Name: Medição altamente sensível da permeabilidade glomerular em camundongos com isotiocianato de fluoresceina-polisacarose 70 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a medir a permeabilidade glomerular em camundongos usando um traçador fluorescente sensível. Este método permite análises urinárias repetitivas com volumes mínimos, auxiliando pesquisas em nefrologia e doenças renais.

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Os autores agradecem Christina Schwandt, Blanka Duvnjak, e Nicola Kuhr por sua assistência técnica excepcional e Dr. Dennis Sohn por sua ajuda com a varredura de fluorescência. Esta pesquisa foi apoiada por uma subvenção da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 para L.C.R. e L.S. O financiador não teve papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

As investigações foram conduzidas de acordo com as diretrizes delineadas no guia de cuidados e uso de animais de laboratório (institutos nacionais de saúde da publicação n º 85-23, revisado em 1996). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as aprovações institucionais relevantes (governo estadual Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] número de referência 84-02.04.2012. A397).
1. preparação de instrumentos, soluções e equipamentos
<ol><li>Reconstituir FITC-polysacarose 70 com 0,9% de cloreto de sódio estéril (NaCl) a uma concentração final de 10 mg/mL (i.e., 100 mg em 10 mL de NaCl).</li>
	<li>Dialyze FITC-polysacarose 70 solução para remover moléculas FITC livres durante a noite a 4 ° c (corte de peso molecular [MWCO] em 10.000). Use 1 L de 0,9% de NaCl estéril por 10 mL de FITC-polysacarose 70 agitação constante. Proteja da luz. Aliquot o FITC-polysacarose diafiltrado 70 e armazená-lo em-20 ° c.</li>
	<li>Para o FITC-polysacarose 70 bolus, adicionar 4 μL de 10 mg/mL FITC-polysacarose 70 solução para 996 μL de 0,9% NaCl (a concentração final de FITC-polysacarose 70:40 μg/mL).</li>
	<li>Para a solução de infusão de equilibração, adicione 20 μL de uma solução de FITC-polysacarose 70 de 10 mg/mL a 9,98 mL de NaCl estéril de 0,9% que rende a uma concentração final de 20 μg/mL.</li>
	<li>Para a solução experimental, adicione medicamentos ou substâncias à solução de perfusão (por exemplo, para a angiotensina II [Ang II] [100 ng/kg/min] para um rato de 25 g, adicione 3 μL de Ang II de uma solução de 1 mM).</li>
	<li>Para a cirurgia, prepare uma máquina de barbear, duas braçadeiras cirúrgicas, um par de tesouras cirúrgicas, duas pinças, duas pinças finas, um par de tesouras finas e cotonetes. Prepare linhas de seda de 2 10 cm (4-0 a 6-0) para procedimentos de ligadura.</li>
	<li>Para a colocação de um cateter venoso central, prepare uma seringa de 10 mL com uma agulha de 21 G. Coloque a ponta da agulha em um cateter de 30 cm de comprimento (com um diâmetro interno [ID] de 0,58 mm). Ligue o cateter de 0,58 mm a um cateter de 10 cm (com um ID de 0,28 mm). Corte a ponta do cateter mais pequeno oblíquo para criar uma ponta afiada que seja introduzida na veia de jugular.</li>
	<li>Prepare a anestesia (i.e., anestesia intraperitoneal cetamina, 100 mg/kg de peso corporal, e xilazina, 5 mg/kg de peso corporal).</li>
	<li>Prepare um angiocatômetro de 22 G descartando a agulha e marcando o cateter a 1 cm da ponta. Pré-aqueça a almofada de aquecimento a 37 ° c.</li>
	<li>Prepare um dispositivo de pressão arterial e mude a membrana de medição de pressão sanguínea, se necessário.</li>
</ol>2. fase de preparação
<ol><li>Cateter urinário Nota: a seção 2,1 segue o protocolo conforme descrito por reis et al.7. A Figura 1 e a Figura 1 suplementar mostram a colocação de um cateter urinário em camundongos fêmeas.<ol>
<li>Anestesie o rato com cetamina/xilazina (ver passo 1,8). Use o teste do dedo do pé-pitada para confirmar a anestesia apropriada. Para manter a anestesia, repita a anestesia (por exemplo, com metade da dosagem) após 60 min. a anestesia apropriada é confirmada se o teste da pitada do dedo do pé não resultar na retirada do reflexo. Nota: ratos FVB fêmeas são utilizados neste protocolo.</li>
		<li>Posicione o mouse na recumbência dorsal em uma almofada de aquecimento de 37 ° c. Aperte o abdômen inferior e encontrar o óstio uretral (por exemplo, um microscópio).</li>
		<li>Use a parte plástica do cateter de um angiocatheter de 22 G e lubrifica-a com o gel do xilocaína. Introduza-o com cuidado 3 milímetros no óstio uretral ao paralelalizar o eixo uretral longe do ponto de origem (Figura 1a).</li>
