Name: Uma Nanoemulsão estabilizada tripeptídeo de ácido oleico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprenda a sintetizar nanoemulsões de ácido oleico-platina(II) estabilizadas com tripeptídeo KYF para aplicações farmacêuticas em oncologia. Este método encapsula fármacos anticâncer com agentes biodegradáveis de baixa toxicidade.

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Reconhecemos, com gratidão, apoio financeiro do Instituto Nacional de câncer, conceda SC2CA206194. Sem interesses financeiros concorrentes são declarados.

1. síntese do conjugado Acids–Platinum(II) oleico
<ol><li>Ativação da Cisplatina<ol>
<li>Suspender a 50 mg (0.167 mmol) de cisplatina em 4 mL de água (por exemplo, nanopure) a 60 ° C.</li>
		<li>Adicionar gota a gota-mg 55,2 (0.325 mmol) de AgNO3 em 0,5 mL de água para a solução da cisplatina e mexa a reação pelo menos 2 h a 60 ° C. O precipitado branco de AgCl formarão indicando o progresso da reação.</li>
		<li>Para determinar se a reação de ativação é concluída, realize o teste com 10% HCl a presença de íons de Ag+ livre na solução. O teste deve ser negativo (nenhum precipitado de AgCl adicional deve formar).</li>
		<li>Centrifugue a mistura de reação no 3.220 x g durante 10 minutos e remover o precipitado branco de AgCl.</li>
		<li>Recolher o sobrenadante e filtrar através de um filtro de seringa 0,2 mm. Teste o sobrenadante para a presença de platina, aplicando-se 2-3 gotas da solução através de uma pipeta Pasteur de SnCl2 cristais. O teste é positivo se a cor do complexo coordenada de estanho com platina é amarelo/laranja-escuro.</li>
		<li>Use o sobrenadante com Pt(II) registrados para a segunda etapa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reação do ácido oleico com Pt(II) registrados<ol>
<li>Suspender 94,2 mg de ácido oleico (0.333 mmol) em 3 mL de água a 60 ° C.</li>
		<li>Adicionar 13,3 mg (0.333 mmol) de NaOH em 1 mL de água e misturar com a solução de Pt(II) registrados da etapa 1.1</li>
		<li>Misture a reação para h 2 a 60 ° C e, em seguida, à temperatura ambiente durante a noite. O produto bruto é um precipitado marrom/amarelo oleoso.</li>
		<li>Centrifugue a mistura de reação no 3.220 x g durante 10 minutos e remover o sobrenadante. Seca o produto bruto a 25 ° C, usando um evaporador rotativo. Purifica o produto por várias lavagens com acetonitrilo. A cor final do conjugado acids–Pt(II) oleico puro é amarelo-pálido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. síntese de KYF-Pt-NE e o FITC-rotulado Nanoemulsão FITC-KYF-Pt-NE
<ol><li>Síntese do tripeptídeo KYF e o tripeptídeo fluorescente etiquetado FITC-KYF<ol>
<li>Sintetiza o KYF usando química de peptídeo de estado sólido padrão. Usar o seguinte padrão de condições de acoplamento para anexar cada aminoácido: resina de Wang (2,19 mmol), aminoácido Fmoc protegido (4,38 mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate (TBTU) (4,38 mmol) e diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol). Dissolver os aminoácidos com TBTU em dimetilformamida (DMF) e DIPEA.</li>
		<li>Mergulhe 5,7 g de resina de álcool de 4-alkoxybenzyl de Fmoc-L-Phe (0.382 meq/g) em 25 mL de DMF para 1 h antes da utilização.</li>
		<li>DePROTECT o grupo amina do aminoácido L-fenilalanina com 15 mL de solução de piperidina/DMF 20% por 5 min, descartar o solvente e repita a lavagem com ciclo de 20 min.</li>
		<li>Lave a resina por 1 min com os seguintes solventes: DMF, álcool isopropílico (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Descarte o solvente depois de cada lavagem.</li>
		<li>Realize o teste de Kaiser para determinar a presença do grupo de2 NH livre sobre a resina (ver sub-etapas) e se positivo (a semente da resina é roxa), adicionar o Fmoc-L-tirosina aminoácido e realizar o acoplamento durante a noite.<ol>
<li>Prepare o Kaiser teste soluções em frascos separados.</li>
			<li>Dissolva 5 g de ninidrina em 100 mL de etanol.</li>
			<li>Dissolva 80 g de fenol em 20 mL de etanol.</li>
			<li>Misture 2 mL de solução aquosa de 0,001 M de cianeto de potássio com 98 mL de piridina.</li>
