Name: Monitoramento de sobrevivência Neuronal através de microscopia de fluorescência Longitudinal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprenda a monitorar a sobrevivência neuronal em nível de célula única usando microscopia longitudinal de fluorescência. Este método rastreia neurônios corticais individuais ao longo do tempo para identificar preditores de morte celular em doenças neurodegenerativas.

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Agradecemos a Steve Finkbeiner e membros do laboratório Finkbeiner pelo pioneirismo microscopia robótica. Agradecemos também o Dan Peisach para a construção inicial do software necessário para o processamento de imagem e sobrevivência análise automatizada. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e Stroke (NINDS) R01-NS097542, Universidade de Michigan dobradura de proteína doença iniciativa e Ann Arbor ativo contra ALS.

Animal vertebrado todo o trabalho foi aprovado pelo Comité sobre o uso e cuidado dos animais, da Universidade de Michigan (protocolo # PRO00007096). Experimentos são cuidadosamente planejados para minimizar o número de animais sacrificados. Grávida fêmea tipo selvagem (WT), ratos de longa Evans não-transgênicos (Rattus norvegicus) são alojados individualmente em câmaras equipadas com enriquecimento ambiental e cuidadas pela unidade de medicina Animal de laboratório (ULAM) da Universidade de Michigan, em acordo com o guia de NIH-suportado para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Todos os ratos foram mantidos em rotina de habitação para tão pouco tempo quanto possível antes da eutanásia, consistente com as recomendações das orientações sobre a eutanásia da associação americana de medicina veterinária e da Universidade de Michigan métodos de eutanásia por Diretrizes da espécie.
1. material preparação
<ol><li>Dissecar neurônios corticais de embrionário dia que 19 – 20 filhotes e cultura rato neurônios corticais em 0,5 x 106 células por mililitro na poli-D-lisina placas revestidas para 4 dias em vitro, conforme descrito anteriormente no1413,, 15,16,17,18,19.</li>
	<li>Preparar o plasmídeo de DNA de interesse, seguindo as etapas descritas por um isolamento de DNA de plasmídeo livre de endotoxinas kit (veja a Tabela de materiais). Quantificar o DNA resultante usando um espectrofotômetro.</li>
	<li>In vitro dia 4 (DIV4), filtro de alíquota, esterilizar e incube as seguintes mídias em 37 ° c: 6 mL reduzidos meios de soro (RSM; ex.., OptiMEM), 25 mL neuronal mídia basal (NBM), 40 mL NBKY (NBM + ácido cinurênico de 1 mM + 10 mM MgCl2, ajustado a um pH de 7. 4), 10 mL NBC (NBM + 1 x neuronal da pilha suplemento Cultura + 1 x suplemento de L-glutamina + 1 x caneta Strep). Nota: Volumes listados são suficientes para transfecting uma placa de 96 poços. Consulte a Tabela de materiais para reagentes específicos.</li>
</ol>2. a transfeccao de neurônios corticais de rato
<ol><li>Modificar o fornecido folha de Transfeccao de exemplo (ver arquivo suplementar 1) ajustando o tipo de placa, o mapa de placa, o número de DNAs, concentração de DNA e o número de poços (caixas verdes). Nota: O DNA total soma de 0,2 µ g por bem, independentemente de se uma (ex.., DNA A) ou múltiplos (por exemplo, DNA-B e C) construções de DNA são adicionadas a cada poço.</li>
	<li>Trabalhar a partir da planilha, combine a quantidade adequada de RSM e DNA em um tubo. Combine a quantidade adequada de RSM e transfecção reagente (por exemplo, Lipofectamine) em um tubo separado.</li>
	<li>Incube a temperatura ambiente (RT) por 5 min.</li>
	<li>Combine os DNA e a transfeccao reagente RSM as misturas e incubar a RT por 20 min.</li>
	<li>Durante esta etapa de incubação, usar uma pipeta multicanal e bebedouros de plástico estéril para lavar as células 2x com 100 µ l por alvéolo de NBM. Reservar os meios condicionados (CM) e armazenar a 37 ° C. Para ver este e todos os passos a seguir, ter cuidado para minimizar a quantidade de tempo que os neurônios são expostos ao ar.</li>
	<li>Remova a mídia NBM e substituir com 100 µ l por alvéolo de NBKY.</li>
