é um desafio5. Medidas de dor podem ser direto e espontâneo (estático ou dinâmico rolamento de peso, postura, análise da marcha, movimento espontâneo e sensibilidade térmica ou mecânica do pé) ou indirecta/evocadas (teste de retirada do membro posterior, força de compressão de joelho ou imagens do cérebro) 6. para formas leves de monoartrite, análise da marcha é insensível e carece de consistência7. Rolamento de peso estático é útil para medir a dor em membros traseiros do rato, mas pode ser difícil em camundongos. Medidas de sensibilidade mecânica, tais como o teste de von Frey indiretamente detectam a sensibilização do pé pad no cenário de artrite do joelho, mas não meça diretamente dor no joelho e são complicadas para executar. Força de compressão do joelho, medida com o dispositivo P.A.M. (medição de pressão aplicação) pode ser usada em ratos, mas o dispositivo grande é difícil de usar em camundongos sem produzir comportamentos negativos que não refletem necessariamente dor8.
Nós desenvolvemos métodos para medição de dor espontânea e evocado em três modelos diferentes de murino artrite que são sensíveis e reprodutíveis para medir a intensidade da dor e o efeito analgésico de terapias intra-articulares9, 10. nós também pode correlacionar o alívio da dor com outros marcadores histológicos de dor e tela drogas experimentais que não seria possíveis em humanos. Podemos avaliar sinergismo de analgésicos modestamente eficazes para identificar terapias de combinação mais eficazes. Utilizando métodos comprovados para dor evocada e espontânea, podemos evitar a armadilha de não identificar a dor que se reflete em um tipo de comportamento de dor mas não a outro e a mais de perto espelho dor medida em seres humanos11. Ao limitar a avaliação da dor para duas metodologias, minimizamos o estresse dos animais, que podem afetar o comportamento de dor e maximizar a produtividade do laboratório.

<table><tbody><tr><td>Dispositivo Avançado de Sustentação de Peso</td><td>Dinâmico Bioseb In Vivo Research Instruments, Vitrolles, França</td><td>Modelo: BIO-DWB-M - Para camundongos</td><td></td></tr><tr><td>camundongos C57/Bl6 (machos e fêmeas)</td><td>Jackson Labs, Bar Harbor ME</td><td>Nº de estoque:&nbsp; 000664&nbsp;|&nbsp; Preto 6</td><td></td></tr><tr><td>Carragena</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>22049-5G-F</td><td></td></tr><tr><td>Adjuvante Completo de Freund</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>F5881</td><td></td></tr><tr><td>Palpometer</td><td>Palpometer Systems, Inc. Victoria, B.C</td><td>Não disponível - não está mais disponível no negócio</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo IV</td><td>Worthington Biomedical Corp, Lakeville, NJ</td><td>LS004210</td><td></td></tr></tbody></table>

espontâneas e evocadas medidas de dor em modelos murino de dor no joelho monoarticulares

Spontaneous and Evoked Measures of Pain in Murine Models of Monoarticular Knee Pain

A dor é a principal causa de incapacidade de artrite. Atualmente há uma necessidade não atendida de tratamentos adequados para a dor da artrite. Modelos pré-clínicos são necessário e útil para estudar os mecanismos da dor e para avaliar a eficácia das terapêuticas de artrite. Medindo a dor em modelos animais de artrite é um desafio. Nós desenvolvemos métodos para medir a dor espontânea e evocado em três modelos de murino artrite. Podemos dosar as respostas evocadas dor de ratos submetidos a palpação firme de um joelho doloroso. Também avaliamos dor espontânea pela proporção de peso e a quantidade de tempo colocadas em cada um dos seus 4 membros após a indução de artrite dor no joelho. Dor nas articulações nesses modelos do rato produz um aumento significativo de respostas evocadas dor e uma alteração no rolamento de peso. Uma vez que os ratos são quadrúpedes, eles descarregar o membro doloroso ao membro contralateral, com as patas dianteiras, ou alguma combinação. Esses métodos são simples, exigem o mínimo de equipamento e reproduzíveis e sensível para a detecção de dor. Eles são úteis para estudar tanto doença-modificando a tratamentos de artrite e analgésicos em camundongos.