			<li>Adicione 2-3 gotas de cada Kaiser testar soluções de amostra e calor em água fervendo por 5 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Após o bem sucedido acoplamento do segundo aminoácido, realize o teste de Kaiser e caso negativo proceder com protocolo de desproteção (etapas 2.1.3 para 2.1.5). Repita o processo com o Fmoc-fenilalanina aminoácido.<ol>
<li>Em cima de acoplamento de todos os aminoácidos, lave a resina por 1 min com 5 mL de DMF, IPA, DMF, metanol, diclorometano e éter dietílico, após cada lavagem descartar o solvente. Salve a resina para processamento adicional.</li>
			<li>Use metade da resina para as próximas etapas (2.1.7-2.1.9) para modificar o peptídeo com FITC. Para obter sem modificações KYF tripeptídeo, siga o procedimento começando em 2.1.10.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Modifica o aminoácido N-terminal da KYF KYF-N3 com ácido 6-azidohexanoic. Para este fim, misture 1 g (0.382 mmol) de resina KYF Wang e 120,1 mg (0.764 mmol) do ácido 6-azidohexanoic com 245,2 mg (0.764 mmol) de TBTU e 197,1 mg (1.528 mmol) de DIPEA em 30 mL de DMF. Misture a reação durante a noite em temperatura ambiente.</li>
		<li>Obter o KYF-FITC da síntese do KYF-N3 com fluoresceína propargil através de uma reação de clique. Para este efeito, misture 253 mg (0.097 mmol) do KYF-N3 Wang resina com 3,78 mg (0.019 mmol) de CuI sólido, 71,9 mg (0.193 mmol) de fluoresceína propargílico e 2,24 mg (0,017 mmol) de DIPEA. A reação deve mudar a cor de verde para marrom.</li>
		<li>Após 24h, lave três vezes a resina por 1 min alternadamente com 5 mL de DMF e IPA cinco vezes, metanol e água três vezes, DMF e água três vezes e com diclorometano e éter dietílico. Descarte o solvente depois de cada lavagem.</li>
		<li>Cleave o KYF-FITC ou peptídeo KYF da resina com uma solução de ácido trifluoroacético (TFA) / triisopropylsilane (dicas) / h2O para a relação de 95/2.5/2.5 mais de 3 horas.</li>
		<li>Precipitar o peptídeo bruto em um éter etílico frio, lavar três vezes com éter frio e em seguida seco sob vácuo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Síntese da Nanoemulsão FITC-KYF-estabilizado com Pt(II) (FITC-KYF-Pt-NE) e KYF-Pt-NE<ol>
<li>Dissolva 10 mg (0.0126 mmol) de conjugado acids–Pt(II) oleico em 1,5 mL de isopropanol e coloque em uma seringa de 5 mL.</li>
		<li>Coloque a seringa com conjugado acids–Pt(II) oleico em uma bomba de seringa e definir o fluxo de 0,1 mL/min.</li>
		<li>Para sintetizar o FITC-KYF-Pt-NE, dissolver 1 mg (0.00105 mmol) de FITC-KYF e 1 mg (0.00219 mmol) de KYF (razão molar de 1:2 da FITC-KYF:KYF) em 20 mL de água e ajustar a temperatura da solução a 37 ° C. Cobrir as paredes do recipiente com papel de alumínio para evitar fotobranqueamento do fluoróforo FITC. Para sintetizar o KYF-Pt-NE, dissolver 2 mg (0.0044 mmol) de tripeptídeo KYF em 20 mL de água e ajustar a temperatura da solução a 37 ° C.</li>
		<li>Adicione gota a gota o oleico acids–Pt(II) conjugado à solução de tripeptídeo FITC-KYF/KYF ou KYF. Execute esta etapa sob o capô.</li>
		<li>Agitar a solução durante a noite em temperatura ambiente para evaporar os solventes orgânicos e permitir a auto-montagem de FITC-KYF-Pt-NE ou KYF-Pt-ne</li>
		<li>Concentrar o FITC-KYF-Pt-NE ou KYF-Pt-NE em um concentrador centrífugo (10K MWCO) e lavar três vezes com 4 mL de água nanopure.</li>
		<li>Armazenar as soluções aquosas de KYF-Pt-NE e FITC-KYF-Pt-NE a 4 ° C.</li>
		<li>Analise para platina conteúdo usando espectroscopia de absorção atómica (AAS), seguindo guia48 as indicações do fabricante.<ol>
<li>Prepare-se para a curva de calibração padrões de platina em solução de HCl 10% (escala eficaz para AAS é entre 100 a 1.200 ppb (partes por bilhão)).</li>
			<li>Dissolver 50 µ l de solução de KYF-Pt-NE da etapa 2.2 em 100 µ l de água régia (mistura de ácido clorídrico concentrado e ácido nítrico de 3:1) e deixar à temperatura ambiente durante a noite. Adicione 850 µ l de água para atingir um volume de amostra final de 1 mL. Analise a amostra usando AAS. A concentração de ácido final deve ser de 10% em todas as amostras analisadas.</li>
