Name: Um ensaio de Microneutralização do vírus sincicial respiratório (VSR) melhorada e alta taxa de transferência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda um ensaio de microneutralização por imagem para quantificar anticorpos neutralizantes contra o vírus sincicial respiratório (RSV) usando células A549. Este método de alta vazão é reprodutível e de baixo custo.

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Os autores agradecer todos os participantes envolvidos. Reconhecemos o programa de apoio de infra-estrutura operacional do governo vitoriano. LPC é um destinatário NHMRC Fellowship de desenvolvimento de carreira.

Nota: Todos os passos tem que ser executada em uma capa de BSL2, a menos que indicado de forma diferente. Titulação viral é necessária com antecedência um ensaio PRN para determinar a concentração ideal de RSV utilizada no ensaio de PRN. Recomenda-se alíquota as reservas de vírus em um pequeno volume que será descongelado uma vez e usado para cada ensaio de NAb. Também é recomendável utilizar o mesmo estoque viral para todos os ensaios de NAb realizados para todas as amostras de um estudo. Certifique-se de meios de cultura e tampão fosfato salino (PBS) é aquecido a 37 ° C antes de adicionar placas de célula.
1. RSV titulação Viral
Nota: Dependendo do número de reservas de vírus e o número de duplicatas, a placa de ensaio pode ser configurada de acordo com a Figura 1. Cada estoque de vírus deverá ser titulado em triplicado abaixo da placa de ensaio, começando com a mais alta concentração viral (ou seja, 01:10). Titulações seriais podem ser normalmente 01:10. Cultura de pilha A549 e manutenção, bem como o procedimento de cultura RSV é feito usando os procedimentos padrão e não estão incluídos neste protocolo.
<ol><li>Semeadura de placas (1 dia)
	<ol>
<li>Ressuspender as células A549 de Dulbecco Eagles modificado médio (DMEM) + 10% de soro fetal bezerro (FCS) + 1000 UI penicilina/estreptomicina (caneta/estreptococos) em 4 x 105/mL. Semente de 96 poços de fundo plano estéril placas com 100 μL/poço contendo células de 4 x 104 A459.</li>
		<li>Incubar as placas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO2 (células será no crescimento log-fase). Nota: Use o novo frasco de célula A549 após 23 passagens. É aconselhável não iniciar os experimentos quando um novo frasco de célula está ainda nas primeiro de três passagens.</li>
	</ol></li>
	<li>Infecção por vírus (dia 2)
	<ol>
<li>Preparação de diluição serial de vírus<ol>
<li>Descongele rapidamente um único frasco congelado do VRS em um banho de água de 37 ° C até quase completamente descongelados e coloque imediatamente no gelo. Prepare-se 3 repetições para cada RSV estoque de vírus para ser analisada, usar uma diluição de vírus inicial de 01:10 com 100 μL de vírus/bem diluído e reserve pelo menos uma coluna para o controle negativo. Nota: A Figura 1 mostra o controlo negativo em triplica.</li>
			<li>Adicionar 100 μL de cada vírus diluído em 01:10 em triplicado de linha A de um U-fundo de 96 poços placa estéril. Adicionar 90 μL/poço de DMEM + 1000 UI pen/estreptococo sem FCS para linhas B-H.</li>
			<li>Executar serial 01:10 diluições abaixo da placa através da transferência de 10 μL de linha A linha solução B. Mix por pipetagem conteúdo e descer 5 vezes e continuar as diluições dez vezes até linha H. descarte o final 10 μL, para que o volume final em cada bem é 90 μL. Nota: É importante usar novas dicas para cada diluição.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Inoculação do vírus às células A549
		<ol>
<li>Recupere cell plate(s) A549 preparado no dia anterior. Que sejam A549 monocamadas de células nas placas de 96 poços confluente de ~ 80%. Descarte a mídia por inversão suavemente a placa e mancha levemente na toalha de papel absorvente estéril.</li>
			<li>Lavar todos os poços com 100 μL de PBS duas vezes, descarte o excesso PBS por inversão suavemente a placa e mancha levemente na toalha de papel absorvente estéril depois de cada lavagem. Não permita que as placas secar.</li>
			<li>Transferi as diluições de vírus da placa de titulação viral (Figura 1) correspondente aos poços da placa de célula A549. Incube a placa por 1 h a 37 ° C, 5% de CO2. Após incubação de 1 h, decante sobrenadantes usando uma pipeta (para evitar contaminação cruzada). Tire 90 μL/poço.</li>
			<li>Adicionar 100 μL de médio 1 x 199 (M199, consulte tabela de materiais) + 1,5% sal de sódio de carboximetilcelulose (CMC) de baixa viscosidade + FCS 2% contendo caneta/estreptococo a cada poço. Nota: 2 x M199 + FCS 4% + caneta/inflamada de 2% e 3% soluções CMC precisam ser preparado com antecedência e armazenadas a 4 ° C para uso futuro. Certifique-se que a solução é aquecida a 37 ° C antes de adicionar a placas.<ol>
<li>Preparar a solução de x M199 2: 1 sachê/500 mL de água destilada água + 20 mL FCS + 10 mL caneta/estreptococo (para compensar 2 x MI99). Filtre a solução usando uma unidade de filtro de 0,22 μm.</li>
				<li>Para a preparação de 3%, CMC, adicione 15 g de CMC lentamente em 500 mL de água destilada. Dissolva o CMC na água usando aquecedor agitador metálico a 50 ° C, que leva cerca de 1h de preparação. Misture bem para fazer 3% CMC e autoclave a solução. Nota: O CMC sólido deve ser adicionado à água para ser dissolvido; adição de água para o sólido seco produz uma "moita" de sólido que é muito difícil de dissolver.</li>
				<li>Preparar 1 x M199 + baixa viscosidade CMC de 1,5% + 2% FCS contendo caneta/inflamada pela mistura 1:1 a 2 x M199 e 3% CMC preparado na etapa 1.2.2.4.2.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Incube a placa por 3 dias a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Desenvolvimento de placa de ensaio e análise (dia 5)
