Caracterização totalmente autónoma e coleta de dados de cristais de macromoléculas biológicas
March 22nd, 2019
Aqui, descrevemos como usar a triagem automatizada e opções de coleta de dados disponíveis em um pouco de luz síncroton síncrotron. Os cientistas enviar amostras de cryocooled para o síncrotron e as propriedades de difração são selecionadas, os conjuntos de dados são recolhidos e tratados e, sempre que possível, uma solução de estrutura é realizada — tudo sem intervenção humana.
A cristalografia de raios-X é a técnica dominante para determinar informações estruturais 3D de proteínas. Linhas de feixe síncrotron são necessárias para obter dados dos cristais pequenos e fracamente difundidores que as proteínas produzem. Massive one é uma linha de feixe única porque automatiza totalmente o processo de coleta de dados a partir de macromoléculas biológicas.
Desde a montagem da amostra, localização e coleta final de dados. A automação completa desse tipo é muito importante, pois permite que os pesquisadores passem seu tempo em laboratório, em vez de coletar dados na linha de feixe. A linha de feixe também é inteligente e, em média, pode coletar dados melhores do que quando a linha de feixe é operada por humanos.
Para iniciar este protocolo, realize a montagem de cristal e solicite tempo de feixe em Massive one, conforme descrito no protocolo de texto. Navegue até o sistema de informações para linhas de feixe de cristalografia de proteínas, ou site ispyb. Escolha experimentos MX, faça login com o número do experimento e senha.
Clique na remessa, adicione novas e forneça as informações necessárias. Em seguida, clique em salvar. Clique em adicionar parcela e preencha as informações solicitadas.
Clique em salvar e clique em adicionar contêiner. Dê o código de barras do disco como nome, e escolha o disco da coluna, clique novamente em salvar. Clique no símbolo do recipiente e edite e preencha as informações necessárias sobre as amostras, como nome da proteína, fluxo de trabalho preferido e posição de cristal, no disco.
Escolha a proteína que foi aprovada pelo grupo de segurança ESRF. Digite um nome de amostra único para identificar cada amostra individual. Opcionalmente, escaneie o código de barras do pino.
O resto das informações a serem inclusivas também é opcional. Para cada amostra individual, digite o tipo de experimento. Isso define qual fluxo de trabalho automático será usado para processar cada cristal.
Dado que os cristais GCSH são agulhas, escolha MX pressione P.Next, entre em um grupo espacial. Se presente, este será usado para cálculos de estratégia de coleta de dados e pelas linhas automáticas de tubos de processamento de dados disponíveis. Digite a resolução desejada.
Isso define a distância do cristal ao detector das varreduras iniciais de malha, caracterização e coleta de dados padrão. Agora, defina a resolução de limiar desejada para evitar a coleta de conjuntos de dados completos de cristais que não difratam a este limite. Isso pode salvar o espaço de armazenamento de dados e analisar o tempo.
Defina a completude necessária. Em seguida, defina a multiplicidade necessária. Se mais de um cristal estiver contido no suporte da amostra, defina o número máximo de cristais a serem analisados.
O valor padrão é de um ou cinco para MX press P.O tamanho do feixe apropriado também pode ser selecionado. Coloque no grupo espacial, se conhecido, na coluna do grupo espacial force. Em seguida, ajuste a sensibilidade de radiação dos cristais.
Se desejar, defina o ângulo de rotação total a ser coletado para a coleta completa do conjunto de dados. Uma vez que todas as informações foram inserindo no sistema, salve os valores. Clique, retorne aos embarques e pressione enviar envio para a ESRF.
Imprima a etiqueta de envio e envie as amostras. Os usuários devem organizar uma coleta com um mensageiro usando os detalhes da conta ESRF. No dia do experimento, as amostras são transferidas para o Massive one high capacit dew-er.
Os cientistas da linha de raios lançam a coleta de dados, que pode ser seguida pelos usuários remotamente. Para cada tipo de amostra diferente, os usuários recebem um e-mail informando que a coleta de dados foi iniciada. A execução de todas as etapas em todos os fluxos de trabalho pode ser acompanhada online e em tempo real.
Isso é acessível ao usuário fazendo login no ISPyB. Os resultados também podem ser vistos e baixados. Para cada amostra analisada, examine os resultados do experimento automático no ISPyB.
Clique na sessão experimental desejada no ID30A1. Selecione o pipeline de processamento automático preferido. Baixe os dados escritos no grupo espacial correto com a maior completude e maior resolução.
Clicando nos últimos resultados de coleta e, em seguida, baixe. O fluxo de trabalho P de prensa MX foi usado pela linha de feixe ESRF Massive one para montar totalmente, centralizar o feixe de raios-X, caracterizar e coletar conjuntos de dados de difração completos de uma série de cristais de GCSH humanos. As amostras foram montadas e o laço analisado para uma área de varredura.
Após as análises de difração, foram selecionados quatro pontos dentro do cristal para coleta de dados. A determinação manual da estrutura por substituição molecular produziu um mapa de densidade eletrônica de alta qualidade após um único ciclo automatizado de refinamento. Para este conjunto de dados, o pipeline automatizado cortou os dados em uma resolução de um ponto três dois angstrom.
