Monitoramento de sobrevivência Neuronal através de microscopia de fluorescência Longitudinal
19 de janeiro de 2019
Aqui, apresentamos um protocolo para monitorar a sobrevivência em uma única célula base e identificar variáveis que predizem significativamente a morte celular.
Este protocolo permite que os pesquisadores monitorem a sobrevivência em uma base unicelular e identifiquem variáveis que predizem significativamente a morte celular ou a sobrevivência. Ensaios convencionais de citotoxicidade avaliam populações de células e não têm a capacidade de discriminar células individuais. A microscopia longitudinal permite a atribuição do tempo de morte para cada célula em uma população.
Esta técnica é adequada para avaliar novas terapias para doenças neurodegenerativas e outras condições. Este método tem se mostrado inestimável para explorar mecanismos de doença em condições neurodegenerativas, e poderia ser aplicado com igual eficácia para outros transtornos em que a morte celular é de interesse. Os pesquisadores podem ter dificuldade em alcançar eficiências de transfecção adequadas sem toxicidade indevida.
A prática com o tubo multicanal e a familiaridade com o protocolo devem diminuir essas dificuldades ao longo do tempo. Microscopia é uma metodologia inerentemente visual. Portanto, a técnica pode ser mais facilmente compreendida observando além da leitura.
Para começar, combine a quantidade apropriada de mídia séreo reduzida e reagente de transfecção em um tubo, e reduza a mídia sérico e o DNA em um tubo separado. Incuba-os em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, misture o conteúdo de ambos os tubos e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos.
Use um tubo multicanal e calhas plásticas estéreis para lavar os neurônios corticais duas vezes com 100 microliters de mídia basal neural por poço. E armazene a mídia condicionada e outras mídias remanescentes a 37 graus Celsius. Substitua o NBM por 100 microliters de solução NBKY previamente preparada por poço.
Após 20 minutos, pipet 50 microliters do reagente transfecção e mistura de DNA dropwise em cada poço. Incubar as células a 37 graus Celsius por 20 minutos. Enxágüe as células duas vezes com a solução NBKY.
Em seguida, adicione 100 microliters de mídia condicionada e 100 microliters de solução NBC para os poços. Para começar a fotografar as células, coloque a placa 96 em um microscópio fluorescente. Use uma marca fiduciária exclusiva de cada placa como referência para alinhamento futuro e salve uma imagem para referência futura.
Em seguida, navegue até áreas de interesse e regissuça suas coordenadas x e y em relação à marca. Use uma marca fiduciária exclusiva de cada placa como referência para alinhamento futuro e salve uma imagem para referência futura. Finalmente, concentre-se nas células transfeinadas expressando um rótulo fluorescente.
Tire várias imagens em intervalos regularmente espaçados nos canais fluorescentes apropriados. Para começar com o processamento de imagens, clique duas vezes no ícone Fiji. Em seguida, clique e arraste a imagem sublinhando o processamento macro para a barra fiji para abrir a macro dentro de Fiji.
Ajuste as linhas de duas a sete da macro de processamento de sublinhado da imagem de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, clique na costura e, em seguida, costura de grade/coleta. Ajuste as configurações dentro dos menus suspensos, digite e peça, até que uma imagem com precisão seja produzida.
Ajuste as variáveis de tipo de grade e ordem de ponto nas linhas oito e nove de acordo com essas seleções. Em seguida, ajuste a linha 10 para especificar o número de imagens por poço e defina a opção de subtração de fundo na linha 14 para verdade, se necessário. Ajuste a linha 15 para definir o raio da bola rolando de acordo com o protocolo de texto e clique em Executar.
Finalmente, abra as pilhas de imagens de saída e identifique manualmente os neurônios mortos de acordo com o protocolo de texto. Registo os dados em um arquivo de planilha. Para realizar análises estatísticas, clique duas vezes no ícone para sobreviver.
R script. Destaque a linha dois e clique no botão executar para carregar a biblioteca de sobrevivência. Em seguida, altere o caminho na linha cinco para chamar a planilha de entrada e clique no botão executar.