	<ol>
<li>Fixação e desenvolvimento do ensaio placa<ol>
<li>Descarte o M199 + CMC + 2% FCS contendo caneta/inflamada por inversão suavemente a placa. Adicionar lentamente (para evitar perturbar a camada de células) 200 μL de tampão de fixação (acetona 80%, 20% de PBS, armazenado a-20 ° C) para reparar as células. Incube a-20 º C por 20 min.</li>
			<li>Descartar o buffer de fixação e borre-se suavemente na toalha de papel absorvente. Deixar o rosto de placa até secar durante 10 min. Nota: Desta etapa em diante, o ensaio pode ser executado fora do capô BSL2.</li>
			<li>Preparar a solução bloqueio diluente de 5% leite em filtrado PBS contendo 0,05% polissorbato 20 (PBS-Polissorbato, consulte Tabela de materiais). Para um prato, calcular o volume necessário para bloqueio baseado em 200/bem e 110 poços: 200/poço x 110 poços = 22 mL (1,1 mL concentrado leite diluente em 20,9 mL filtrados polisorbato-PBS). Nesta fase, também compõem a solução bloqueio suficiente para anticorpos primários e secundários. Para um prato, calcular o volume necessário para cada solução de anticorpo baseada em poços/50 e 110: 50/bem x 110 poços = 5,5 mL. Portanto, o volume total de diluente de leite que obstrui a solução necessária para um ensaio de placa única é 33 mL.</li>
			<li>Adicione 200 pois da solução de bloqueio. Incubar a placa à temperatura ambiente (RT) por 30 min. descarte a solução invertendo-se suavemente a placa e borre na toalha de papel absorvente.</li>
			<li>Prepare 1: 500 anticorpos de cabra X RSV (mAb – anticorpo primário) diluído em solução de bloqueio. Adicionar 50 pois da solução mAb e incubar a 37 ° C por 1 h. placa de lavagem 3 vezes com PBS-Polissorbato filtrada.</li>
			<li>Prepare 1:5,000 burro de Alexa Fluor anti-cabra IgG (anticorpo secundário) diluído em solução de bloqueio. Adicionar 50 pois da solução anticorpo secundário e incubar a 37 ° C por 1 h. placa de lavagem 5 vezes com PBS-Polissorbato filtrada.</li>
			<li>Leia a placa em um leitor de pontos automatizados usando o canal de fluoresceína isotiocianato (FITC) e contar as configurações, conforme mostrado na Figura 2. Embrulhe o prato em folha e armazenar a 4 ° C. Calibre o instrumento, usando uma placa de cultura de 96 poços não utilizadas e introduzir as configurações de contagem antes do ensaio. Nota: Re-digitalização dentro de alguns dias é possível, se necessário. A calibração e ajuste de contagem podem ser salvos e usados para a verificação futura, caso o ensaio utiliza o mesmo tipo de placa utilizada para a calibração.</li>
			<li>Verifique as imagens dos poços para placas de artefato ou monocamadas de células rompidas (Figura 3). Exclua poços com monocamadas de células rompidas. Nota: Dependendo do tamanho das placas artefacto, contagem manual pode precisar de ser executadas para os poços ou daqueles poços podem precisar ser descartado da análise de dados. Critérios para um resultado válido incluem placas de monocamada ou artefato sem células rompidas detectadas em replicar mais de um bem e não PFU detectado em negativos wells (poços sem vírus adicionado).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Determinar as concentrações virais
		<ol>
<li>Escolha as últimas duas diluições onde manchas podem ser contadas claramente. Calcule o número médio de pontos de replicar poços na mesma diluição. Calcule o título viral (PFU / mL) da amostra ações usando a fórmula abaixo: PFU/mL = número médio de placas / (× fator de diluição Volume de vírus diluído adicionado ao poço) Nota: A concentração de vírus determinada para cada unidade populacional RSV agora pode ser usada no ensaio de PRN (etapa 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. RSV neutralização ensaio
<ol><li>
Semeadura de placas (1 dia)
	<ol>
<li>Resuspenda A549 células em DMEM + 10% FCS + 1000 UI pen/estreptococo em /mL de 4 x 105. Semente de 96 poços de fundo plano estéril placas com 100 μL/poço contendo 4 x 104 A459 células e incubar as placas durante a noite a 37 ° C, 5% de CO2 (células será no crescimento log-fase). Nota: Use o novo frasco de célula A549 após 23 passagens. Não é recomendável usar células A549 antes do número de passagem 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de soro e vírus (dia 2) Nota: Dependendo do tipo de amostra, existem etapas necessárias para amostras de pré-processamento antes do ensaio de NAb. É recomendável usar o RSV internacional padrão sera que agora está disponível mediante pedido do Instituto Nacional de padrões biológicos e controles (NIBSC).<ol>
<li>
Preparação da diluição do soro
		<ol>
<li>Descongelar o soro de referência RSV humano (soro de referência, REF) e soro teste amostras em RT. Heat-inativar amostras de soro e referência anti-soro num banho de água a 56 ° C durante 30 min antes de usar. Prepare diluições de acordo com o modelo da placa (Figura 4).</li>
			<li>Preparar a diluição 1: 100 a REF. Prepare um mínimo de 110 μL de REF diluído em DMEM + caneta/estreptococo sem FCS por placa de ensaio (por exemplo,, 1,5 μL de REF em um volume total de 150 μL). Adicionar 110 μL de 1: 100 diluído REF em A12 bem de um U-fundo de 96 poços placa estéril.</li>
			<li>Adicione 55 μL de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS poços B12 para H12 na coluna 12. Execute a série diluições de 1:2 para baixo a placa Transferindo 55 μL de linha A linha B, misturando a solução por pipetagem conteúdo e descer 5 vezes e continua até a linha H. Discard o final 55 μL de mídia para que o volume final em cada bem é 55 μL. Use novas dicas para cada diluição.</li>
