Medição altamente sensível da permeabilidade glomerular em camundongos com isotiocianato de fluoresceina-polisacarose 70

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da nefrologia sobre o papel da permeabilidade glomerular na doença renal. A principal vantagem desta técnica é que pequenos e transitórios aumentos de permeabilidade glomerular são detectados usando um rastreador fluorescente rotulado de chumbo. Após anestesia, coloque um cateter urinário no rato fêmea.

Posicione o rato em recumbência dorsal. Aperte o abdômen inferior e encontre o ostium uretral. Obtenha a parte plástica do cateter de um angiocatheter de 22 G e lubrifique-a com gel de xilocaine.

Use o dedo indicador esquerdo para colocar uma tensão cuidadosa no abdômen inferior e introduzir o cateter três milímetros no ostium uretral, paralelamente ao eixo uretratal distal. Gire a parte superior do angiocateter 180 graus mantendo a ponta dentro do ostium uretral e mantendo o eixo da uretra. Em seguida, introduza o cateter sete milímetros mais adiante no mouse para que ele seja colocado dentro da bexiga.

Coloque um tubo marrom de 1,5 mililitro sobre a parte superior do angiocateter para coletar a urina. Aplique um mililitro de cloreto de sódio de 0,9% subcutâneamente para melhorar a produção de urina. Raspe o pescoço do rato e coloque-o em recumbência com a cabeça em direção ao cirurgião.

Hiper estenda a cabeça do mouse com uma fita. Desinfete o pescoço com 70% de isopropanol. Usando uma pinça e um par de tesouras faça uma incisão de pele de cinco milímetros abaixo da mandíbula.

Corte a pele aproximadamente um centímetro na direção do esterno até que o meio do esterno seja atingido. Use uma tesoura. Dissecar cuidadosamente a pele para o lado direito do pescoço.

Faça uma incisão retangular da pele à direita para expor o tecido mole do pescoço. Tenha cuidado para não danificar a veia jugular. Use um par de tesouras e uma pinça para fixar os retalhos da pele com dois grampos.

Utilizando a ponta da pinça fina, exponha cuidadosamente a veia jugular por preparação contundente. Se necessário, remova o tecido com uma tesoura fina. Evite ferimentos nos galhos da veia.

Coloque e feche uma ligadura com um fio de seda na parte distal da veia jugular visível que está em direção à cabeça do rato. Fixar o fio de seda com uma fita para colocar tensão na ligadura. Isso garante uma leve tensão na veia jugular.

Prepare uma ligadura em torno da parte proximal da veia jugular. Depois disso, encha o cateter com a solução de equilíbrio e fusão. Conserte o cateter com uma fita para que o cateter esteja alinhando a veia jugular.

Controle de bolhas para evitar embolia de ar. Levante a veia jugular com pinças finas no local da inserção. Alinhe o tubo paralelo à veia jugular e perfure a veia jugular visando o lúmen.

Insira por aproximadamente dois a quatro milímetros paralelamente ao eixo da veia jugular. Evite movimentos rápidos. Feche a ligadura para consertar o cateter.

Controle para o aperto da ligadura visualizando cuidadosamente através do microscópio. Coloque um cotonete úmido sobre o local da cirurgia. Coloque a braçadeira na parte inferior da cauda do rato enquanto o mouse fica em recumedência dorsal.

Inicie as medições e repita-as dez vezes por ponto de tempo. Se as medidas da pressão arterial não parecerem corretas e forem produzidos dados falsos, ajuste a posição do manguito da cauda. Antes da fase de equilíbrio, troque o tubo de coleta urinária e coloque-o no gelo.

Dobre um cotonete e coloque-o ao redor do pequeno cateter do vaso que é introduzido na veia jugular. Coloque um grampo sobre o cotonete para abolir o fluxo sanguíneo retrógrado ou embolia do ar. Conecte uma agulha de 27 G com uma seringa de um mililitro preenchida com o bolus FITC até a extremidade do cateter do pequeno vaso.

Abra o grampo e aplique o bolus FITC de 100 microliter. Feche novamente o grampo e conecte o cateter maior com o cateter menor. Reabra o grampo e inicie a bomba de seringa com uma vazão de 0,008 mililitros por minuto.

Continue a infusão por 60 minutos. Nesta fase, são investigadas as drogas eficazes na seletividade glomerular perm. Mude o tubo urinário ponto de tempo zero minuto para outro tubo marrom de 1,5 mililitro.

Coloque um cotonete ao redor do cateter do pequeno vaso e desconecte o cateter grande do cateter do pequeno vaso. Encha a seringa com a solução de fase experimental. Coloque-a na bomba de seringa e deixe a bomba de infusão funcionar para que o cateter grande seja preenchido com a solução de fase experimental.

Reconecte os cateteres enquanto evita a embolia do ar e reabra o grampo. Inicie a bomba de seringa à taxa de fluxo de 0,008 mililitro por minuto. Continue executando a bomba de seringa por 60 minutos e colete a urina dentro do tubo urinário depois disso.

Coloque o tubo de urina no gelo. Neste estudo, a fluorescência da urina de camundongos nativos mostra um pico de 395 nanômetros. FITC polisucrose 70 a uma concentração de 40 microgramas por mililitro na urina do rato exibe um máximo de fluorescência em 525 nanômetros.

A urina do rato não perturba a medição da fluorescência da polisucrose FITC 70. Na admissão de 525 nanômetros, o aumento das concentrações de polisucrose FITC 70 mostra um aumento da intensidade da fluorescência. Este método também é capaz de detectar diferenças na permeabilidade glomerular.

As colunas brancas representam polisucrose FITC 70 níveis antes do início da estimulação da angiotensina II na fase experimental. Após dosagens por 60 minutos, a permeabilidade glomerular aumentou em comparação com o grupo controle. angiotensina II lavar-se diminuiu a permeabilidade glomerular.

Os níveis de polisucrose FITC diminuíram após 60 minutos adicionais de estimulação de angiotensina II ou 60 minutos de lavagem de angiotensina II. O aumento da permeabilidade glomerular devido à angiotensina II pode ser bloqueado por um bloqueador receptor de angiotensina II. A pressão arterial monitorada pelo método do manguito da cauda não apresentou diferenças significativas entre os grupos tratados de controle e angiotensina II.

Ao tentar este procedimento é importante evitar a embolia do ar ao mudar as soluções de infusão.