Destaque as linhas oito e nove e clique no botão executar para realizar a análise de riscos proporcionais de Cox. Linhas de destaque 12 a 16 e 19 a 24. Clique no botão executar para traçar o risco cumulativo de morte e os dados de sobrevivência como uma curva Kaplan-Meier.
Neste estudo, os neurônios cortical de ratos foram transfectados a quatro dias após o revestimento com um plasmídeo codificando a proteína fluorescente M maçã. 24 horas após a transfecção, os neurônios foram imagens por microscopia de fluorescência a cada 24 horas por 10 dias consecutivos. Após a aquisição da imagem, as imagens foram processadas e examinadas sequencialmente para marcar a morte da célula.
A hora da morte de cada célula foi determinada por mudanças na fluorescência, morfologia e fragmentação do corpo celular. A análise de riscos proporcionais de Cox realizada nos dados de sobrevivência dos neurônios mutantes resultou em uma razão de risco de 2,2. Este resultado indicou uma taxa mais rápida de morte nos neurônios mutantes em comparação com a população do tipo selvagem.
A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este procedimento é pipetar cuidadosamente. Minimizar a exposição ao ar e evitar bolhas é fundamental para uma transfecção bem sucedida. Após a transfecção, a microscopia de fluorescência longitudinal pode ser usada para rastrear vários fatores que podem contribuir para a morte celular, incluindo localização de proteínas, rotatividade e nível de expressão, além da sobrevivência celular.
No campo da neuro degeneração, a natureza dinâmica da microscopia longitudinal lançou luz sobre se a agregação de proteínas associadas à doença representa um evento tóxico ou protetor. Nenhum desses reagentes ou instrumentos são perigosos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para monitorar a sobrevivência celular em nível de única célula, a fim de identificar preditores de morte ou sobrevivência celular. Utilizando microscopia longitudinal, o método acompanha neurônios corticais individuais quanto a alterações na viabilidade ao longo do tempo, particularmente no contexto de doenças neurodegenerativas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa em Doenças Neurodegenerativas
Contexto
- Ensaios convencionais de citotoxicidade avaliam populações celulares, mas não conseguem discriminar células individuais.
- A microscopia longitudinal permite o rastreamento da sobrevivência e morte de células individuais.
- Este método é particularmente útil para estudar os mecanismos de neurodegeneração.
- Os pesquisadores frequentemente enfrentam desafios com a eficiência de transfeção durante estudos celulares.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para monitorar a sobrevivência e a morte de células neuronais.
- Identificar variáveis que influenciam significativamente o destino celular.
- Aplicar essas descobertas a possíveis novas terapias para doenças neurodegenerativas.
Métodos Utilizados
- Utilizou métodos de cultivo celular com neurônios corticais.
- Transfetou neurônios com um plasmídeo fluorescente para permitir a imagem da morte celular ao longo de um período de 10 dias.
- Envolveu etapas cuidadosas de pipetagem e incubação para garantir transfeção bem-sucedida.
- Os métodos analíticos incluíram análise de riscos proporcionais de Cox e traçado de curvas de sobrevida de Kaplan-Meier.
Resultados Principais
- O estudo identificou uma razão de risco de 2,2, indicando uma taxa mais rápida de morte para neurônios mutantes em comparação com o tipo selvagem.
- A morte celular foi determinada por alterações na fluorescência e na morfologia observadas ao longo do tempo.
- Também foram obtidos insights sobre a dinâmica da agregação de proteínas e suas implicações para condições neurodegenerativas.
Conclusões
- Este protocolo permite uma análise detalhada da morte celular, fornecendo informações sobre os mecanismos de sobrevivência neuronal.
- Os achados têm implicações significativas para o desenvolvimento de terapias direcionadas a doenças neurodegenerativas.