			<li>Prepare a diluição de 1: 100 de soro teste amostras. Como todas as amostras de soro são doseadas em triplicado, preparar um volume mínimo de 110 μL/poço x 3 = 330 μL por amostra de soro.</li>
			<li>Adicionar 110 μL de cada amostra de soro diluído (1: 100; S1 = soro 1, S2 = soro 2, etc.) para poços correspondentes A1 A9 e também E1 a E9 da placa de 96 poços estéril, de acordo com a Figura 4.</li>
			<li>Adicionar 55 μL de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS para todos os poços rotulados X. Perform serial diluições de 1:2, conforme passo 2.2.1.3 até linha D (para amostras 1, 2 e 3). Descarte o final 55 μL de mídia para que o volume final em cada poço é 55 μL. Da mesma forma, executar o serial diluições de 1:2 para amostras 4, 5 e 6 para linhas E-H. Nota: É importante usar novas dicas para cada diluição.</li>
			<li>Adicione 55 μL de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS poços nas colunas 10 e 11.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preparação do vírus
		<ol>
<li>Descongele rapidamente um único frasco congelado do VRS em um banho de água de 37 ° C até quase completamente descongelados e coloque imediatamente no gelo.</li>
			<li>Dilua o vírus em DMEM + caneta/estreptococo sem FCS baseada na concentração da alíquota RSV determinada na etapa 1.3.2. Aplica uma diluição que dá aproximadamente 200 PFU/bem. Preparamos um volume total de 5,5 mL (100 poços).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preparação da mistura de soro e vírus
		<ol>
<li>Adicione 55 do vírus diluído para todos os poços de colunas 1-9 e poços de linhas E-H de colunas 10 e 11 (controle positivo), de acordo com o modelo da placa (Figura 4).</li>
			<li>Adicione 55 de DMEM + caneta/estreptococo sem FCS para todos os poços de linhas A-D de colunas 10 e 11 (controle negativo). Incube a placa por 1 h a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Inoculação do vírus às células A549
		<ol>
<li>Antes da conclusão do período de incubação, recupere A549 cell plate(s) preparado na etapa 2.1.1. Que sejam A549 monocamadas de células nas placas de 96 poços confluente de ~ 80%.</li>
			<li>Descarte a mídia por inversão suavemente a placa e mancha levemente na toalha de papel absorvente estéril. Lavar todos os poços com 100 μL de PBS duas vezes, descarte o excesso PBS por inversão suavemente a placa e mancha levemente na toalha de papel absorvente estéril depois de cada lavagem. Não permita que as placas secar.</li>
			<li>Transferi 100 pois da mistura de soro e vírus aos poços correspondentes na placa de célula A549, seguindo o modelo de placa incubar a placa por 1 h a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
			<li>Depois de 1h, usando uma pipeta, retirar 90/bem e adicionar 100 de pré-aquecido 1 x M199 + 1,5% CMC FCS 2% + caneta/estreptococos. Incube a placa por 3 dias a 37 ° C, 5% de CO2. Nota: Certifique-se que a solução é aquecida a 37 ° C antes de adicionar a placas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Desenvolvimento de placa de ensaio e análise (dia 5)
	<ol>
<li>Desenvolva a placa de fixação e ensaio seguindo passos 1.3.1.1 para 1.3.1.8.</li>
		<li>Determinar o título de neutralização de 50%<ol>
<li>Determine que o título de neutralização de 50%, calculando a distância proporcional entre as diluições do soro recíproca acima e abaixo de 50% do controle 'sem soro' poços (controle positivo vírus - coluna 10, linhas E-H).</li>
			<li>Contar o número de PFU (ou seja, placas) decorrentes de infecções virais individuais em poços de soro e não poços de controle do soro. Calcular o número médio de PFU dos poços sem controle de soro e determinar o valor de 50%.</li>
			<li>Identifica as diluições do soro com contagens que são imediatamente acima e abaixo do valor de 50% dos poços sem controle de soro. Usando um gráfico log semi ou modelo de planilha, plotar o número de PFU sobre o eixo x (escala linear) e a diluição do soro recíproca no eixo y (escala de log10 ). Traçar uma linha entre os dois pontos e ler os títulos de neutralização de 50% do teste de amostras de soro desta linha. Nota: A planilha de ensaio RSV PRN (Planilha complementar) é usada para determinar o título de neutralização de 50%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015%3A+a+systematic+review+and+modelling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li>
<li>Modjarrad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+consultation+on+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine+Development+Report+from+a+World+Health+Organization+Meeting+held+on+23-24+March+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015.</a> Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).</li>
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<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+neutralizing+serum+antibodies+of+patients+vaccinated+with+human+papillomavirus+L1+or+L2-based+immunogens+using+furin-cleaved+HPV+Pseudovirions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions.</a> PLoS One. 9 (7), e101576(2014).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Temos desenvolvido e aperfeiçoado um ensaio de microneutralização RSV simples e eficiente que pode ser facilmente adaptado na maioria dos laboratórios. Este ensaio é capaz de medir a capacidade de infecção viral, bem como a inibição da infecção viral por NAb a nível celular, usando a varredura de imagem computadorizada de medição. A utilização de uma plataforma baseada em imagem latente e sistemas baseados em anticorpos específicos aumentou a especificidade e a sensibilidade da deteção ponto comparada com placa tradicion...