			<li>Gravar a leitura da concentração do Pt no ppb e calcular o teor final de platina na amostra (conta para diluição da amostra e o volume inicial de Nanoemulsão).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. confocal imagem da absorção celular de FITC-KYF-Pt-NE
<ol><li>6 linhas de células de câncer de ovário (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G e ES2), de sementes para 4 bem-câmara confocal pratos com a densidade de 4,7 x 104 células, por câmara e pre-cultura durante a noite a 37 ° C.</li>
	<li>Após 24h, lavar as células três vezes com solução salina tampão de fosfato (PBS) e incube com FITC-KYF-Pt-NE, em meio de cultura celular (consulte a etapa 6.1 para celular linha detalhes específicos) por 15 min a 37 ° C.</li>
	<li>Após a incubação, remova a mídia e lavar as células três vezes com PBS.</li>
	<li>Consertar as células com metanol a frio por 5 min a-20 º C e lavar três vezes com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Permeabilize as células com 1 mL de 0.1% Triton-X por 10 min a temperatura ambiente e lavar três vezes com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Incube as celulas para 90 min com LAMP1 anticorpo conjugado com Alexa Fluor 647 (1ml) às 01:50 diluição em PBS em temperatura ambiente. Em seguida, lave as células 3 vezes com PBS.</li>
	<li>Dilua a solução-mãe DAPI (1 mg/mL) a 1 mg/mL em PBS. Em seguida, adicione 1 mL da solução diluída para cada câmara e incube por 15 min à temperatura ambiente. Lave as células 3 vezes com PBS.</li>
	<li>Lamelas de montagem em um slide usando o meio de montagem.</li>
	<li>Imagem das células usando o microscópio confocal de células vivas no comprimento de onda de excitação de 405 nm, 488 nm e 633 nm. Definir os parâmetros de deteção como segue: poder do laser de 0,2% e não mais de 1%, unidade de Pinole 1 arejado, ganhar mestre 650-750, deslocamento de Digital 0.</li>
	<li>Abrir imagem no software de imagem. Sob a imagem exibida, selecione gráficos e selecione Barra de escala de Insert, para inserir a barra de escala para a imagem.</li>
</ol>4. estudos de liberação de drogas
<ol><li>Realizar estudos de liberação de drogas em PBS. Ajuste os valores de pH de três buffers de PBS a 7,4, 6,8 e 5,0 respectivamente.</li>
	<li>Diluir 5 μL de KYF-Pt-NE em 180 μL de tampão PBS, pH adequado, transferir para 3,5 kDa copo de diálise mini MWCO e incubar a 37 ° C em PBS.</li>
	<li>Retire o tampão da cada três tubos de mini diálise em 2, 4, 6, 24, 48 e 140h e medir as concentrações de platina por AAS. Preparar todas as amostras de acordo com a etapa 2.2.8 Mas ajustar o volume final da amostra a 500 µ l.</li>
</ol>5. métodos de cultura celular
<ol><li>Células de cultura de linhas A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 em meio de cultura celular (DMEM) suplementado com 10% (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) ou com 15% (TOV - 21G, OV-90) de soro fetal bovino (FBS), com L-glutamina e penicilina/estreptomicina. Crescer todas as células em um 5% de CO2, atmosfera saturada de água a 37 ° C.</li>
	<li>Sementes de 3 x 105 células cada placa de 96 poços e pré-cultura durante a noite para experiências de incubação in vitro. Prepare as soluções KYF-Pt-NE, cisplatina e carboplatina em água. Ajuste a concentração de Pt(II) em KYF-Pt-NE para coincidir com a concentração de carboplatina e cisplatina para cada linha de celular. Incubar durante 72 horas a 37 ° C.</li>
	<li>Após a incubação, avalie a viabilidade celular usando um ensaio colorimétrico (o ensaio de proliferação celular de MTT). Brevemente, remover médio e adicionar 110 μL de 10% MTT em meio a cada bem e incubar durante 2 h a 37 ° C. Em seguida, adicionar 100 detergente μL de cada poço e incubar durante 5 h a 37 ° C.</li>
	<li>Verifique a absorvância a 570 nm, usando o leitor de placas. Analise os resultados usando análise estatística com o teste-Z e P-teste.</li>
</ol>