- No geral, o método aprimora a compreensão das respostas celulares em diversas condições nas quais a morte celular é crítica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia de fluorescência longitudinal permite a resolução em nível de célula única da sobrevivência neuronal, abordando uma limitação fundamental dos ensaios de citotoxicidade baseados em populações na pesquisa de doenças neurodegenerativas. Ao acompanhar células individuais ao longo do tempo, o método apoia a desmistificação mecanicista de hipóteses terapêuticas e melhora a confiança preditiva na validação de alvos. Essa capacidade aprimora a triagem de portfólios ao distinguir condutores patogênicos de respostas homeostáticas em eventos subcelulares, como agregação ou deslocalização proteica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao vincular eventos subcelulares a desfechos do destino celular com inferência causal.
- Valor Operacional: Oferece resolução em nível de célula única para discriminar fatores causadores patogênicos de fenômenos coincidentais em populações neuronais.
- Valor Preditivo: Permite a estimativa da razão de risco por meio da análise de riscos proporcionais de Cox para quantificar modificadores do risco de sobrevida.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera dados de tempo até o evento para cada célula, permitindo análise quantitativa de sobrevivência além das medidas de viabilidade em ponto final.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho de imagem longitudinal com marcação fiducial e montagem automatizada para rastreamento reprodutível em múltiplas poças.
- Prontidão do Ensaio: Produz pilhas de imagens processadas adequadas para pontuação manual ou automatizada de morte com base em fluorescência, morfologia e fragmentação.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Conecta perturbações moleculares (por exemplo, expressão de proteína mutante) a desfechos de sobrevivência em culturas primárias de neurônios relevantes para a doença.
- Redução Mecanística de Riscos: Esclarece se a agregação proteica é tóxica ou protetora ao correlacionar a formação de pontos com o momento da morte.
- Continuidade Pré-clínica: Permite a avaliação longitudinal de modificadores candidatos em modelos de doenças neurodegenerativas antes da validação in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a otimização do composto líder, especialmente para programas voltados à neurodegeneração que exigem leituras fenotípicas dinâmicas.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses sobre os efeitos de genes ou proteínas na sobrevivência neuronal utilizando culturas primárias marcadas com fluorescência.
- Triagem Fornece saídas quantitativas e resolvidas no tempo, adequadas para modelagem de sobrevivência e análise comparativa de condições.
- Análise de dados: Fornece dados de tempo de sobrevida compatíveis com os modelos de Cox de riscos proporcionais e estimativa de Kaplan-Meier para quantificação do tamanho do efeito.
- Pesquisa Translacional Associa fenótipos de sobrevivência in vitro a mecanismos de doença em neurônios corticais primários, um modelo translacional para neurodegeneração humana.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho reutilizável de imagem e análise para estudos longitudinais de linhagem celular em múltiplos sistemas neuronais ou gliais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade nos vínculos mecanicistas entre eventos moleculares e morte celular.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de etapas padronizadas de transfeção, aquisição de imagens e processamento de imagens, incluindo alinhamento com marcos fiduciais e subtração de fundo.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de prosseguir/interromper ao fornecer estimativas do tamanho do efeito (por exemplo, razão de risco) em vez de resultados binários de viabilidade.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na modulação de sobrevivência quantificada em contextos neuronais relevantes para humanos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura primária de neurônios, otimização de transfeção e microscopia de fluorescência para minimizar a toxicidade e maximizar a detecção de sinal.
- Depende da eficiência de transfeção estável e da expressão de proteínas fluorescentes para o rastreamento longitudinal confiável de células individuais.
- Necessita de intervalos padronizados de aquisição de imagens e parâmetros de processamento (por exemplo, ordem de montagem, subtração de fundo) para garantir a consistência dos dados entre poços e placas.
- Envolve a validação manual de morte celular com base em critérios morfológicos e de fluorescência, exigindo verificações de confiabilidade entre avaliadores para escalabilidade.
- Limitado pelos riscos de fototoxicidade durante imagens frequentes, exigindo otimização da potência do laser, tempo de exposição e seleção de comprimento de onda.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
1:06
Transfection of Rat Cortical Neurons
2:22
Imaging
3:09
Image Processing and Scoring Cell Death
4:35
Performing Cox Proportional Hazards Analysis and Visualizing Results
5:19
Results: Assessing Neuronal Survival on a Single-cell Basis
6:16
Conclusion