Vírus sincicial respiratório (VSR) é a principal causa de infecções do trato respiratório inferior na população pediátrica em todo o mundo1. Apesar de sua alta carga, não há ainda nenhuma vacina ou tratamento disponível. Desde 2013, a Organização Mundial de saúde (OMS) declarou-se desenvolvimento de vacina RSV como uma prioridade de pesquisa principais, com anual WHO consulta reuniões2,3. A OMS chegou a acordo sobre uso de RSV neutralizando a medição de anticorpo (NAb) para monitorar a imunogenicidade da vacina, como isto é reconhecido como o principal marcador serológico de proteção4. NAbs foram mostrados para proteger contra uma grave infecção pelo VSR em um número de estudos, bem como ensaios clínicos do palivizumab anti-VRS monoclonal anticorpo, atualmente a estratégia profilática apenas disponível4.
Existem vários formatos de ensaio NAb usados pelos laboratórios em todo o mundo, incluindo ensaios baseados em molecular e celular, que têm feito esforços de padronização desafiando5,6,7,8. No entanto, o ensaio de neutralização (PRN) placa convencional-redução que mede o número de placa reduzida, formando unidades (PFU) pela presença de um anticorpo específico RSV continua a ser o padrão-ouro9. Aqui, nós relatamos um protocolo PRN melhorado, simplificado e alta produtividade que pode ser usado em inúmeras linhas de célula, por diferentes cepas de RSV e com taxa de transferência maior do ensaio. Este protocolo foi testado usando amostras clínicas de diferentes configurações, bem como em amostras de experiências modelo animal.