	<li>Depois de 20 min, adicione 50 µ l da mistura de DNA/reagente de transfeccao gota a gota a cada poço.</li>
	<li>Incubar as células com os complexos de DNA/reagente de transfeccao por 20 min a 37 ° C.</li>
	<li>Lave 2 x com NBKY e substitua com 100 µ l de CM e 100 µ l de NBC por bem.</li>
	<li>Células transfectadas com sucesso devem ser visíveis por microscopia de fluorescência dentro 16 – 24 h do transfection. Para medir a eficiência, use um microscópio fluorescente para verificar o transfeccao após incubação durante a noite a 37 ° C. Nota: Esta técnica resulta em uma eficiência global de Transfeccao de 5 a 10%.</li>
</ol>3. imagem latente
<ol><li>Colocar a placa em um microscópio fluorescente com um palco motorizado e estabelecer um fiduciário (por exemplo, uma marca na parte inferior da placa) que permitirá que o usuário alinhe a placa de cada vez que é fotografada. Salve uma imagem neste fiduciária para referência.</li>
	<li>Navegue até um campo de interesse e anote as coordenadas x-y, em relação ao fiduciário.</li>
	<li>Concentre-se em células transfectadas, expressando uma etiqueta fluorescente.</li>
	<li>Ter imagens fluorescentes no respectivo canal ou canais (por exemplo, proteína fluorescente proteína fluorescente vermelha [RFP], verde [GFP], 4, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), manualmente ou de forma automatizada. Ao tomar várias imagens em intervalos regularmente espaçados, uma montagem do poço pode ser montada durante o processamento de imagem (consulte a etapa 4). Nota: O espaçamento depende de vários fatores, incluindo a ampliação, a óptica do microscópio e o tamanho do detector. Em geral, o óptico espaçamento entre imagens adjacentes será entre 90 a 95% do tamanho de cada imagem individual, para permitir um pequeno grau de sobreposição de imagem e apresentam o alinhamento.</li>
	<li>Repita este processo tantas vezes quantas forem necessárias, alinhando para o fiduciário original cada vez. Para análise de sobrevivência, de imagem ocorre cada 6 – 24 h, dependendo do tipo de célula e a finalidade do experimento.</li>
</ol>4. processamento de imagem
Nota: Aquisição de imagem, na sequência de uma série de etapas de processamento são necessários antes da análise de imagem. Estes incluem, mas não estão limitados a, costura, empilhamento e subtração de fundo (Figura 1). O objetivo dessas etapas é produzir uma pilha de imagem, ou séries temporais, em que as células são claramente discerníveis de seus antecedentes e fáceis de seguir sobre vários pontos de tempo. Uma macro dedicada de FIJI (Image_Processing.ijm, ver arquivo suplementar 2), executa costura básica, empilhamento e subtração de fundo. Uma explicação de cada etapa e os parâmetros a considerar ao realizar processamento de imagem é fornecida na seção de discussão.
<ol><li>Ajuste os dados brutos ou entrada de diretório para coincidir com a formatação, mostrado na Figura 2.</li>
	<li>Se os pontos de tempo não são contíguos (i.e., T1, T2, T3), renomear essas pastas para que eles sejam. Esta etapa é fundamental para assegurar que a macro Image_Processing não funcionar durante o empilhamento.</li>
	<li>Clique duas vezes no ícone para abrir o programa, em seguida, clique e arraste a macro Image_Processing para a barra de Fiji Fiji. Isto irá abrir a macro dentro Fiji.</li>
	<li>Ajuste linhas 2-7 da macro Image_Processing para especificar o diretório de entrada que contém imagens, o diretório de saída desejada para imagens costuradas e empilhados, o número de momentos de imagem, número de canais fluorescentes e formato da placa.</li>
	<li>Determine a ordem em que as imagens foram adquiridas. Para testar isso, costure manualmente uma montagem de imagens em FIJI por manobras para Plugins menu drop-down | Costura | Grade/coleção costura. Ajuste os parâmetros dentro dos menus dropdown tipo e ordem até que uma imagem com precisão costurada é produzida.</li>
	<li>Ajuste as variáveis GRID_TYPE e STITCH_ORDER nas linhas 8 e 9 de Image_Processing macro para coincidir com essas seleções.</li>
