Medição da remodelagem óssea e recriação do microambiente tumor-osso usando a cocultura da Calvaria e a histomormormetria
14 de março de 2020
A cultura ex vivo de explantas ósseas pode ser uma ferramenta valiosa para o estudo da fisiologia óssea e a avaliação potencial de medicamentos na remodelagem óssea e doenças ósseas. O protocolo apresentado descreve a preparação e a cultura de calvarias isoladas de crânios de camundongos recém-nascidos, bem como suas aplicações.
O objetivo deste procedimento é ter um modelo ex vivo para avaliar a remodelagem óssea e recriar o microambiente tumor-ósseo utilizando cultura calvária ou co-cultura com células cancerosas. A maior parte da técnica de calvária é um sistema de cultura de órgãos que utiliza ossos de calvaria de camundongos neonatais para avaliar a remodelagem óssea. Você pode testar o potencial terapêutico de moléculas diversas, ou até mesmo recriar o microambiente tumoral ósseo quando você usa co-culturas com células cancerosas.
Tudo isso em um ensaio simples e fácil em pouco tempo e baixo custo. O objetivo desta técnica é ter uma ferramenta para avaliar a regeneração óssea no microambiente ósseo do câncer, utilizando um modelo ex vivo de cultura de órgãos calvariais de camundongos. Primeiro, selecione um filhote de rato e coloque-o sob o capô.
Usamos calvaria de filhotes de rato de cinco a sete dias. Pegue a cabeça com a seringa, corte a pele e limpe a área do couro cabeludo o suficiente para dissecar a calvaria. Identifique as suturas do crânio, sagital, coronal e lambdoides.
Faça um corte reto ao longo das suturas lambdoid, para cerca do nível do olho. Corte de cada lado, das suturas lambdoid em direção à sutura coronal. No ângulo de 45, faça outro corte para conectar a extremidade do corte feito com o corte do fontanel anterior.
É extremamente importante definir as suturas do crânio, sagital, frontal, coronal, lambdoide, para garantir a inclusão correta do tecido e análise histologia. Com boas pontas fórceps, retire a calvaria e coloque-a em uma tampa de placa de Petri. Com um bisturi, faça um corte reto do fontanel posterior ao longo da sutura sagital através da sutura coronal.
Duas hemicalvarias são obtidas. Pegue cada calvaria com os fórceps, e coloque-os em uma nova placa de Petri com PBS. Para a cultura, coloque a hemicalvaria em uma placa de cultura tecidual de 24 poços, contendo um mililitro de mídia, e incubar por 24 horas a 37 graus.
Também podemos usar culturas primárias de calvária para reproduzir o microambiente tumor-ósseo para resorção óssea. Para isso, co-cultura calvarias com células cancerosas, ou com mídia condicionada de células cancerosas. 24 horas depois, remova a mídia e substitua-a por mídia contendo o tratamento que você gostaria de testar.
Se você deseja avaliar as células cancerígenas e as interações ósseas, ou recriar o microambiente tumor-ósseo, passe a calvaria para uma placa de apego celular baixa, para evitar a fixação das células cancerosas à placa. Tentepsinizar as células cancerígenas, contá-las, e colocá-las cuidadosamente no topo da hemicalvaria. Você também pode usar mídia condicional de células cancerosas, e usá-la para incubar a hemicalvaria.
Incubar por seis a sete dias a 37 graus, com 5% de CO2. No terceiro dia, mude a mídia e continue incubando. O número de células que usam na cocultura depende da linha celular do câncer.
Você precisa, primeiro, otimizar o número de células que é necessário para induzir uma resposta em uma. Após a cultura, a calvária passa por um processo de fixação, descalcificação e parafina incorporada. Além disso, os tecidos são seccionados em um microtome, manchados, e a análise histomorfométrica é realizada.
A inclusão da calvaria pode ser complicada. Para garantir que o tecido esteja protegido durante a inclusão, você pode colocar o tecido entre esponjas ou usar um papel de tecido ou outro papel absorvente antes de colocá-lo no. Para o processamento de tecidos, enrole a hemicalvaria em papel de tecido.