<table><tbody><tr><td><forte>Linhagem celular</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>fornecido pelo Dr. Keith Chappell, Universidade de Queensland</td></tr><tr><td><forte>Cepas virais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RSV A2</td><td>ATCC</td><td>VR-1540</td><td>número de lote 60430286</td></tr><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Merck</td><td>1000142511</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor burro anti-cabra IgG (armazenado a 4 &deg; C)</td> <td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>CMC sal de sódio em pó</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (sem soro, 3,7 g / L NaHC, P / S) (armazenado a 4 &deg; C)</td> <td>Serviços Científicos &ndash; Cultura de tecidos</td><td></td><td>MCRI em casa fornecimento</td></tr><tr><td>de soro fetal de bezerro (armazenado em alíquotas de 50 mL a -20 &deg; C)</td> <td>Interpath</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>Cabra X anticorpo RSV</td><td>Merck</td><td>AB1128</td><td></td></tr><tr><td>anti-soro policlonal humano para vírus sincicial respiratório (RSV) (armazenado em 45 &micro; L alíquotas em -20 &deg; C)</td> <td>BEI Resources</td><td>NR-4022</td><td>Pedido gratuito através do BEI Resources mediante registro. Este soro pertence a um painel de anti-soro humano e imunoglobulina ao VSR (NR-32832)</td></tr> <tr><td>M199 pó</td><td>Life Technologies</td><td>31100035</td><td></td></tr><tr><td>Solução de bloqueio de diluente de leite (armazenada a 4 &graus; C)</td> <td>Australian Biosearch</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina (armazenada em alíquotas de 6mL a -20 &deg; C)</td> <td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>s.d.H2O do dispensador Milli-Q</td><td>Merck</td><td></td><td>Dispensação interna</td></tr><tr><td>Estéril 1x PBS para cultura (armazenado a 4 &deg; C)</td> <td>Serviços Científicos &ndash; Cultura de tecidos</td><td></td><td>MCRI em fornecimento interno</td></tr><tr><td>Tween 20 polissorbato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Consumíveis Gerais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon cônicos (50 mL)</td><td>Invitro Technologies</td><td>FAL352070</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de filtro 0,22 &mu; m (500 mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>NAL5660020</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf estéreis (1,5 mL)</td><td>Austrália PL</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Placas estéreis de fundo plano (96 poços com tampa)</td><td>Interpath</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Placas estéreis de fundo em U (96 poços com tampa)</td><td>Interpath</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4487-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 10 mL</td><td>Interpath</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 25 mL</td><td>Pipeta de ponta Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251-200EA</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &micro; L Clear Maxymum Recovery Racked Pré-esterilizado 10RACKS x 96TIPS PKG960</td><td>Pipeta de Ponta Fisher Biotec</td><td>TF-200-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>5-20 &micro; L Clear Maxymum Recovery Racked Pré-esterilizado 10RACKS x 96TIPS PKG960</td><td>Pipeta de Ponta Fisher Biotec</td><td>TF-20-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>100-1,000 &micro; LClear Maxymum Recovery Racked Pré-esterilizado 10RACKS x 100TIPS PKG1000</td> Pipeta de Ponta <td>Fisher Biotec</td><td>TF-1000-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>1-10 &micro; L Clear Maxymum Recovery Racked Pré-esterilizado 10RACKS x 100TIPS PKG1001</td><td>Fisher Biotec</td><td>TXLF-10-LRS</td><td></td></tr><tr><td>Equipamentos e softwares</td>Sistema leitor ELISpot <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Estrasburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software AID ELISpot versão 5.0</td><td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Estrasburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2007</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio de microneutralização do vírus sincicial respiratório (vsr) melhorada e alta taxa de transferência