	<li>Especifica o número de imagens por bem, ajustando a linha 10 na macro Image_Processing . Nota: Para uma montagem de imagens de 2 x 2, esta linha leria DIM = 2.</li>
	<li>Se a subtração de fundo é necessária, ajustar a linha 14 na macro Image_Processing para BGSUB = true.</li>
	<li>Defina o raio de bola rolando, ajustando a linha 15 na macro Image_Processing . Nota: Para obter melhores resultados, definir o raio pelo menos o diâmetro o maior objeto de primeiro plano na imagem.</li>
	<li>Clique em executar para iniciar a macro Image_Processing . Uma vez iniciado, Image_Processing avançará automaticamente através de costura, empilhamento e subtração de fundo.</li>
</ol>5. marcar a morte celular
Nota: Consulte a seção de discussão para obter mais informações sobre a pontuação morte celular e dados de censurando.
<ol><li>Localize as pilhas de imagem produzidas pelo script Image_Processing . Abri-las em FIJI.</li>
	<li>Use a ferramenta de ponto dentro FIJI rotular individualmente cada célula com um número. Tecla t após cada ponto irá adicionar o identificador da célula para o Gerenciador de ROI (região de interesse). Nota: Os identificadores podem ser visualizados clicando as Rótulos e Mostrar todas as caixas de seleção no Gerenciador de ROI.</li>
	<li>
Progresso através de momentos em cada pilha de imagem e registro o commit quando cada célula morre ou precisa ser censurado no arquivo Survival_spreadsheet.csv (ver arquivo suplementar 3).
	<ol>
<li>Cada célula ocupa uma única linha na planilha, onde um identificador exclusivo (ID) para cada célula consiste de seu correspondente bem e número ROI dentro tão bem. tp_death é o último ponto de tempo, que observa-se uma célula de estar vivo, enquanto time_death representa o tempo real da morte em horas. Para cada célula, estes dados de entrada. É fundamental para manter esta estrutura para posterior análise utilizando de sobrevivência. R (ver 4 de arquivo suplementar). Nota: Os critérios para determinar a morte celular são cruciais e podem variar dependendo do tipo de célula. Três critérios principais são usados na identificação de neurônios mortos11,20 (Figura 3): perda da intensidade de fluorescência (por exemplo, neurônio 1 a 69 h), arredondamento do corpo celular (por exemplo, 2 neurônio a 188 h) e a perda do axônio integridade ou blebbing (por exemplo, 2 neurônio a 188 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Registre o status de censor da célula na última coluna. Nota: Aqui, devido à forma peculiar como censurar é tratada por R, censurou as células são marcadas por 0, enquanto as células sem censura são marcadas por 1. Observe que todas as células que vivem para o último ponto do tempo são censuradas e, portanto, marcadas como 0.</li>
</ol>6. realização de Cox proporcional perigos, análise e visualização de resultados
<ol><li>Se necessário, baixe studio R em https://cran.r-project.org/mirrors.html.</li>
	<li>Abra o studio R e clique duas vezes no ícone para a sobrevivência de . R script.</li>
	<li>Coloque o cursor na linha 2 de sobrevivência . R e clique no botão executar na janela principal do studio R para carregar a biblioteca de sobrevivência.</li>
	<li>Altere a linha 5 da sobrevivência . R script para coincidir com o local do arquivo Survival_spreadsheet.csv. Clique em executar para carregar os dados de sobrevivência como um dataframe.</li>
	<li>Destacar linhas 8 e 9 e clique no botão executar na janela de console R studio para realizar análise de riscos proporcionais de Cox. Resultados e estatísticas de saída aparecem na janela do console do studio R.</li>
	<li>Destaca linhas 12-16 de sobrevivência . R e clique no botão executar para produzir um risco cumulativo de trama de morte, que será exibido na guia parcelas no studio R. Este arquivo pode ser salvo, clicando no botão Exportar acima o enredo.</li>
	<li>Se é desejável para plotar os dados de sobrevivência como uma curva de Kaplan-Meier, destaca linhas 19 a 24 de de sobrevivência. R e aperte o botão executar .</li>
</ol>