		<li>Gire a parte superior do angiocatheter 180 ° mantendo a ponta dentro do óstio uretral e mantendo o eixo da uretra (Figura 1b).</li>
		<li>Introduzir o cateter 7 mm mais no rato para que seja colocado dentro da bexiga (Figura 1C). Não force o cateter para além da resistência. Corrija a posição do cateter desde o início se a resistência for sentida. Tome nota de que se a posição do cateter urinário estiver correcta, a urina já pode aparecer dentro do cateter.</li>
		<li>Coloc um tubo marrom de 1,5 mL sobre a parte superior do angiocatheter para recolher a urina. Aplique 1 ml de 0,9% de NaCl por via subcutânea para realçar a produção de urina.</li>
	</ol></li>
	<li>Cateter venoso central
	<ol>
<li>Raspar o pescoço do mouse e colocá-lo em decúbito com a cabeça em direção ao cirurgião. Hyperextend a cabeça do rato com uma fita.</li>
		<li>Desinfecte o pescoço com isopropanol a 70%. Faça uma incisão pequena da pele (5 milímetros) abaixo do jawline, usando um pinça e um par de tesouras. Corte a pele aproximadamente 1 cm na direção do esterno até que o meio do esterno seja atingido.</li>
		<li>Dissecar cuidadosamente a pele no lado direito do pescoço, usando um par de tesouras. Faça uma incisão retangular da pele para o lado direito do mouse para expor o tecido mole do pescoço. Use um par de tesouras e um tweezer. Fixar as abas da pele com duas braçadeiras. Nota: a veia jugular corre ao longo do lado esquerdo da glândula tireóide ou é ligeiramente coberta pelo lobo direito da glândula tireóide. Após esta etapa, use um microscópio para a cirurgia.</li>
		<li>Expor cuidadosamente a veia jugular por meio de uma preparação sem corte, usando a ponta da pinça fina. Evite lesões nos ramos das veias. Nota: pode ser necessário remover o tecido com tesouras finas. Tenha cuidado ao usar tesouras para remover o tecido, pois aumenta o risco de sangramento.</li>
		<li>Coloc e feche uma ligadura com uma linha de seda (4-0 a 6-0) na parte longe do ponto de origem da veia de jugular visível (para a cabeça do rato). Põr a tensão sobre a ligadura fixando a linha de seda com uma fita para assegurar a tensão ligeira na veia de jugular. Prepare uma ligadura em torno da parte proximal da veia jugular.</li>
		<li>Encha o cateter com a solução de infusão de equilíbrio (ver passo 1,4) e fixe o cateter com uma fita para que o cateter alinhe a veia jugular. Controle de bolhas para evitar o embolismo aéreo.</li>
		<li>Levante a veia jugular com pinças finas no local de inserção (o local de inserção é de 1 – 2 mm proximal da ligadura). Alinhe a tubagem paralela à veia jugular. Perfure a veia jugular, visando o lúmen, e insira por aproximadamente 2 – 4 mm, paralelhando o eixo da veia jugular. Evite quaisquer movimentos Brisk.</li>
		<li>Feche a ligadura para fixar o cateter. Controle para a estanqueidade da ligadura através da visualização cuidadosa através do microscópio. Coloque um cotonete úmido sobre o local da cirurgia.</li>
	</ol></li>
	<li>Medição da pressão arterial
	<ol>
<li>Coloque a cauda-manguito na parte inferior da cauda do mouse, enquanto o mouse se coloca em recumbency dorsal. Iniciar as medições e repeti-los 10x por ponto de tempo. Construa uma média a partir das medições.</li>
		<li>Ajuste a posição da cauda-braçadeira se as medidas da pressão sanguínea não parecerem corretos e os dados falsos são produzidos.</li>
	</ol></li>
</ol>3. fase de equilibração
<ol><li>Alterar o tubo de coleta urinária antes da fase de equilíbrio começa e colocá-lo no gelo.</li>
	<li>Introduza uma seringa de 10 mL preenchida com uma solução de fase de equilibração FITC (ver passo 1,4) com uma agulha de 21 G e o cateter maior (com um ID de 0,58 mm) e coloque-o na bomba da seringa.</li>
	<li>Dobre um cotonete e coloque-o em torno do cateter da pequeno-embarcação (com uma identificação de 0,28 milímetros) que seja introduzido na veia de jugular. Coloque o cateter dentro do cotonete. Coloque um grampo sobre o cotonete para abolir o fluxo sanguíneo retrógrado ou embolia aérea. Ligue uma agulha de 27 G com uma seringa de 1 mL preenchida com o bolus FITC até ao fim do cateter de pequeno vaso.</li>
	<li>Abra o grampo e aplique o bolus FITC (100 μL). Feche a braçadeira novamente e conecte o cateter maior com o cateter menor. Iniciar a bomba da seringa com 0, 8 mL/min (0,480 mL/h). Continuar a perfusão durante 60 min.</li>