No entanto, os usuários podem decidir cortar os dados em uma resolução menor. A densidade eletrônica contínua é visível para toda a cadeia de aminoácidos além da tag histidina eterminal. Das quatro substituições que distinguem o GCSH humano e bovino, três são facilmente identificáveis na densidade eletrônica.
Isso é menos claro para o ácido aspartc à substituição de lisina 125. Para a qual a densidade eletrônica da cadeia lateral é apenas parcialmente resolvida devido à flexibilidade. O modelo atualmente obtido tem um valor de trabalho R de 20 pontos quatro por cento e um valor livre de R de 23 pontos oito por cento e pode ser ainda otimizado por ciclos adicionais de construção e refinamento de modelos automatizados e manuais.
É importante adequar os requisitos ao seu sistema. Por exemplo, definir a resolução já observada para um valor conhecido pode economizar tempo e garantir uma melhor coleta de dados. A coleta totalmente automática de dados democratizou a cristalografia e agora até mesmo pequenos laboratórios podem embarcar em projetos famosos quando isso era viável antes apenas com enorme poder de homem.
Visão Geral
Este artigo descreve o processo automatizado de triagem e coleta de dados em linhas de feixe de sincrotrão para cristalografia de proteínas. O sistema totalmente automatizado permite que os pesquisadores coletem e processem dados de amostras crio-resfriadas de forma eficiente, sem intervenção humana.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Cristalografia de proteínas
- Difração de raios X
- Automação na coleta de dados
Fundamentos
- A cristalografia de raios X é essencial para determinar estruturas de proteínas.
- Linhas de feixe de sincrotrão são cruciais para obter dados de cristais que difractam fracamente.
- A automação melhora a eficiência e a qualidade da coleta de dados.
- O Massive one beamline oferece um fluxo de trabalho totalmente automatizado para macromoléculas biológicas.
Propósito do Estudo
- Demonstrar o processo automatizado de coleta de dados em linhas de feixe de sincrotrão.
- Destacar as vantagens da automação na cristalografia de proteínas.
- Fornecer um protocolo detalhado para os pesquisadores seguirem.
Métodos Utilizados
- Montagem e envio da amostra para o sincrotrão.
- Utilização do sistema de informações ISPyB para gerenciamento do experimento.
- Fluxos de trabalho automatizados de coleta e processamento de dados.
- Monitoramento em tempo real da coleta de dados e análise de resultados.
Principais Resultados
- Coleta bem-sucedida de dados de difração de alta qualidade a partir de cristais de GCSH humano.
- Processamento automatizado produziu um mapa de densidade eletrônica de alta resolução.
- Identificação de diferenças estruturais entre GCSH humano e bovino.
- Demonstração da eficácia dos fluxos de trabalho automatizados em cristalografia.
Conclusões
- A automação na coleta de dados democratiza o acesso à cristalografia.
- Laboratórios menores agora podem empreender projetos complexos anteriormente limitados a instalações maiores.
- A adaptação dos parâmetros experimentais pode melhorar a eficiência da coleta de dados.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Fully automated synchrotron beamlines reduce manual intervention in macromolecular crystallography, enabling high-throughput screening and data collection from weakly diffracting crystals. This automation enhances data quality and throughput, allowing biopharma R&D teams to allocate scientific effort toward target validation and lead optimization rather than beamline operations. The technology democratizes access to structural biology, supporting early-stage de-risking of therapeutic targets through reliable 3D structural insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing high-resolution structural data on biological macromolecules.
- Operational Value: Supports functional target validation through automated characterization and data collection from crystallization trials.
- Predictive Value: Increases confidence in target models by delivering consistent, high-quality electron density maps for structure-guided design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated crystal systems for downstream workflows by automating mounting, centering, and diffraction analysis.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via predefined workflows and real-time monitoring through ISPyB.
- Scalability: Enables screening of large numbers of crystals and reuse of automated pipelines across projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural data to preclinical validation by providing reliable models for mechanistic studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying structural differences between species variants, such as human and bovine GCSH.
- Mechanistic De-risking: Clarifies binding sites and flexibility, aiding in the interpretation of structure-activity relationships.
Pipeline & Workflow Integration
The automated beamline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, supporting data generation for downstream analytics and modeling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by solving crystal structures of proteins and complexes.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs such as resolution, completeness, and multiplicity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts including R-work and R-free values, resolution cutoffs, and electron density maps to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural insights to preclinical continuity by enabling species-specific model refinement, as demonstrated with GCSH.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing dependency on site-specific expertise.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target models, reduction of mechanistic ambiguity, and support for structure-based drug design.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data collection across samples and projects.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency through reduced beamline staffing, and lowered biological risk in lead selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and data quality metrics.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallography and sample preparation is required for successful crystal mounting and characterization.
- Access to synchrotron facilities and instrumentation such as the Massive one beamline is essential for automated data collection.
- Standardization across teams requires consistent use of ISPyB for experiment tracking, workflow selection, and result retrieval.
- Adaptation across model systems involves adjusting parameters such as resolution thresholds, space group, and radiation sensitivity based on crystal properties.
- Practical limitations include the need for cryocooled samples and dependency on crystal quality, which affects automated workflow success rates.