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

Respiratórios sincicial vírus específicos anticorpos neutralizantes (RSV NAbs) são um importante marcador de proteção contra RSV. Um número de formatos diferentes de ensaio está atualmente em uso em todo o mundo para que haja a necessidade de um método de precisão e alta produtividade para medir RSV NAbs. Descrevemos aqui um ensaio de microneutralização com base em imagem que foi testado no subgrupo RSV A e também pode ser adaptado para o subgrupo RSV B e tipos de amostras diferentes. Este método é altamente reprodutível, com variações inter-ensaio para o soro de referência, sendo menos de 10%. Acreditamos que este ensaio pode ser prontamente estabelecido em muitos laboratórios em todo o mundo a um custo relativamente baixo. Desenvolvimento de um ensaio melhorado, elevado-throughput que mede RSV NAbs representa um significativo passo em frente para a padronização deste método internacionalmente, bem como sendo fundamental para a avaliação dos candidatos de vacina RSV romance no futuro.

A titulação de um estoque de vírus foi realizada de 01:10 para 01:108 diluição para determinar a concentração de vírus estoque antes do ensaio do PRN (representante resultados mostrados na Figura 5). Da Figura 5, PFU pode ser contada de forma confiável em diluições de 01:104 e 01:105. Foi calculado o número médio de PFU de três vias poços na mesma diluição. Desde o número médio de pontos às 01:10<...

Este estudo descreve um alto throughput, com base em imagens de ensaio de microneutralização para determinar o título de anticorpos neutralizantes específicos para o vírus sincicial respiratório (VSR). Este formato de ensaio foi testado em tipos diferentes de amostra.

Um ensaio de Microneutralização do vírus sincicial respiratório (VSR) melhorada e alta taxa de transferência

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...