Aguda e crônica inflamatória e crônica degenerativa dor nas articulações foi produzida por injeção IA no joelho esquerdo de C57BL/6J ratos machos e fêmeas antes da avaliação de dor, usando o protocolo descrito acima. Dor articular foi medida escores de dor evocada (EPS) e comportamentos de dor espontânea medido com um dispositivo (ADWB) do rolamento de peso dinâmico avançado. Para efeitos do presente relatório, comparações individuais foram feitas usando testes t de Student. Para experiências onde doses analgésicas estão sendo comparados, ANOVA pode ser uma comparação estatística mais adequada.
EPS (a soma de lutas registrou mais vocalizações) aumentou com todos os três tipos de dor nas articulações (Figura 1). Medidas ADWB de peso percentual do rolamento no membro hind esquerdo em comparação com ratos ingênuos foram reduzidas em dor inflamatória aguda e crônica. Fêmeas, mas não os machos com crônica degenerativas articular dor (COL) mostraram reduções semelhantes nas medidas ADWB(Figura 2). Machos com dor articular inflamatória aguda transferido mais peso para os membros dianteiros do que animais de ingênuo. Peso-rolamento na patas dianteiras aumentadas em ratos fêmeas, em comparação com ingênua, mas não nos machos com dores articulares degenerativas crônicas (COL) (Figura 2B). Medidas ADWB de tempo por cento no membro afetado hind esquerdo diminuído em comparação com ingênua em ratos com dor inflamatória aguda e crônica, mas isto não foi estatisticamente significativa. Estes animais passou mesmo significativamente menos tempo o membro posterior esquerdo do que na extremidade direita do hind. Em machos e fêmeas com dor articular degenerativa crônica, não houve diferença no tempo gasto com os membros traseiros esquerdos, comparados a ingênua. Fêmeas com crônica dor articular degenerativa passado mais tempo no nonarthritic membro hind direito comparado a ingênua(Figura 3). Ratos com aguda inflamatórios comum dor e fêmeas com crônica dor articular degenerativa passado significativamente mais tempo sobre as patas dianteiras que ingênuo animais (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59024/59024fig1.jpg"> Figura 1 . Evocados escores de dor para a esquerda (coluna em azul) e direita (coluna vermelha) patas. Patas bem servido como controles internos e não sofreu quaisquer injecções de IA. Medidas foram feitas nas seguintes condições: uninjected ingênua (masculino e feminino), inflamatória induzida pela carragenina artrite aguda (carro), Complete inflamatória crônica artrite induzida por adjutor de Freund (CFA) crônica e não-inflamatórias Artrite induzida por colagenase (COL - masculino e feminino). Em animais ingênuo o EPS do joelho esquerdo traseiro não foi estatisticamente diferente da direita nos machos e apenas minimamente diferente nas fêmeas (* *P = 0,038) provavelmente devido a alguns aumento da resposta de dor no joelho examinado segundo (à esquerda) devido à dor de cruzamento resposta. Em todos os grupos de artrite do joelho esquerdo artrítico EPS foi significativamente maior do que o joelho direito contralateral nonarthritic. Ao comparar o EPS do joelho esquerdo de grupos de artrite a ingênua animais, todos os grupos de artrite tinham escores significativamente maiores de EPS no joelho esquerdo artrítico em comparação com joelhos esquerdo ingênuo. Isto era verdade em machos e fêmeas. P &lt; 0,05 em relação ao masculino ingênuo, #P &lt; 0,05 em relação ao feminino ingênuo. Todas as barras de erro são SEM em todas as figuras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59024/59024fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59024/59024fig2.jpg"> Figura 2 : Comportamento