Os autores não têm um conflito de interesses para divulgar.

Passos críticos na síntese Nanoemulsão incluem ajustando a relação molar entre os substratos, mantendo controle de taxa de fluxo e temperatura durante a adição de acids–Pt(II) oleico, proporcionando tempo suficiente para auto-montagem e purificar o produto usando um coluna de concentrador centrífugo. Estes parâmetros influenciam o tamanho e morfologia de KYF-Pt-NE; assim, é particularmente importante manter a relação molar adequada e ajustar as condições sintéticas corretamente.
A relação entr...

Nos últimos anos, tem havido um interesse crescente na engenharia de nanopartículas para tais aplicações biomédicas, como a entrega da droga e bioimaging1,2,3,4. A multifuncionalidade dos sistemas baseados em nanopartículas necessita frequentemente incorporando vários componentes dentro de uma formulação. Os blocos de construção que são baseados em lipídios ou polímeros muitas vezes diferem em termos de suas propriedades físico-químicas, bem como sua biocompatibilidade e biodegradabilidade, que em última análise, pode afetar a função do nanostructure1, 5,6. Biologicamente derivada de materiais, tais como proteínas e peptídeos, há muito foram reconhecidos como promissoras componentes de nanoestruturas multifuncionais devido à sua flexibilidade de sequência7,8. Peptídeos auto-montagem em arquiteturas supramoleculares altamente ordenadas, formando helicoidal fitas9,10, andaimes fibroso11,12e muitos mais, abrindo assim o caminho para a construção -híbrida biomolécula nanoestruturas usando um ascendente abordagem13.
Peptídeos têm sido explorados para aplicações em medicina e biotecnologia, especialmente para a terapia anticâncer14 e doenças cardiovasculares15 , bem como para desenvolvimento de antibióticos16,17, metabólica distúrbios de18e infecções19. Há mais de uma centena de pequenas-peptídeo terapêutica submetidos a ensaios clínicos20. Peptídeos são fáceis de modificar e rápido para sintetizar a baixo custo. Além disso, eles são biodegradáveis, que facilita muito suas aplicações biológicas e farmacêuticas21,22. O uso de peptídeos como componentes estruturais inclui a engenharia de nanopartículas responsivos, baseado em peptídeo e depósitos de hidrogel para liberação controlada23,24,25,26 , 27, baseado em peptídeo biosensores28,29,30,31ou dispositivos bio-elétrica32,33,34. Importante, nem curtos peptídeos com dois ou três resíduos de aminoácidos que incluem fenilalanina foram encontrados para guiar a auto-montagem processa35,36,37 e criar emulsões estabilizadas38 .
Drogas baseada em platina, devido a sua alta eficácia, são usadas em muitos esquemas de tratamento de câncer, tanto sozinho como em combinação com outros agentes39,40. Compostos de platina induzem danos ao DNA, formando ligações cruzadas de monoadducts e intrastrand ou interstrand. As lesões do ADN-Pt são reconhecidas pela maquinaria celular e, se não reparado, levam a apoptose celular. O mecanismo mais importante, pelo qual Pt(II) contribui para a morte de células de câncer, é a inibição da transcrição de DNA41,42. No entanto, os benefícios da terapia de platina são diminuídos pela toxicidade sistêmica de Pt(II) que provoca efeitos colaterais graves. Isto leva a baixa dosagem clínica de Pt(II)43, que muitas vezes resulta em concentrações subterapêuticas de platina, atingindo o DNA. Como consequência, a reparação do DNA que segue contribui para a sobrevivência de células de câncer e adquirir resistência Pt(II). A quimioterapia-resistência de platina é um grande problema na terapia anticâncer e a principal causa de falha de tratamento44,45.
Nós desenvolvemos um nanosystem estável que encapsula o agente Pt(II) a fim de proporcionar um efeito de blindagem na circulação sistêmica e para diminuir os efeitos colaterais Pt II-induzida. O sistema é baseado em um núcleo de oleico acids-Pt(II) estabilizado com um tripéptido KYF para formar uma Nanoemulsão (KYF-Pt-NE)46. Os blocos de construção de KYF-Pt-NE, os aminoácidos do tripeptídeo, bem como o ácido oleico, têm o estatuto de geralmente reconhecidos como seguros (GRAS) com a Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE é preparada usando um método de nanoprecipitation47. Em suma, o conjugado acids-Pt(II) oleico é dissolvido em um solvente orgânico e em seguida adicionado gota a gota à solução aquosa KYF (Figura 1) a 37 ° C. A solução é agitada por várias horas permitir a auto-montagem do KYF-Pt-ne A Nanoemulsão está concentrada em 10 kDa de concentradores centrífugos e lavada três vezes com água. A modificação química do KYF com um fluoróforo permite a síntese de fluorescente FITC-KYF-Pt-NE apropriado para a imagem latente biomedical.