Há necessidade de um método preciso e de alto rendimento para medir anticorpos neutralizantes RSV, como um importante marcador de proteção contra vírus sincicial respiratório. Este método é altamente reproduzível com variações entre ensaios para o antiserum de referência sendo inferior a 10% Acreditamos que este ensaio pode ser facilmente estabelecido em muitos laboratórios em todo o mundo a um custo relativamente baixo. Descrevemos aqui um ensaio de micro-neutralização baseado em imagem que foi testado no subgrupo A do RSV, e também pode ser adaptado para o subgrupo B RSV e diferentes tipos de amostras.O procedimento será Reuben Tse, membro da equipe de pesquisa do MCRI. Para as placas de sementes no primeiro dia, primeiro resuspende células A549 em mídia DMEM, com 10% FCS e 1.000 unidades Mistura penicilina-estreptomicina a uma concentração de 400.000 células por mililitro. Em seguida, sementes 96-bem flat-bottom placas estéreis com 40.000 células A459 a uma densidade de 100 microliters por poço.Incubar a placa a 37 graus Celsius em ambiente de dióxido de carbono de 5% durante a noite. Para preparar a diluição do soro no segundo dia, descongele primeiro as amostras de soro de referência e soro humanos a temperatura ambiente. Em seguida, coloque-os em um banho de água a 56 graus Celsius por 30 minutos para aquecê-los e ativá-los.Em seguida, prepare mais de 110 microliters de uma diluição de um a 100 do soro de referência misturando 1,5 microliters do soro de referência com mídia DMEM livre de FCS com mistura penicilina-estreptomicina a um volume final de 150 microliters. Pipeta 110 microliters desta diluição em bem A12 de uma placa estéril de fundo U de 96 poços. Para fazer diluições de série de um a duas na placa, adicione primeiro 55 microliters de mídia DMEM livre de FCS com mistura penicilina-estreptomicina aos poços B12 a H12.Em seguida, com uma nova transferência de ponta 55 microliters de bem A12 para bem B12. Pipeta para cima e para baixo cinco vezes para misturar a solução, e continuar até chegar bem H12. Pipeta fora do excesso de 55 microliters da solução do poço H12.Em seguida, prepare uma diluição de 1 a 100 amostras de teste de soro e adicione 110 microliters de cada diluição aos poços correspondentes A1 a A9 e E1 a E9 da placa estéril de 96 poços. Em seguida, adicione 55 microliters de mídia DMEM livre de FCS com mistura penicilina-estreptomicina a poços nas colunas de um a nove. Faça diluições de série de um a dois da linha A para a linha D e da linha E para a linha H como descrito anteriormente.Adicione 55 microliters de mídia DMEM livre de FCS com mistura penicilina-estreptomicina a poços nas colunas 10 e 11. Para preparar o estoque do vírus, primeiro coloque um frasco congelado de RSV em um banho de água de 37 graus Celsius para descongelá-lo rapidamente, em seguida, coloque o frasco no gelo. Em seguida, adicione o vírus à mídia DMEM contendo mistura penicilina-estreptomicina a aproximadamente 200 PFU por poço para fazer um volume total de 55 mililitros para 100 poços.Para preparar a mistura de soro do vírus, adicione primeiro 55 microliters do vírus diluído a todos os poços de colunas de uma a nove e poços de linhas E a H das colunas 10 e 11. Em seguida, adicione 55 microliters de mídia DMEM livre de FCS com mistura penicilina-estreptomicina a todos os poços das linhas A a D das colunas 10 e 11, e incubar a placa a 37 graus Celsius em ambiente de dióxido de carbono de 5% por uma hora. Antes da inoculação de células A549 com RSV, examine a placa celular sob um microscópio leve para confirmar que as monocamadas celulares A549 são 80% confluentes.Em seguida, inverta a placa suavemente para descartar a mídia, e levemente borrar a placa em uma toalha de papel absorvente estéril. Depois de cada um, lave com PBS estéril filtrado. Em seguida, adicione 100 microliters por poço da mistura de soro do vírus aos poços correspondentes na placa celular A549 de acordo com o modelo de placa fornecido no manuscrito, e incubar a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por uma hora.Ao final da incubação, use uma pipeta para remover 90 microliters por poço, e adicione 100 microliters da mídia contendo 1XM199, 1,5% CMC e 2% FCS na mistura Penicilina-Estreptomicina. Incubar a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por três dias. Para corrigir e desenvolver uma placa de ensaio, primeiro inverta a placa celular A549 infectada pelo RSV suavemente para descartar a mídia que contém M199, CMC, 2%FCS e penicilina-estreptomicina.Em seguida, adicione lentamente 200 microliters de Buffer de Fixação a cada poço. Incubar a placa a menos 20 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, descarte o tampão de fixação e limpe suavemente uma toalha de papel absorvente.Deixe a placa de frente para baixo para secar por 10 minutos. Em seguida, com tampão PBS filtrado contendo 05 polisorbato 20, faça 5% de solução de bloqueio de leite. Adicione 200 microliters da solução de bloqueio a cada poço e incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos.No final da incubação inverta a placa suavemente para descartar a solução e borrar em uma toalha de papel absorvente. Para fazer o anticorpo primário, diluir um a 500 anticorpos XRSV de cabra na solução de bloqueio. Adicione 50 microliters a cada poço e incubar a placa a 37 graus Celsius por uma hora.Lave a placa três vezes com PBS-polisorbate filtrado. Em seguida, faça o anticorpo secundário diluindo de um a 5.000 Alexa Fluor anti-cabra imunoglobulina G na solução de bloqueio. Adicione 50 microliters a cada poço e incubar a 37 graus Celsius por uma hora.Lave a placa cinco vezes com PBS-polisorbate filtrado. Para contar placas com um leitor de pontos automatizado, primeiro use uma placa de cultura de 96 poços não utilizado para colaborar com o instrumento inserindo as configurações de contagem no canal FITC. Em seguida, leia a placa celular, enrole-a em papel alumínio, e armazene-a a quatro graus Celsius.Em seguida, verifique as imagens de poços para placas artefatosas ou monocamadas celulares rompidas, e exclua poços com monocamadas de células rompidas. O número médio de placas dos poços de controle sem soro foi calculado e utilizado para determinar o corte de neutralização de 50% que resultaria em 50% de inibição da atividade do vírus. A diluição recíproca do soro foi traçada no eixo x e o número de placas no eixo y de um gráfico semi-log de uma linha traçada entre os dois pontos.Os títulos de neutralização de 50% das amostras de soro de teste foram diluições vermelhas e séricos com contagens imediatamente acima ou abaixo do valor de 50% dos poços de controle sem soro foram identificados. Ensaios da RSVAPRN em duas coortes adultas diferentes da Gâmbia e voluntários saudáveis em Melbourne resultaram em adultos gambianos com uma média menor de 100 medíois em comparação com os adultos de Melbourne. O soro de referência rsv humano mostrado demonstra uma variabilidade muito baixa com o coeficiente de variação de 6,82%Este ensaio de neutralização de redução de placa RSV de alto rendimento pode ser facilmente implementado em muitos laboratórios, e apoiará o esforço internacional de harmonização da OMS para ensaios de anticorpos neutralizantes RSV.Isso será fundamental para a avaliação dos novos candidatos à vacina RSV no futuro.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este protocolo descreve um procedimento geral para o estudo de ligação aos receptores recombinantes de domínio (RBD) com base em vacinas de subunidade contra a SARS. Ele inclui métodos para transfecção e expressão da proteína em células RBD 293T, a imunização de camundongos com RBD e detecção de atividade de neutralização dos soros do mouse usando um ensaio de neutralização estabelecida SARS pseudovirus.