de dor espontânea medido pela porcentagem peso suportado cravarem. Comportamento de dor espontânea (A) medido pelo peso total do corpo por cento à esquerda (coluna em azul) e direita (coluna vermelha) patas. Em ambos os animais masculino e feminino ingênua, não houve nenhuma diferença significativa entre o peso percentual cargo sobre os membros traseiros esquerdos e direito. Camundongos machos com carro e CFA induzida dor nas articulações e as fêmeas com dor nas articulações COL induzida furo significativamente menos peso sobre o membro posterior esquerdo, em comparação com o ingênuo. P &lt; 0,05 em relação ao masculino ingênuo, #P &lt; 0,05 em relação ao feminino ingênuo. (B) comportamento de dor espontânea medido pelo peso total do corpo por cento colocado sobre as patas dianteiras. Em machos com carro induzido aguda dor nas articulações e as fêmeas com COL induzida crônica dor nas articulações, houve um aumento significativo na quantidade de peso suportado sobre as patas dianteiras. Isto não foi visto em machos com CFA ou COL induzida dor nas articulações. Ingênua fêmeas tendem a suportar mais peso sobre as patas dianteiras do que machos naïve (P = 0,02). Peso adicional pode ser cargo por outras partes do corpo como a cauda ou alcatra. Estes eram geralmente mínimas e não contribuiu significativamente para a compreensão da resposta a dor e, portanto, não são mostrados. P &lt; 0,05 em relação ao masculino ingênuo, #P &lt; 0.05 comparado para ingênuo feminino e masculino-semana 4 COL na carga do membro anterior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59024/59024fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59024/59024fig3.jpg"> Figura 3: comportamento de dor espontânea, medido pela porcentagem tempo gasto cravarem. Comportamento de dor espontânea (A) medido pelo tempo porcentagem total gasto na esquerda (coluna em azul) e direita (coluna vermelha) patas. Não houve significativa diferença entre direita e esquerdas membros posteriores em camundongos ingênuo masculino e feminino em relação ao tempo gasto no membro. Camundongos machos com carro e CFA induzida artrite apareceu para gastar menos tempo de carga com a artrítica membro hind esquerdo comparado a ingênua, mas isso não foi estatisticamente significativo e aumentou provável devido à variabilidade nesta medida nestes ratos. Houve uma diferença significativa nestes animais comparando a direita para a esquerda, como o membro posterior direito gastou mais de tempo total de carga que a esquerda. Em mulheres com artrite induzida de COL, o membro posterior direito foi carga uma maior proporção de tempo do que em fêmeas de ingênuo. P &lt; 0.05 comparar direito para esquerda, #P &lt; 0.05 comparado para ingênuo feminino e masculino-semana 4 COL no tempo gasto com patas dianteiras. (B) comportamento de dor espontânea medido pela quantidade total de tempo gasto com as patas dianteiras. Em machos com carro induzido artrite e fêmeas com artrite COL induzido os ratos passaram significativamente mais tempo carga nos membros dianteiros do que os animais de ingênuo. Ratos fêmea ingênuo passaram mais tempo sobre as patas dianteiras que animais masculino ingênuo. P &lt; 0,05 em relação ao masculino ingênuo, #P &lt; 0,05 em relação ao feminino ingênuo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59024/59024fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Desenvolvemos uma medida evocada da dor da artrite e, juntamente com um método padronizado para medir a dor espontânea em diferentes modelos de murino de artrite induzida quimicamente. Estas medidas são sensíveis e reprodutíveis para diferentes tipos de dor nas articulações.