</ol>4. fase experimental
Nota: nesta fase, o efeito de fármacos na permseletividade glomerular pode ser investigado.
<ol><li>Mude o tubo urinário (ponto de tempo 0 min) para outro tubo castanho 1,5 mL. Coloque um cotonete em torno do cateter de pequeno vaso e feche um grampo como indicado na etapa 3,3.</li>
	<li>Desconecte o cateter grande do cateter da pequeno-embarcação. Mude as seringas para as soluções de fase experimental (ver passo 1,5). Deixe a bomba da infusão funcionar de modo que o grande cateter esteja enchido com a solução do equilíbrio.</li>
	<li>Reconecte os cateteres evitando o embolismo de ar e reabra a braçadeira. Ligue a bomba da seringa a 0, 8 mL/min.</li>
	<li>Continue a correr a bomba da seringa para 60 min e recolher a urina dentro do tubo urinário depois disso (urina 60 min). Coloque o tubo de urina no gelo.</li>
	<li>Sacrifique o rato por luxação cervical durante a anestesia. Antes da eliminação, o rato é observado durante 5 minutos para garantir que está morto.</li>
</ol>5. análise de urina
<ol><li>
Medição de fluorescência
	<ol>
<li>Descongelar a piscina urinária e dilui-lo 1:10 com tampão fosfato salina (PBS). Nota: a piscina urinária é um conjunto de urina que foi coletado de camundongos saudáveis em uma coleta de urina de 12 a 24 h em uma gaiola metabólica.</li>
		<li>Prepare padrões para a medição de fluorescência. Tomar 10 tubos castanhos 1,5 mL e rotulá-los para o espaço em branco (1:10 urina diluída) e as seguintes concentrações de FITC-polysacarose 70 (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 μg/mL).</li>
		<li>Pipet 246 μL de piscina de urina diluída num tubo castanho 1,5 mL e adicionar 4 μL da concentração de FITC-polysacarose 70 (ver passo 1,1) para obter uma concentração final de 160 μg/mL FITC-polysacarose 70. Pipet 100 μL da piscina de urina diluída em todos os outros tubos.</li>
		<li>Diluir 1:2 pipetando 100 μL do tubo de 160 μg/mL de FITC-polysacarose 70 para o tubo de 80 μg/mL e continuar com as outras concentrações. Assegure a mistura adequada das concentrações diluídas (por exemplo, por vortexing o tubo antes de continuar).</li>
		<li>Diluir as amostras de urina do rato (0 min, 60 min) 1:10 com piscina urinária diluída.</li>
		<li>Pipete 5 μL de cada concentração de FITC-polysacarose 70 padrão e das amostras de urina do rato como triplica numa placa preta 384-well. Centrifugue a placa a 1.000 x g por 15 s para evitar bolhas.</li>
		<li>Analise a placa 384-well em um leitor da placa. Realize a excitação a 496 nm e meça a fluorescência a 525 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medição da creatinina
	<ol>
<li>Siga as instruções do fabricante. Em resumo, prepare os padrões de creatinina diluindo 10 μL da solução padrão de creatinina de 100 mM com 990 μL de tampão de ensaio de creatinina para preparar uma solução padrão de 1 mM.</li>
		<li>Adicione 0, 2, 4, 6, 8 e 10 μL da solução padrão de 1 mM de creatinina em uma placa 96-well para gerar padrões de 0, 2, 4, 6, 8 e 10 nmol/poço, respectivamente. Adicione o tampão do ensaio da creatinina a cada poço para trazer o volume a 50 μL.</li>
		<li>Prepare as misturas de reacção adicionando 42 – 44 μL de tampão de ensaio de creatinina, 2 μL de creatinase, 2 μL de creatininase, 2 μL de mistura enzimática de creatinina e 2 μL de sonda de creatinina. Para o espaço em branco, use 44 μL de tampão de ensaio de creatinina, 2 μL de creatinase, 2 μL de mistura enzimática de creatinina e 1 – 2 μL de sonda de creatinina.</li>
		<li>Adicionar 50 μL da mistura de reacção adequada a cada poço na placa de 96 poços e incubar-o durante 60 min num agitador horizontal a 37 ° c. Proteja a placa da luz durante a incubação. Meça a absorvência em 570 nanômetro em um leitor da placa.</li>
		<li>Calcule as concentrações de creatinina subtraindo o valor em branco de todas as leituras. O resultado terá a unidade nanomoles/microlitro. Multiplicar a concentração de creatinina pelo peso molecular da creatinina (113,12 ng/nmol) para receber a unidade nanogramas/microlitro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. análise de dados
<ol><li>Calcule a concentração de urina FITC-polysacarose 70 da curva padrão.</li>
	<li>Consulte as concentrações de urina FITC-polysacarose 70 em concentrações de creatinina na amostra de urina representativa.</li>
	<li>Consulte as amostras de urina 60 min para amostras de urina 0 min de controles e camundongos tratados.</li>
</ol>