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<li>Archbold, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP43+nuclear+export+and+neurodegeneration+in+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Scientific Reports. 8, 4606(2018).</li>
<li>Green, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005(2017).</li>
<li>Park, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+essential+Sis1+chaperone+reduces+TDP-43+effects+on+toxicity+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis.</a> PLOS Genetics. 13, e1006805(2017).</li>
<li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Proline%2FArginine+Dipeptide+from+Hexanucleotide+Repeat+Expanded+C9ORF72+Inhibits+the+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome.</a> eNeuro. 4, (2017).</li>
<li>Angelov, B., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+clustering+of+the+neurotrophin+receptor+TrkB+revealed+by+super-resolution+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy.</a> Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, é apresentada a metodologia para monitorar diretamente a sobrevivência neuronal em uma base de célula única. Em contraste com os tradicionais ensaios para a morte celular que são limitados a pontos de tempo discreto e populações inteiras de células, este método permite a avaliação contínua de uma variedade de fatores tais como a morfologia celular, expressão da proteína ou localização, e pode determinar como cada fator influencia a sobrevivência celular de forma prospectiva.
Esta metodol...

Morte celular anormal é um fator determinante em muitas doenças, incluindo câncer, neurodegeneração e derrame1. Ensaios de robustos e sensíveis para a morte celular são essenciais para a caracterização desses distúrbios, bem como o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para estender ou reduzir a sobrevivência celular. Atualmente existem dezenas de técnicas para medir a morte celular, diretamente ou através de de marcadores de substituto2. Por exemplo, morte celular pode ser avaliado visualmente com a ajuda de corantes vitais que mancham seletivamente células mortas ou vivas3, ou monitorando o aparecimento de específicos fosfolipídios da membrana plasmática,4,5,6 . Medições de componentes intracelulares ou metabolitos celulares lançados na mídia sob dissolução celular também podem ser usadas como proxies para célula morte7,8. Alternativamente, a viabilidade celular pode ser aproximada por avaliar a atividade metabólica9,10. Embora esses métodos fornecem meios rápidos de avaliação de sobrevivência celular, eles não são sem ressalvas. Cada técnica observa a cultura como uma única população, tornando-se impossível distinguir entre células individuais e as suas taxas únicas de sobrevivência. Além disso, tais ensaios baseados em população são incapazes de medir fatores que podem ser importantes para a morte celular, incluindo a morfologia celular, expressão da proteína ou localização. Em muitos casos, estes ensaios são limitados a pontos de tempo discreto, em não permitem a observação contínua de células ao longo do tempo.
Em contraste, a microscopia de fluorescência longitudinal é uma metodologia altamente flexível que diretamente e continuamente monitora o risco de morte em uma única célula base11. Em breve, a microscopia de fluorescência longitudinal permite que milhares de células individuais a serem controladas em intervalos regulares durante longos períodos de tempo, permitindo que as determinações precisas de morte celular e os fatores que melhorar ou suprimem a morte celular. Em sua base, o método envolve a transfecção transiente ou transdução de células com vetores codificação de proteínas fluorescentes. Um fiduciário exclusivo é então estabelecido, e a posição de cada célula transfectada em relação a este marco permite que o usuário para a imagem e a faixa de células individuais ao longo de horas, dias ou semanas. Quando essas imagens são exibidas em sequência, morte celular é marcado por mudanças características em fluorescência, morfologia e fragmentação do corpo celular, permitindo a atribuição de um tempo de morte para cada célula. A taxa calculada de morte, determinado pela função do perigo, pode então ser quantitativamente comparada entre condições ou relacionada para selecionar características celulares usando univariada ou de análise de riscos proporcionais de Cox multivariada12. Juntos, essas abordagens permitem a discriminação precisa e objectiva das taxas de morte celular em populações celulares e a identificação das variáveis que predizem significativamente a morte celular e/ou sobrevivência (Figura 1).
Embora esse método pode ser usado para monitorar a sobrevivência em qualquer tipo de célula pós mitóticas em uma variedade de formatos de chapeamento, este protocolo irá descrever condições para transfecting e imaging neurônios corticais de rato cultivados em uma placa de 96 poços.