Espontâneas e evocadas medidas de dor em modelos murino de dor no joelho monoarticulares

Pain is the main cause of disability from arthritis. There is currently an unmet need for adequate treatments for arthritis pain. Pre-clinical models are ...

A medição da dor em modelos pré-clínicos de artrite é difícil, mas é essencial para a avaliação de tratamentos regenerativos e analgésicos. Nosso protocolo é sensível e reprodutível para a medição de comportamentos de dor evocados e espontâneos. E é simples e relativamente barato.A artrite é o maior contribuinte para a incapacidade, e a dor é a principal causa de incapacidade. O tratamento da artrite é atualmente inadequado. Modelos pré-clínicos são uma parte importante do desenvolvimento do tratamento.Demonstrando este procedimento estarão Christopher Dorman, um técnico, e Sandra Frizelle, uma cientista do meu laboratório. Para evitar que a agulha seja inserida muito profundamente e saia da articulação posteriormente, cubra uma agulha de 5 polegadas com uma baia de tubos de polietileno até que apenas 2,5 milímetros da agulha se projetem para fora da baia. Em seguida, raspe a pele do joelho do camundongo anestesiado para ser injetado, e esterilize a pele exposta com esfoliação de iodo povidone.Em seguida, insira a agulha em bainha na articulação na linha média através do tendão patelar apenas inferior à borda inferior da patela, e injete a substância de interesse. Antes de avaliar a dor articular evocada, use um altímetro nível 4 para praticar a aplicação de 700 gramas de forças por centímetro quadrado de pressão consistente e firme. O dispositivo emitirá 4 bipes quando o nível de pressão apropriado for aplicado.Quando a pressão apropriada pode ser aplicada de forma confiável, esmague o mouse no pescoço com o dedo indicador e o polegar firmemente o suficiente para evitar movimentos casuais. E use o quarto e o quinto dedos para conter a cauda. O mouse deve ser capaz de fazer movimentos discretos e breves com esforço e quando estimulado, mas não deve ser capaz de se mover livremente ou continuamente.Administrar palpações firmes repetidas simultaneamente aos lados laterais e medial de cada joelho com o polegar e o dedo indicador da mão livre aproximadamente na linha articular uma vez por segundo durante 1 minuto. E que um observador conte o número de vezes que o animal vocaliza e luta para escapar da contenção durante este período de aplicação de pressão de 1 minuto. A soma das mordidas e vocalizações é considerada a Partitura de Dor Evocada.Abra o programa avançado de software de rolamento de peso dinâmico e selecione Mouses como o tipo de sensor. Antes de cada experimento, selecione a calibração completa"sob o menu de calibração. E digite zero"pelo valor tare.E o peso da almofada de espuma, placa de fibra de densidade média, béquer plástico e água como peso de calibração. Selecione o next"e o tare"E cubra a almofada do sensor com a almofada de espuma, placa de fibra de densidade média e béquer de água de plástico. Quando todos os materiais tiverem sido colocados na almofada do sensor, selecione a visualização de ganho"E ajuste o peso de calibração até que seja distribuído uniformemente pelos sensores individuais.Quando o valor do indicador de calibração estiver acima de noventa e cinco, selecione a definição de ganho"para produzir uma média normalizada para os sensores individuais e confirmar a integridade dos sensores. Em seguida, selecione o próximo"e salve o arquivo de calibração na pasta de calibração. Selecione novos"e digite o projeto e nomes de animais para o primeiro mouse a ser testado.Selecione procurar"e abra o arquivo de calibração criado para o projeto. Em seguida, selecione o próximo"confirmar que ativar a captura de vídeo" é selecionado e selecionar ok"Em seguida, pese o animal. Selecione a captura e grave o peso no software.Depois de selecionar ok"coloque o mouse na câmara por 5 minutos. E selecione o lançamento"O software gravará a atividade do animal, capturará um vídeo e sincronizará com os dados do sensor e dividirá automaticamente o vídeo em segmentos analisáveis e não analisáveis. No final do período de ensaio, selecione a configuração de pausa fácil e independente "E selecione avançar rapidamente" para passar para o primeiro segmento analisável.Se uma zona estável não tiver a pata correta identificada, segure o cursor sobre essa zona e pressione a tecla de atalho apropriada correspondente à parte correta do corpo. O software avançado de rolamento de peso dinâmico calculará automaticamente a porcentagem do tempo analisado e a porcentagem do peso corporal colocado em cada um dos 4 membros. Em seguida, selecione os resultados "exportar" e sim" para exportar as primeiras 5 linhas de dados sumários para o programa de planilha apropriado.Para cada animal adicional no mesmo grupo, selecione novo"e digite um nome animal único sem alterar o nome do projeto. Em seguida, capture a atividade de cada animal na câmara como apenas demonstrado. Escores de dor evocados para cuidados inflamatórios agudos- um gene-a artrite induzida, inflamatório crônico completo f-roy-nes add-jav-ent artrite induzida, e crônico não-inflamatório cole-ag-in-a induzido artrite aumenta sobre aqueles observados para animais ingênuos não injetados para todos os três tipos de dor articular.As fêmeas, mas não os machos com dor lombar degenerativa crônica, demonstram reduções semelhantes nas medidas de rolamento de peso dinâmico avançadas em comparação com camundongos ingênuos em dores articulares inflamatórias agudas e crônicas. Machos com dor articular inflamatória aguda transferem mais peso para os 4 membros do que animais ingênuos. A influência do peso nos 4 membros aumenta em camundongos fêmeas em comparação com animais ingênuos, mas não em machos com dor lombar degenerativa crônica.Tanto em machos quanto em fêmeas com dor lombar degenerativa crônica, não há diferença no tempo gasto nos membros traseiros esquerdos em comparação com animais ingênuos. E fêmeas com dor articular degenerativa crônica passam mais tempo no membro traseiro direito não artrítico em comparação com camundongos não injetados. Finalmente, camundongos machos com dor articular inflamatória aguda, e fêmeas com dor articular degenerativa crônica, gastam significativamente mais tempo em seus 4 membros do que animais ingênuos.A identificação correta do posterior dos pés do animal em relação ao seu corpo é muito importante. Concentre-se na parte posterior do animal ao invés da cabeça. Com este método, somos capazes de testar a afetividade de novos analgésicos inter-articular.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

A osteoartrite (OA), ou doença degenerativa das articulações, é uma condição debilitante associada a dor que permanece apenas parcialmente controlada por analgésicos disponíveis. Os modelos animais estão sendo desenvolvidos para melhorar a nossa compreensão dos mecanismos da dor relacionada com a OA. Aqui nós descrevemos a metodologia para o modelo monoiodoacetate de dor OA no mouse.