Em seguida, coloque-o em um de incorporação, e fixe em tampão neutro em formalina, por 24 horas a quatro graus. Para decalcificar a calvaria, coloque o em um EDTA de 10% por 48 horas a quatro graus. Processe as fitas de tecido com a hemicalvaria em um processador automático de tecido.
Siga um ciclo regular de rotação do dia, então, inclua em parafina. Para secção, corte quatro seções micromáticas com um microtome, monte as seções em lâminas de microscópio de vidro e manche com hematoxilina, eosina. A análise histologia foi utilizada para a realização de análise quantitativa da superfície óssea e das áreas de remodelação óssea.
As imagens da calvária nos sete dias foram analisadas utilizando-se o software de imagem. Para avaliação quantitativa, primeiro, defina a área para a análise. Procure nas seções no telopa onde quatro X para identificar a orientação e as suturas.
Defina a sutura coronal e identifique a superfície óssea longa de um lado e, em seguida, a superfície curta do outro. Sob a ampliação de 40X, identifique a sutura coronal e mova dois ou três campos ópticos para longe da sutura, ao longo da superfície longa. Capture a imagem desta área para análise.
Você pode usar o software de imagens para analisar a integridade estrutural do osso. Pode ser feita análise histomorfométrica quantitativa para a espessura e a área óssea da hemicalvaria. A análise correta da calvária depende de uma boa incorporação e orientação adequada para resultados histológicos consistentes.
Certifique-se de usar pelo menos três calvaria por condição experimental. Aqui, podemos ver a estrutura do osso. Em laranja, o osso é observado.
Também podemos ver a presença do periósteo, ostocito, endosteum e outras partes do osso. No nosso caso, usamos insulina para aumentar a remodelagem óssea. Comparado com um controle, podemos ver um aumento significativo na área óssea.
Aqui, podemos ver o efeito da linha celular MDA-MB-231 no modelo calvaria. Podemos ver, em comparação com o controle, que a presença de células cancerígenas induz fatores osteolíticos que estimulam a destruição óssea. Utilizamos o modelo calvaria para medir a regeneração óssea e as interações células-ósseas cancerígenas por co-culturas com células cancerosas e histologia.
Também validamos nossos dados por PCR quantitativo em tempo real. Este modelo ex vivo tem muitas vantagens, como a organização tridimensional e a diversidade celular do osso são preservadas, e as condições experimentais podem ser controladas. Além disso, o modelo é simples, você pode ver resultados em um curto período de tempo, e é de baixo custo.
E pode ser combinado com outras técnicas, como PCR quantitativo em tempo real, microscopia e micro-CT.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para cultura ex vivo de calvárias de camundongos recém-nascidos, destinado ao estudo da fisiologia óssea e à avaliação dos efeitos de fármacos na remodelação óssea. A técnica permite a recriação do microambiente tumor-ósseo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Fisiologia óssea
- Modelagem óssea
- Biologia do câncer
Contexto
- Explantes ósseos podem ser cultivados para estudar processos fisiológicos.
- As calvárias de camundongos neonatos servem como modelo para estudos ósseos.
- O cultivo conjunto com células cancerígenas pode simular o microambiente tumor-ósseo.
- Este método é econômico e simples.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a remodelação óssea em um modelo ex vivo.
- Avaliar o potencial terapêutico de diversas moléculas.
- Recriar o microambiente ósseo-tumoral.
Métodos Utilizados
- Isolamento de calvárias de camundongos recém-nascidos.
- Técnicas de cultura ex vivo para explantes ósseos.
- Sistemas de co-cultura com células cancerígenas.
- Avaliação da regeneração óssea e dos efeitos de fármacos.
Resultados Principais
- Cultura bem-sucedida de calvária para o estudo da remodelação óssea.
- Capacidade de testar agentes terapêuticos em um ambiente controlado.
- Recriação do microambiente tumor-ósseo demonstrada.
- Método demonstrado como eficiente e de baixo custo.