<table><tbody><tr><td>Meio neurobasal</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>CompactPrep Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12863</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de ácido quinurênico</td><td>TCI</td><td>H0303</td><td></td></tr><tr><td>Poli D-lisina</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Thermo Fisher</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>placas de 96 poços</td><td>TPP</td><td>0876</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento de sobrevivência neuronal através de microscopia de fluorescência longitudinal

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Ensaios de citotoxicidade padrão, que exigem a coleção de lisados ou células fixas em vários pontos de tempo, limitaram a sensibilidade e a capacidade para avaliar os fatores que influenciam o destino neuronal. Estes ensaios exigem a observação de populações isoladas de células em pontos de tempo discreto. Como resultado, as células individuais não podem ser seguidas prospectivamente ao longo do tempo, limitando severamente a capacidade de discriminar se subcellular eventos, tais como formação de partitura ou mislocalization de proteína, são drivers patogênicos da doença, respostas homeostáticas, ou mera coincidência fenômenos. Microscopia de célula única longitudinal supera estas limitações, permitindo que o pesquisador determinar diferenças na sobrevivência entre populações e desenhar relações causais com sensibilidade melhorada. Este guia de vídeo irá delinear um fluxo de trabalho representativo para experimentos de medição única célula sobrevivência de neurônios corticais preliminares rato, expressando uma proteína fluorescente. O espectador vai aprender a alcançar alta eficiência transfections, coletar e processar imagens, permitindo o acompanhamento prospectivo de células individuais e comparar a sobrevivência relativa das populações neuronais usando análise de riscos proporcionais de Cox.

Usando o procedimento de transfeccao descrito aqui, DIV4 neurônios corticais de rato foram transfectados com um plasmídeo codificação da proteína fluorescente mApple. A partir do pós-transfection 24 h, células foram fotografadas por microscopia de fluorescência cada 24 h durante 10 dias consecutivos. As imagens resultantes foram organizadas conforme indicado na Figura 2, em seguida, costuradas, empilhadas e marcou para a morte celular (Fi...

Aqui, apresentamos um protocolo para monitorar a sobrevivência em uma única célula base e identificar variáveis que predizem significativamente a morte celular.

Monitoramento de sobrevivência Neuronal através de microscopia de fluorescência Longitudinal