O Modelo Monoiodoacetate da osteoartrite Dor no mouse

Neste artigo nós fornecemos detalhes para os métodos de produção e controle de qualidade de uma proteína de fusão recombinante IL4-10. Também mostramos como testar a eficácia desta proteína para resolver a dor em um modelo do rato da dor inflamatória.

Desenvolvimento de proteínas recombinantes para tratar a dor crônica

Este estudo descreve o método de injeção intra-articular de mono-iodoacetato em ratos e discute os comportamentos relacionados à dor resultantes e as alterações histopatológicas, que fornecem referências para futuras aplicações.

Modelo de Dor da Osteoartrite Induzida pela Injeção Intra-Articular de Mono-Iodoacetato em Ratos

A cirurgia modificada é um método simplificado para o modelo de lesão nervosa poupada de camundongo ou rato que requer apenas uma ligadura e um corte para lesionar os nervos fibular e sural comuns.

Modelo de cirurgia de lesão nervosa poupada modificada de dor neuropática em camundongos

O ensaio mecânico de prevenção de conflitos é usado como uma leitura não reflexiva da sensibilidade à dor em camundongos que podem ser usados para entender melhor as respostas afetivas-motivacionais em uma variedade de modelos de dor de rato.

Ensaio mecânico de prevenção de conflitos para medir o comportamento da dor em camundongos

Para desenvolver novas intervenções terapêuticas para a prevenção e manejo da dor nas costas, modelos animais são necessários para examinar os mecanismos e a eficácia dessas terapias a partir de uma perspectiva translacional. O presente protocolo descreve o teste BMS, um método padronizado para avaliar a sensibilidade mecânica de retorno no rato.

Avaliação da Sensibilidade Mecânica das Costas no Rato para Investigação Mecanicista da Dor Lombar Crônica

Métodos para indução simples e rápida de um modelo de dor nas costas em camundongos são fornecidos aqui usando uma injeção intraligamentar de ativador de plasminogênio urinário.

Modelo de dor nas costas de camundongo induzido pelo ativador do plasminogênio do tipo uroquinase

A ligadura parcial do nervo ciático induz dor neuropática crônica de longa duração, caracterizada por respostas exageradas a estímulos térmicos e mecânicos. Este modelo murino de dor neuropática é comumente usado para estudar terapias inovadoras para o tratamento da dor. Este artigo descreve em detalhes o procedimento cirúrgico para melhorar a padronização e reprodutibilidade.

Ligadura parcial do nervo ciático: um modelo murino de dor neuropática crônica para estudar o efeito antinociceptivo de novas terapias

Aqui, apresentamos um modelo de dor inflamatória modificado com a injeção de carragenina de ambas as patas traseiras para avaliar o efeito analgésico.

Um modelo de dor inflamatória modificado para estudar o efeito analgésico em camundongos

Este protocolo descreve como a medição da força de mordida e do limiar de retirada da cabeça pode capturar o comportamento da dor na dor inflamatória da articulação temporomandibular (ATM) induzida por adjuvante de Freund completo (CFA).

Medição da dor na articulação temporomandibular por força de mordida e ensaios de filamento de von Frey em camundongos

O protocolo descreve como medir a hiperalgesia do joelho em camundongos. Mostramos exemplos em modelos de camundongos de dor aguda no joelho, bem como em modelos de osteoartrite (OA).

Avaliação da hiperalgesia do joelho em camundongos usando medição de aplicação de pressão

Aprenda a medir dor evocada e espontânea em modelos murinos de artrite monoarticular do joelho. Este protocolo sensível e reprodutível avalia tratamentos analgésicos e regenerativos em camundongos.

Espontâneas e evocadas medidas de dor em modelos murino de dor no joelho monoarticulares

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