<table><tbody><tr><td>2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio tetrafluoroborato (TBTU)</td><td>ANASPEC INC.:</td><td>AS-20376</td><td></td></tr><tr><td>Prato confocal de câmara de 4 poços</td><td>SPPS Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td>Para imagens de</td></tr><tr><td>ácido 6-bromohexanóico</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>24477</td><td>Clique na modificação para o peptídeo</td></tr><tr><td>A2780</td><td>Generosamente doado pelo professor John Martignetti do Hospital</td><td></td> Mount Sinai Linha <td>celular de câncer de ovário</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure</td><td>Thermo Fisher</td><td>D11901</td><td>sistema de filtragem de água</td></tr><tr><td>BUCHI rotavapor R-3</td><td>Buchi</td><td>Z568090</td><td>Para remoção de solvente e secagem de amostras</td></tr><tr><td>Centrífuga 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811F</td><td>Para separação de complexo de platina</td></tr><tr><td>Cis-diclorodiamina platina (II) 99%</td><td>Acros Organics</td><td>19376-0050</td><td>testes in vitro</td></tr><tr><td>CP70</td><td>Generosamente doado pelo professor John Martignetti do Hospital</td><td></td> Mount Sinai <td>Linha celular de câncer de ovário</td></tr><tr><td>Banho-maria digital</td><td>VWR</td><td>97025-134</td><td>Para aquecimento de meios para cultura de células</td></tr><tr><td>Espalhamento dinâmico de luz (DLS)</td><td>Brookhaven Instrument Corporation</td><td></td><td>Para medições de tamanho de nanopartículas</td></tr><tr><td>ES-2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1978</td><td>linha celular de câncer de ovário</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys (Boc) -OH 99,79%</td> <td>Chem-Impex INT ' L INC.</td><td>00493</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe 4-alcoxibenzílico resina de álcool (0,382 meq/g),</td> <td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01914</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>H59730</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>HERACELL 150i Incubadora de CO2 Incubadora</td><td>Thermo Scientific Fisher</td><td></td><td>Bomba</td></tr> de <tr><td>seringa de alta pressão</td><td>New Era</td><td>1010-US</td><td>Para adição de complexo de platina na síntese de nanopartículas</td></tr><tr><td>Placa de aquecimento/agitador</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>Para agitação e aquecimento de amostras</td></tr><tr><td>Anticorpo LAMP-1 (cojugated com Alexa Fluor 647)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-18821 AF647</td><td>Para imagem de</td></tr><tr><td>imagem N, N-diisopropiletilamina (DIPEA)</td> <td>Oakwood Chemical</td><td>005027</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Ninidrina 99%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A10409</td><td>Kaiser teste</td></tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Chem-Impex INT ' L INC.</td><td>01421</td><td>Para síntese de complexo de platina</td></tr><tr><td>OV90</td><td>ATCC</td><td>CRL-11732</td><td>Linha celular de câncer de ovário</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Para lavagem de células</td></tr><tr><td>Meio de montagem Permount</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-100</td><td>Para imagem de imagem</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A92500</td><td>Teste Kaiser</td></tr><tr><td>Ácido fosfotúngstico</td><td>Fisher Chemical</td><td>Coloração negativa A248-25</td><td>para TEM</td></tr><tr><td>Piperidina 99%</td> <td>BTC</td><td>219260-2.5L</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Platinum AAS soultion padrão</td><td>Alfa Aesar</td><td>88086</td><td>1000ug / ml para curva</td></tr><tr><td>de calibração Brometo de propargyl 97%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>L10595</td><td>Para modificação de alcino de fluoresceína</td></tr><tr><td>Gabinete biológico científico</td><td>Thermo Scientific Fisher</td><td>1385</td><td>Bio-hood para cultura de células</td></tr><tr><td>Sistema de vácuo autolimpante</td><td>Welch</td><td>2028</td><td>Bomba de vácuo para rotavapor</td></tr><tr><td>Nitrato de prata</td><td>Acros Organics</td><td>19768-0250</td><td>Ativação da cisplatina</td></tr><tr><td>SKOV3</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>Linha celular de câncer de ovário</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S313-1</td><td>Para síntese de complexo de platina</td></tr><tr><td>Cloreto</td> <td>de estanho (II)Teste de 208256 Sigma Aldrich</td><td></td><td>para presença de platina</td></tr><tr><td>TOV21G</td><td>ATCC</td><td>CRL-11730</td><td>Linha celular de câncer de ovário</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético 99% (TFA)</td> <td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano (TIPS)</td> <td>Chem-Impex INT ' L INC.</td><td>01966</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>Para imagem em</td></tr><tr><td>pó de uranina 40%</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25328A</td><td>Para modificação de alcino de fluoresceína</td></tr><tr><td>Vivaspin 20 (10000 MWCO)</td><td>Sartorious</td><td>VS2001</td><td>Para lavagem e condensação de nanopartículas</td></tr><tr><td>VWR Microscópio invertido VWR</td><td></td><td>89404-462</td><td>Para monitoramento de cultura de células</td></tr></tbody></table>