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

Este protocolo permite que os pesquisadores monitorem a sobrevivência em uma base unicelular e identifiquem variáveis que predizem significativamente a morte celular ou a sobrevivência. Ensaios convencionais de citotoxicidade avaliam populações de células e não têm a capacidade de discriminar células individuais. A microscopia longitudinal permite a atribuição do tempo de morte para cada célula em uma população.Esta técnica é adequada para avaliar novas terapias para doenças neurodegenerativas e outras condições. Este método tem se mostrado inestimável para explorar mecanismos de doença em condições neurodegenerativas, e poderia ser aplicado com igual eficácia para outros transtornos em que a morte celular é de interesse. Os pesquisadores podem ter dificuldade em alcançar eficiências de transfecção adequadas sem toxicidade indevida.A prática com o tubo multicanal e a familiaridade com o protocolo devem diminuir essas dificuldades ao longo do tempo. Microscopia é uma metodologia inerentemente visual. Portanto, a técnica pode ser mais facilmente compreendida observando além da leitura.Para começar, combine a quantidade apropriada de mídia séreo reduzida e reagente de transfecção em um tubo, e reduza a mídia sérico e o DNA em um tubo separado. Incuba-os em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, misture o conteúdo de ambos os tubos e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos.Use um tubo multicanal e calhas plásticas estéreis para lavar os neurônios corticais duas vezes com 100 microliters de mídia basal neural por poço. E armazene a mídia condicionada e outras mídias remanescentes a 37 graus Celsius. Substitua o NBM por 100 microliters de solução NBKY previamente preparada por poço.Após 20 minutos, pipet 50 microliters do reagente transfecção e mistura de DNA dropwise em cada poço. Incubar as células a 37 graus Celsius por 20 minutos. Enxágüe as células duas vezes com a solução NBKY.Em seguida, adicione 100 microliters de mídia condicionada e 100 microliters de solução NBC para os poços. Para começar a fotografar as células, coloque a placa 96 em um microscópio fluorescente. Use uma marca fiduciária exclusiva de cada placa como referência para alinhamento futuro e salve uma imagem para referência futura.Em seguida, navegue até áreas de interesse e regissuça suas coordenadas x e y em relação à marca. Use uma marca fiduciária exclusiva de cada placa como referência para alinhamento futuro e salve uma imagem para referência futura. Finalmente, concentre-se nas células transfeinadas expressando um rótulo fluorescente.Tire várias imagens em intervalos regularmente espaçados nos canais fluorescentes apropriados. Para começar com o processamento de imagens, clique duas vezes no ícone Fiji. Em seguida, clique e arraste a imagem sublinhando o processamento macro para a barra fiji para abrir a macro dentro de Fiji.Ajuste as linhas de duas a sete da macro de processamento de sublinhado da imagem de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, clique na costura e, em seguida, costura de grade/coleta. Ajuste as configurações dentro dos menus suspensos, digite e peça, até que uma imagem com precisão seja produzida.Ajuste as variáveis de tipo de grade e ordem de ponto nas linhas oito e nove de acordo com essas seleções. Em seguida, ajuste a linha 10 para especificar o número de imagens por poço e defina a opção de subtração de fundo na linha 14 para verdade, se necessário. Ajuste a linha 15 para definir o raio da bola rolando de acordo com o protocolo de texto e clique em Executar.Finalmente, abra as pilhas de imagens de saída e identifique manualmente os neurônios mortos de acordo com o protocolo de texto. Registo os dados em um arquivo de planilha. Para realizar análises estatísticas, clique duas vezes no ícone para sobreviver.R script. Destaque a linha dois e clique no botão executar para carregar a biblioteca de sobrevivência. Em seguida, altere o caminho na linha cinco para chamar a planilha de entrada e clique no botão executar.Destaque as linhas oito e nove e clique no botão executar para realizar a análise de riscos proporcionais de Cox. Linhas de destaque 12 a 16 e 19 a 24. Clique no botão executar para traçar o risco cumulativo de morte e os dados de sobrevivência como uma curva Kaplan-Meier.Neste estudo, os neurônios cortical de ratos foram transfectados a quatro dias após o revestimento com um plasmídeo codificando a proteína fluorescente M maçã. 24 horas após a transfecção, os neurônios foram imagens por microscopia de fluorescência a cada 24 horas por 10 dias consecutivos. Após a aquisição da imagem, as imagens foram processadas e examinadas sequencialmente para marcar a morte da célula.A hora da morte de cada célula foi determinada por mudanças na fluorescência, morfologia e fragmentação do corpo celular. A análise de riscos proporcionais de Cox realizada nos dados de sobrevivência dos neurônios mutantes resultou em uma razão de risco de 2,2. Este resultado indicou uma taxa mais rápida de morte nos neurônios mutantes em comparação com a população do tipo selvagem.A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este procedimento é pipetar cuidadosamente. Minimizar a exposição ao ar e evitar bolhas é fundamental para uma transfecção bem sucedida. Após a transfecção, a microscopia de fluorescência longitudinal pode ser usada para rastrear vários fatores que podem contribuir para a morte celular, incluindo localização de proteínas, rotatividade e nível de expressão, além da sobrevivência celular.No campo da neuro degeneração, a natureza dinâmica da microscopia longitudinal lançou luz sobre se a agregação de proteínas associadas à doença representa um evento tóxico ou protetor. Nenhum desses reagentes ou instrumentos são perigosos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos um protocolo que permite imagens de mitocôndrias na vida neurônios através de microscopia de fluorescência durante muito tempo. Imagem por longos períodos é realizado através de lentivírus mediada expressão de uma proteína fluorescente mitochondrially alvo e uso de uma infra-top estágio incubadora que foi projetada e construída em nosso laboratório.