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<li>Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+renal+ischemia-reperfusion+reduces+charge+and+size+selectivity+of+the+glomerular+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).</li>
<li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction%3A+effects+of+Tempol%2C+NOS%2C+RhoA%2C+and+Rac-1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).</li>
<li>Rosengren, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+protein+transport+in+mice+lacking+endothelial+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).</li>
<li>Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+simultaneous+measurement+of+mouse+systolic+arterial+blood+pressure+by+radiotelemetry+and+tail-cuff+methods%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).</li>
<li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li>
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Os autores não têm nada a revelar.

O método apresentado permite ao investigador testar a permeabilidade glomerular em camundongos de uma maneira muito sensível usando um traçador. Com este método, os aumentos a curto prazo na permeabilidade glomerular podem ser diagnosticados usando somente pequenas quantidades de urina. As etapas mais críticas para dominar com sucesso esta técnica são 1) desenvolver a perícia manual na cirurgia do rato, especial no canulação de uma veia central, 2) coloc o cateter urinário sem prejudicar a mucosa, e 3) perícia manual em ...

Defeitos funcionais ou estruturais dentro da barreira de filtração glomerular aumentam a permeabilidade glomerular à albumina, resultando na detecção de albumina na urina (albuminúria). A albuminúria preafirma o desfecho cardiovascular e é um importante marcador para lesão glomerular1. Mesmo os baixos níveis de albuminúria, encontrando-se dentro da escala normal, são associados com um risco cardiovascular aumentado1.
condições fisiológicas, a albumina é filtrada através do glomérulo e é quase completamente reabsorvida no sistema tubular2,3. Em camundongos, a detecção de albumina na urina é geralmente realizada por um ensaio imunoenzimático de albumina (ELISA) a partir de 24 h de coleta de urina. Se a urina de uma coleta de urina de 24 h ou urina local for usada, pequenas diferenças nas concentrações de albumina podem ser perdidas devido a problemas de sensibilidade do ensaio. A maioria dos pesquisadores, portanto, usam modelos animais em que a albuminúria é induzida por lesão renal robusta devido a toxinas, drogas e Cirurgia renal.
Portanto, o achado de um método sensível para detectar alterações pequenas e transitórias na permeabilidade glomerular é muito importante para o campo. Rippe et al. apresentaram um modelo de rato para testar a permeabilidade glomerular aplicando um traçador fluorescentamente rotulado, a saber FITC-polysacarose 70 (ou seja, FITC-Ficoll 70), no tamanho da albumina4. A aplicação do traçador permite o teste de mudanças a curto prazo na permeabilidade glomerular (dentro dos minutos) e é muito sensível4. Dois estudos utilizaram o método Tracer em camundongos5,6. Apesar de seus benefícios, este método, infelizmente, tem desvantagens: é tecnicamente muito complexo, radioativo e invasivo. Uma análise mais adicional da urina é conseguida somente usando a filtração do gel ou a HPLC5,6da tamanho-exclusão.