uma nanoemulsão estabilizada tripeptídeo de ácido oleico

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Nós descrevemos um método para produzir uma Nanoemulsão composta de um núcleo de acids-Pt(II) oleico e um revestimento (KYF) de fenilalanina-lisina-tirosina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE encapsula Pt(II) a 10% do peso, tem um diâmetro de 107 ± 27 nm e uma carga negativa de superfície. KYF-Pt-NE é estável na água e no soro e é biologicamente ativo. A conjugação de um fluoróforo para KYF permite a síntese de uma Nanoemulsão fluorescente que é apropriado para a imagem latente biológica. A síntese da Nanoemulsão é executada em um ambiente aquoso e as formas de KYF-Pt-NE através de auto-montagem de um peptídeo KYF curto e um conjugado acids-platinum(II) oleico. A auto-montagem processo depende da temperatura da solução, a razão molar entre os substratos e a taxa de fluxo da adição de substrato. Etapas cruciais incluem mantendo a taxa ideal de agita durante a síntese, permitindo tempo suficiente para self-assembly e pre-concentrando a Nanoemulsão gradualmente em um concentrador centrífugo.

Imagem de representante TEM de KYF-Pt-NE preparada usando este protocolo é mostrada na Figura 2A. KYF-Pt-NEs são esféricos na morfologia, bem dispersa e uniforme no tamanho. O diâmetro do núcleo da KYF-Pt-NEs, medido diretamente a partir de três imagens de temperatura com um mínimo de 200 medições feito, é 107 ± 27 nm. O diâmetro hidrodinâmico de KYF-Pt-NE, analisado usando espectroscopia de luz dinâmica (DLS), foi encontrado para ser 240 nm, com um índice de...

Este protocolo descreve um método eficiente para sintetizar uma Nanoemulsão de um conjugado de oleico acids-platinum(II) estabilizado com um tripéptido fenilalanina-lisina-tirosina (KYF). As formas de Nanoemulsão sob condições sintéticas suaves através de auto-montagem do KYF e o conjugado.