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Este relatório descreve a utilização de imagens de células vivas e técnicas photobleach para determinar a expressão de superfície, as vias de transporte e de cinética de tráfico de exogenamente expressa, GFP sensível ao pH proteínas na membrana plasmática dos neurónios.

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A remodelação intracelular de Ca2+ no envelhecimento pode contribuir para a excitotoxicidade e danos aos neurônios, processos mediados pela sobrecarga de Ca2+. Nosso objetivo foi investigar a remodelação de Ca2+ no cérebro envelhecido usando imagens de fluorescência e bioluminescência de Ca2+ citosólico e mitocondrial em culturas de longo prazo de neurônios do hipocampo de ratos, um modelo de envelhecimento neuronal.

Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Aged em neurônios do hipocampo

É descrito um protocolo robusto para monitorar as populações neurais por vídeo-microscopia de lapso de tempo seguido baseado em software de pós-processamento. Este método representa uma ferramenta poderosa para identificar os eventos biológicos em uma população selecionada durante as experiências de imagens ao vivo.

Viver a imagem, seguida por uma única célula de rastreamento para biologia celular de Monitor e a progressão da linhagem de várias populações neurais

Apresentado aqui é um método de tubo de rolo modificado para cultivo e intermitente de imagem de alta resolução do cérebro de roedor fatias muitas semanas com reposicionamento exacto em lamelas de photoetched. Viabilidade neuronal e morfologia da fatia são bem mantidos. Aplicações deste sistema completamente fechado usando vírus para expressão específica do tipo de célula são fornecidas.

Método do tubo de rolo modificados para precisamente localizadas e repetitivas imagens intermitentes durante a cultura a longo prazo de fatias de cérebro em um sistema fechado

Imagem latente da viver-pilha fornece uma riqueza de informações sobre células únicas ou populações inteiras que é inatingível por célula fixa imagem sozinho. Aqui, viver-pilha protocolos de imagens para avaliar as decisões de destino célula após o tratamento com a droga antimitótica paclitaxel são descritos.

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Células de tronco neural/progenitor apresentam várias dinâmicas de expressão de componentes de sinalização notch que levam a diferentes resultados de eventos celulares. Essa expressão dinâmica pode ser revelada pelo monitoramento em tempo real, não pela análise estática, usando um sistema de imagem de bioluminescência altamente sensível que permite a visualização de mudanças rápidas nas expressões gênicas.

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Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Aprenda a monitorar a sobrevivência neuronal em nível de célula única usando microscopia longitudinal de fluorescência. Este método rastreia neurônios corticais individuais ao longo do tempo para identificar preditores de morte celular em doenças neurodegenerativas.

Monitoramento de sobrevivência Neuronal através de microscopia de fluorescência Longitudinal

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