Neste trabalho, apresentamos um método alternativo, sensível, não radioativo e rápido para medir a permeabilidade glomerular em camundongos utilizando FITC-polysacarose 70 fluorescentamente rotulado. Introduzindo um cateter transuretral, a coleção da urina é menos invasora do que a punctura da bexiga, o Urethrotomy, e a aplicação suprapúbica do cateter, e permite a coleção da urina pelo menos cada 30 minutos. a análise de urina é realizada a partir de pequenas quantidades (5μl) leitor de placas fluorescentes. As concentrações de traçador na urina são normalizadas para concentrações de creatinina na urina usando um ensaio de creatinina enzimática.
Conseqüentemente, este método novo oferece uma ferramenta sensível para estudar ferimento glomerular adiantado com permeabilidade glomerular aumentada.

<table><tbody><tr><td>Motic SMZ168 BL</td><td>Motic</td><td>microscópio SMZ168BL</td><td>para cirurgia de camundongos</td></tr><tr><td>KL1500LCD</td><td>Pulch e Lorenz microscopia</td><td>150500</td><td>luz para cirurgia de camundongos</td></tr><tr><td>Microfederschere</td><td>Braun, Aesculap</td><td>FD100R</td><td>tesoura fina</td></tr><tr><td>Durotip Feine Scheren</td><td>Braun, Aesculap</td><td>BC210R</td><td>para corte de pescoço</td></tr><tr><td>Anatomische Pinzette</td><td>Braun, Aesculap</td><td>BD215R</td><td>para cirurgia&nbsp;</td></tr><tr><td>Pr&auml; parierklemme</td><td>Aesculap</td><td>BJ008R</td><td>para cirurgia&nbsp;</td></tr><tr><td>Seraflex</td><td>Serag Wiessner</td><td>IC108000</td><td>fio de seda</td></tr><tr><td>Cetamina 10%</td> <td>Medistar</td><td></td><td>anestesia</td></tr><tr><td>Rompun (xilazina) 2%</td> <td>anestesia Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno de furo fino ID 0,28 mm OD 0,61 mm</td><td>Portex</td><td>800/100/100</td><td>Cateter</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno de furo fino ID 0,58 mm OD 0,96 mm</td><td>Cateter Portex</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho Harvard 11 Plus</td><td>Aparelho Harvard</td><td>70-2209</td><td>bomba de seringa</td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381823</td><td>&nbsp; cateter urinário</td></tr><tr><td>Detector multimodo DTX 880</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>leitor de placas</td></tr><tr><td>384 poços microtitulação</td><td>Nunc</td><td>262260</td><td>384 placas de 384 poços</td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Creatinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK080</td><td>para medir a concentração de creatinina</td></tr><tr><td>placa de 96 poços</td><td>Nunc</td><td>260836</td><td>para ensaio de creatinina&nbsp;</td></tr><tr><td>Polissuccrose marcada com FITC 70</td><td>TBD Consultoria</td><td>FP70</td><td>FITC-ficoll</td></tr><tr><td>Angiotensina II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525</td><td>usado para testar a permeabilidade glomerular</td></tr><tr><td>BP-98A</td><td>Softron</td><td></td><td>para medição da pressão arterial</td></tr><tr><td>OTS 40.3040</td><td>Medite</td><td>01-4005-00</td><td>placa de aquecimento para cirurgia de camundongos</td></tr><tr><td>Instillagel 6mL</td><td>Farco-Pharma GmbH</td><td></td><td>para cateter urinário</td></tr><tr><td>Exacta</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>shaver</td></tr></tbody></table>

medição altamente sensível da permeabilidade glomerular em camundongos com isotiocianato de fluoresceina-polisacarose 70