Uma Nanoemulsão estabilizada tripeptídeo de ácido oleico

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Dada a ampla gama de sequências curtas de peptídeos, este método pode ser estendido a muitos outros desenhos de nanopartículas. A modificação do peptídeo pode tornar o sistema adequado para fins de diagnóstico. Encapsular a platina anticâncer a drogas com agente estabilizador biodegradável e de baixa toxicidade é altamente relevante para aplicações farmacêuticas.Estudos in-vivo preliminares com câncer de ovário são promissores e serão investigados. Para começar, suspenda 50 miligramas de cisplatina em quatro mililitros de água ultra-pura a 60 graus Celsius. Adicione a solução de nitrato de prata em termos de gota à solução cisplatina e mexa a mistura de 300 a 400 RPM por duas horas a 60 graus Celsius no escuro.Depois disso, use 10% por ácido clorídrico de peso para confirmar que não há íons de prata livres na solução. Se não for mais um cloreto de prata ao adicionar ácido clorídrico, centrifugar a mistura a 3.220 vezes a gravidade por 10 minutos. Decante o supernatante e filtre-o através de um filtro de seringa de 0,2 micrômetro.Em seguida, teste o filtrado para platina aplicando duas a três gotas a 10 cloretos. A platina está presente se a suspensão ficar marrom escuro ou laranja. Em seguida, adicione 13,3 miligramas de hidróxido de sódio em um mililitro de água em 94,2 miligramas de suspensão de ácido oleico em três mililitros de água a 60 graus Celsius.Mexa a mistura por duas horas a 60 graus Celsius. Em seguida, desligue o fogo e continue mexendo à temperatura ambiente por 16 a 24 horas para obter o produto bruto como um precipitante oleoso e marrom-amarelo. Centrifugar a mistura de reação a 3.220 vezes a gravidade por 10 minutos, e remova o supernante.Seque os produtos em um evaporador rotativo a 25 graus Celsius. Suspenda o produto bruto em cinco mililitros de acetonitrilo por vórtice e recuperação do produto por centrifugação. Repita este processo de lavagem pelo menos mais duas três vezes para obter o ácido puro e oleico platina II conjugado como um sólido amarelo pálido.Primeiro, mergulhe 5,7 gramas de Fmoc protegida L-fenilalanina funcionalizada resina Wang funcionalizada em 25 mililitros de dimetilformamida por uma hora. Em seguida, mergulhe a resina em 15 mililitros de 20% piperidina em DMF por cinco minutos enquanto treme a 80 RPM para des protegir a amina. Escorra a resina e repita a desproteção por 20 minutos.Lave a resina com DMF e álcool isopropílico depois. Uma vez confirmada a desproteção, adicione OFoc protegido L-tyrosine TBTU e DIPEA e agitar a mistura por 16 a 24 horas para realizar o acoplamento. Lave a resina com DMF e álcool isopropílico.Realize o teste kaiser e continue com a desproteção e lavagem como descrito anteriormente. Casal e des proteção Fmoc protegem a lise da mesma forma. Lave a resina com DMF, IPA, metanol, diclorometano e éter dietil depois.Reserve um grama de resina de rolamento KYF para modificação FITC. Mergulhe a resina restante em ácido trifluoroacético de 95%. 2,5% triisopropilano e 2,5% de água por três horas para cortar o tripeptídeo da resina.Precipitar o peptídeo bruto com éter dietil resfriado a 20 graus Celsius. Lave o precipitado três vezes por centrifugação em 30 a 40 mililitros porções de éter de ditil frio e seque-o sob vácuo. Em seguida, misture o restante grama de resina KYF com 120,1 miligramas de ácido 6-acetohexanoico em 30 mililitros de DMF com TBTU e DIPEA.Agitar a mistura por 16 a 24 horas em temperatura ambiente para obter o tripeptida modificado de azide. Em seguida, misture 253 miligramas desta resina com 3,78 miligramas de cobre sólido (I)iodeto 71,9 miligramas de propargia florisean e 2,24 miligramas de DIPEA. Deixe a mistura reagir enquanto treme por 24 horas.Em seguida, lave bem a resina de rolamento KYF modificada FITC. Aperte o FITC modificado KYF da resina e purfique-o da mesma forma que o tripeptídio não modificado. Para começar a preparar a nanoemoulsion, dissolva 10 miligramas do ácido oleico que a platina II conjugar em 1,5 mililitros de IPA.Desenhe esta solução em uma seringa de 5 mililitros, conecte uma agulha de calibre 20 e monte a seringa em uma bomba de seringa sobre a área de reação. Coloque a bomba de seringa em 0,1 mililitros por minuto. Para uma nanoemulsão com KYF modificado FITC, dissolva um miligrama de KYF modificado fitc e um miligrama de KYF não modificado em 20 mililitros de água.Para uma nanoemulsão com KYF não modificado, em vez disso, dissolva dois miligramas de KYF em 20 mililitros de água. Aqueça a solução KYF modificada ou não modificada do FITC a 37 graus Celsius. Certifique-se de que a solução KYF está mexendo em cerca de 400 RPM, e que a seringa está alinhada com a solução.Em seguida, inicie a bomba de seringa para começar a adicionar o ácido oleico platina duas gota conjugada sábia. Uma vez adicionado o conjugado, reduza a velocidade de agitação para 150 RPM e deixe a solução esfriar à temperatura ambiente. Continue mexendo por 16 a 24 horas.Então, concentre a nanoemulção em uma unidade de filtro centrífugo daltons 10.000 daltons. Lave a nanoemulsão em uma unidade de filtro centrífugo três vezes com quatro porções mililitros de água ultrapura. E então armazená-lo como uma solução aquosa a quatro graus Celsius.O produto final é opalescente para nanopartículas KYF e fluorescente para nanopartículas modificadas pelo FITC. As gotículas em uma nanoemulsão preparada com KYF não modificada eram esféricas, bem dispersas e relativamente uniformes em tamanho. Com base em imagens de microscopia eletrônica de transmissão, os núcleos tinham cerca de 107 nanômetros de diâmetro.A nanoemulsão modificada pelo FITC, que aparece aqui em verde, pode entrar em células de várias linhas de células cancerígenas do ovário. Enquanto o diâmetro hidrodinâmico de ambas as formulações aumentou durante quatro meses de armazenamento na água, as dimensões gerais foram preservadas. Além disso, não foi observada opsonização da emulsão após um dia de incubação em soro bovino fetal de 20%.O lançamento de platina da emulsão foi mais lento no pH 7.4 com apenas 20,8% da platina lançada após quatro horas. A liberação de platina acelerou à medida que o pH diminuiu. A nanoemulsão revestida de KYF contendo platina reduziu a viabilidade dessas linhas de células cancerígenas de ovário a um grau muito maior do que foi alcançada pela carboplatina, o analógico clinicamente relevante.A nanoemulsão também mostrou uma redução comparável ou maior na viabilidade do que a cisplatina em cinco das seis linhas celulares. A nanoemulsão revestida de KYF induziu consistentemente uma redução comparável ou maior na viabilidade do que o ácido oleico platina II conjugado sozinho. Este é um método simples e eficiente para encapsular terapêuticas hidrofóbicas dentro do andaime de nanopartículas da base tripécida.Peptídeos curtos são biodegradáveis, e têm baixa toxicidade, o que é significativo para medicina e biotecnologia. Realize este procedimento sob a capa de fumaça para evitar a exposição a solventes orgânicos. O ácido oleico de platina e as nanoemulsões de platina KYF têm propriedades anticâncomas e, portanto, devem ser tratadas com cuidados especiais.Este método é simples em termos de baixa atividade filabilator e equipamento, porém se baseia na aplicação adequada da estratégia de síntese e conceitos químicos subjacentes. Nosso método pode ser estendido para entregar outras pequenas moléculas de drogas. O núcleo de nanopartículas consiste em ácido oleico e, portanto, é adequado para encapsulamento de agentes hidrofóbicos.

a-tripeptide-stabilized-nanoemulsion-of-oleic-acid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Phase-Shift nanoemulsões (PSNE) pode ser vaporizado utilizando ultra-sons de alta intensidade focado para melhorar o aquecimento localizado e melhorar a ablação térmica de tumores. Neste relatório, a preparação de PSNE estável, com uma estreita distribuição de tamanho é descrito. Além disso, o impacto de PSNE vaporizada no ultra-som mediada por ablação é demonstrada no tecido mimetizam fantasmas.