Conclusões
- A cultura ex vivo de calvária é uma ferramenta valiosa para a pesquisa óssea.
- Facilita o estudo dos efeitos de fármacos na fisiologia óssea.
- Sistemas de co-cultura aprimoram a compreensão das interações entre câncer e osso.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de calvária ex vivo fornece um sistema fisiologicamente relevante para avaliar a dinâmica da remodelação óssea e as interações tumor-ósseo em um formato controlado e reproduzível. Ele permite a desmistificação mecanicista em estágios iniciais de candidatos terapêuticos direcionados à metástase óssea ou à osteoporose, preservando a arquitetura tecidual nativa e a diversidade celular. O ensaio oferece confiança preditiva na identificação de compostos líderes por meio da quantificação das respostas ósseas anabólicas e catabólicas sob condições definidas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Investigação de hipóteses terapêuticas sobre vias de formação e reabsorção óssea utilizando co-cultivo com insulina ou células cancerígenas como moduladores.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos mediante a medição de alterações na área óssea em resposta a agentes osteolíticos ou osteoativos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao distinguir compostos que estimulam daqueles que inibem a remodelação óssea em um sistema relevante para a doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera saídas histomorfométricas padronizadas e quantitativas para a superfície óssea e área de remodelação após fixação, seccionamento e coloração.
- Reprodutibilidade: Exige um mínimo de três repetições biológicas por condição para garantir análise histológica consistente e confiabilidade dos dados.
- Escalabilidade: Compatível com análises posteriores, como qPCR, microscopia e micro-TC, para validação multiparamétrica das interações entre osso e tumor.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Relevância para a Doença: Modela a reabsorção óssea induzida pelo câncer utilizando células MDA-MB-231 ou meio condicionado para recapitular o microambiente osteolítico.
- Continuidade Translacional: Conecta achados in vitro à relevância in vivo, mantendo a organização tecidual tridimensional e a diversidade celular da calvária neonatal.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece se compostos em teste modulam a remodelação óssea por meio de efeitos diretos sobre osteoblastos/osteoclastos ou por sinalização mediada pelo câncer.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto líder, especialmente para agentes moduladores ósseos e agentes anticâncer com efeitos esqueléticos.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses nas vias Wnt, RANKL ou PTHrP mediante a quantificação da formação e reabsorção óssea em resposta a moduladores dessas vias.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas prontas para ensaios sobre área óssea e integridade estrutural, adequadas para o avanço de "hit" a "lead".
- Análise: Permite a comparação estatística da espessura e área óssea entre diferentes condições utilizando software de imagem e histomorfometria.
- Pesquisa Translacional: Relaciona-se ao trabalho pré-clínico ao modelar interações tumor-ósseo relevantes para humanos em um sistema murino ex vivo.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável para avaliação de diversos compostos, incluindo moléculas de pequeno porte, biológicos ou meios condicionados, na fisiopatologia óssea.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece uma compreensão mecanicista da regulação da remodelação óssea e da interação entre câncer e osso, com alta fidelidade fisiológica.
- Valor Operacional: Oferece um sistema ex vivo de baixo custo, simples e rápido, com resultados obtidos em até uma semana.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguimento ou interrupção ao reduzir falsos positivos na triagem de compostos ativos sobre o osso, por meio de modelagem relevante para a doença.
- Impacto sobre o Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em efeitos validados sobre formação ou reabsorção óssea em um contexto de co-cultura.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecidos murinos, processamento histológico e análise histomorfométrica.
- Depende de micrótomo, caixas para inclusão, formalina, EDTA e reagentes de coloração para o preparo dos tecidos.
- Necessita de protocolos padronizados de orientação e corte para garantir resultados histológicos e quantitativos consistentes.
- A adaptação a outros sistemas modelo pode exigir validação da preservação tecidual e da viabilidade celular.
- As limitações práticas incluem a fragilidade dos tecidos durante o processamento e a necessidade de manipulação cuidadosa para evitar artefatos na quantificação da superfície óssea.