Protocolo para vacinas recombinantes RBD baseado SARS: Preparação de proteínas, Vacinação Animal e Detecção de Neutralização

Este vídeo demonstra um ensaio para medir anticorpos neutralizantes contra o vírus sincicial respiratório (VSR). A pré-incubação com soro contendo anticorpos neutralizantes do VSR neutraliza as partículas virais, reduzindo a infecção celular e a formação de placas. As células infectadas por vírus são então submetidas à fixação, bloqueio e marcação de anticorpos conjugados com fluoróforo para visualização da placa. Esse processo permite a identificação da maior diluição sérica que neutraliza...

Um ensaio para medir o título de anticorpos neutralizantes específico para o vírus sincicial respiratório

O vírus sincicial respiratório humano (HRSV) pode causar bronquiolite grave em lactentes pequenos. Parte da patogênese da doença grave por HRSV é causada pela resposta imune do hospedeiro. A estimulação de células imunes humanas primárias com HRSV fornece um sistema modelo rápido e reprodutível para estudar a ativação de vias inflamatórias e infecções.

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Este estudo descreve uma   -Imagem baseada ensaio de micro-neutralização para analisar as relações antigênicas entre vírus. O protocolo emprega um digitalizador de mesa e tem quatro passos, incluindo titulação, a quantificação de titulação, neutralização, e quantificação de neutralização. O ensaio funciona bem com pdm09 corrente circulante vírus influenza A (H1N1), A (H3N2), e B vírus.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

Nós descrevemos um método para gerar e amplificar geneticamente modificado vírus sincicial respiratórios (RSVs) e um ensaio de placa otimizado para RSVs. Ilustramos este protocolo criando dois vírus recombinantes que respectivamente permitem quantificação de replicação RSV e análise de corpos de inclusão RSV e grânulos associada a corpos de inclusão dinâmica de viver.

Geração, amplificação e titulação do vírus sincicial respiratórios recombinantes

Para uma análise mecanicista aprofundada da síntese de RNA do vírus sincicial respiratório (RSV), relatamos um protocolo de utilização da fosfoproteína acompanhante (P) para coexpressão da nucleoproteína livre de RNA (N0) para posterior montagem in vitro dos nucleocapsídeos específicos do vírus (NCs).

Geração e montagem de nucleocapsídeos específicos do vírus do vírus sincicial respiratório

O protocolo descrito aqui descreve um método rápido e eficaz para medir anticorpos neutralizantes contra a proteína de pico SARS-CoV-2, avaliando a capacidade de amostras de soro convalescente para inibir a infecção por um vírus de estomatite vesicular rotulado por proteína verde aumentada com pseudotipto de glicoproteína.

Detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 usando imagens fluorescentes de alto rendimento da infecção por pseudovírus

Um sistema de análise de fluxo para ensaios multiplexados baseados em contas que fornece uma leitura de dois repórteres foi usado para o desenvolvimento de ensaios sorológicos e de neutralização de anticorpos multiplex que podem medir simultaneamente anticorpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.

Um teste de neutralização rápido e multiplex dual reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 para um sistema de análise de fluxo baseado em contas multiplexadas

Um protocolo de laboratório abrangente e um fluxo de trabalho de análise são descritos para um ensaio rápido, econômico e simples baseado em células coloridas para detectar elementos neutralizantes contra o AAV6.

Um método passo-a-passo para detectar anticorpos neutralizantes contra a AAV usando um ensaio baseado em células coloridas

Vírus pseudotipados (PVs) são virions defeituosos de replicação que são usados para estudar interações vírus-hospedeiro em condições mais seguras do que manusear vírus autênticos. Apresentado aqui é um protocolo detalhado que mostra como os PVs SARS-CoV-2 podem ser usados para testar a capacidade de neutralização do soro dos pacientes após a vacinação COVID-19.

Vírus pseudotipados como uma ferramenta molecular para monitorar respostas imunes humorais contra SARS-CoV-2 via ensaio de neutralização

Aprenda um ensaio de microneutralização por imagem para quantificar anticorpos neutralizantes contra o vírus sincicial respiratório (RSV) usando células A549. Este método de alta vazão é reprodutível e de baixo custo.

Um ensaio de Microneutralização do vírus sincicial respiratório (VSR) melhorada e alta taxa de transferência

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