Síntese de mudança de fase Nanoemulsões com distribuição de tamanho estreita para vaporização Droplet Acústico e Bubble avançada ablação por ultrassom mediada

Descrevemos a produção e caracterização de nanopartículas e micropartículas compostas por poli(ácido lático-co-glicólico) utilizando a vitamina E-TPGS como emulsificante. Variando os parâmetros de formulação, como a concentração do emulsificante, é possível produzir nanopartículas com diâmetros médios que variam de 220 nm a 1,98 μm.

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Preparação Facile da Internamente auto-montados Lipid partículas estabilizada por nanotubos de carbono

Os principais passos da vida polimerização aniônica de éter fenil glicidílico (PheGE) sobre metoxi-polietileno glicol (MPEG-b -PPheGE) são descritos. As micelas de copolímero em bloco resultante (SGCN) foram carregados com doxorrubicina 14% (% em peso) e de libertação sustentada de fármaco durante 4 dias sob condições f isiologicamente relevantes foi obtido.

Aniônico polimerização de um copolímero anfifílicas para Preparação de copolímero em bloco As micelas estabilizada por interacções de empilhamento π-¸

Para fornecer medicamentos contra o câncer a locais de tumor com alta especificidade e efeitos colaterais reduzidos, são necessários novos métodos baseados em nanopartículas. Aqui, descrevemos micelas reticuladas de dissulfeto que podem ser facilmente preparadas por oxidação mediada por peróxido de hidrogênio e são capazes de se dissociar eficientemente sob um ambiente tumoral redutor para liberar cargas úteis.

Uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível Disulfide Cross-linked

Lipossomas contendo amphiphiles de cadeia única, particularmente os ácidos gordos, apresentam propriedades distintas, em comparação com aqueles que contém diacylphospholipids devido às propriedades químicas únicas de cadeia única amphiphiles. Aqui descrevemos técnicas para a preparação, purificação e utilização de lipossomas composto em parte ou toda a estes amphiphiles.

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Este estudo descreve a hidratação clássica utilizando o método de filme lipídico fino para preparo de nanolipoalguns seguido de caracterização de nanopartículas. Uma proteína 47 kDa-hidrófilo e globular, Tarin, é encapsulada com sucesso como uma estratégia para melhorar a estabilidade, evitar o afastamento rápido, e promover a liberação controlada. O método pode ser adaptado ao encapsulamento de moléculas hidrofóbicas.

Preparação e caracterização de Nanolipossomas para a aprisionamento de proteínas globulares hidrofílicas bioativas

Os óleos usados para aplicações de administração de medicamentos podem perturbar o perfil lipídico dos pacientes, o que é indesejável em doenças cardiovasculares. Os óleos ricos em ácidos graxos ômega-3 são uma alternativa saudável aos óleos convencionais e têm um enorme potencial para sistemas de administração de medicamentos autoemulsionados.

Auto-nanoemulsificação de óleos saudáveis para aumentar a solubilidade de drogas lipofílicas

Para projetar racionalmente adjuvantes eficientes, desenvolvemos emulsão de Pickering estabilizada por nanopartículas poli-láticas-co-glicólicas (PNPE). O PNPE possuía maciez única e uma interface hidrofóbica para contato celular potente e oferecia carga de antígenos de alto conteúdo, melhorando a afinidade celular do sistema de entrega às células apresentadoras de antígenos e induzindo a internalização eficiente de antígenos.

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Montagem de lipossomas assistida por octanol on-chip para bioengenharia

Neste protocolo, desenvolvemos um ácido retinóico (AR) encapsulado em nanoemulsão catiônica para ser usado como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do antígeno. Ao adicionar o RA aprovado pela FDA à nanoemulsão, a sIgA específica do antígeno foi promovida na vagina e no intestino delgado após a injeção intramuscular da nanoemulsão.

Ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do OVA

Aprenda a sintetizar nanoemulsões de ácido oleico-platina(II) estabilizadas com tripeptídeo KYF para aplicações farmacêuticas em oncologia. Este método encapsula fármacos anticâncer com agentes biodegradáveis de baixa toxicidade.

Uma Nanoemulsão estabilizada tripeptídeo de ácido oleico

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