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

A perda de albumina na urina (albuminúria) preafirma o desfecho cardiovascular. Em condições fisiológicas, pequenas quantidades de albumina são filtradas pelo glomérulo e reabsorvidas no sistema tubular até o limite de absorção ser atingido. Os aumentos adiantados na filtração patológica da albumina podem, assim, ser faltado analisando o Albuminuria. Portanto, o uso de traçadores para testar a permseletividade glomerular parece vantajoso. O isotiocianato do Tracer fluorescently etiquetado do fluoresceína (FITC)-polysacarose (isto é, FITC-Ficoll), pode ser usado para estudar o permselectivity glomerular. As moléculas FITC-polisacarose são livremente filtradas pelo glomérulo, mas não reabsorvidas no sistema tubular. Em camundongos e ratos, FITC-polysacarose tem sido investigado em modelos de permeabilidade glomerular usando procedimentos tecnicamente complexos (i.e., medições radioativas, cromatografia líquida de alta eficiência [HPLC], filtração de gel). Nós modificamos e facilitamos um protocolo Tracer-baseado do FITC-polysacarose para testar aumentos adiantados e pequenos na permeabilidade glomerular a FITC-polysacarose 70 (tamanho da albumina) nos ratos. Este método permite análises repetitivas da urina com volumes pequenos da urina (5 μL). Este protocolo contém informações sobre como o Tracer FITC-polysacarose 70 é aplicado por via intravenosa e a urina é coletada através de um cateter urinário simples. A urina é analisada através de um leitor de placas de fluorescência e normalizada para um marcador de concentração de urina (creatinina), evitando assim procedimentos tecnicamente complexos.

Conforme representado na Figura 2, o método para testar a permeabilidade glomerular em camundongos é construído em três fases. A primeira fase é denominada fase de preparação, na qual se colocam um cateter urinário e um cateter venoso central. A segunda fase é chamada de fase de equilíbrio, iniciando com uma injeção intravenosa de bóculo de FITC-polysacarose 70 e seguida pela infusão contínua de FITC-polysacarose 70 por 60 min. A última fase é chamada de fase...

Aqui, nós apresentamos um protocolo para testar a permeabilidade glomerular nos ratos usando um Tracer altamente sensível, nonradioativo. Este método permite análises repetitivas da urina com volumes pequenos da urina.

Medição altamente sensível da permeabilidade glomerular em camundongos com isotiocianato de fluoresceina-polisacarose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da nefrologia sobre o papel da permeabilidade glomerular na doença renal. A principal vantagem desta técnica é que pequenos e transitórios aumentos de permeabilidade glomerular são detectados usando um rastreador fluorescente rotulado de chumbo. Após anestesia, coloque um cateter urinário no rato fêmea.Posicione o rato em recumbência dorsal. Aperte o abdômen inferior e encontre o ostium uretral. Obtenha a parte plástica do cateter de um angiocatheter de 22 G e lubrifique-a com gel de xilocaine.Use o dedo indicador esquerdo para colocar uma tensão cuidadosa no abdômen inferior e introduzir o cateter três milímetros no ostium uretral, paralelamente ao eixo uretratal distal. Gire a parte superior do angiocateter 180 graus mantendo a ponta dentro do ostium uretral e mantendo o eixo da uretra. Em seguida, introduza o cateter sete milímetros mais adiante no mouse para que ele seja colocado dentro da bexiga.Coloque um tubo marrom de 1,5 mililitro sobre a parte superior do angiocateter para coletar a urina. Aplique um mililitro de cloreto de sódio de 0,9% subcutâneamente para melhorar a produção de urina. Raspe o pescoço do rato e coloque-o em recumbência com a cabeça em direção ao cirurgião.Hiper estenda a cabeça do mouse com uma fita. Desinfete o pescoço com 70% de isopropanol. Usando uma pinça e um par de tesouras faça uma incisão de pele de cinco milímetros abaixo da mandíbula.Corte a pele aproximadamente um centímetro na direção do esterno até que o meio do esterno seja atingido. Use uma tesoura. Dissecar cuidadosamente a pele para o lado direito do pescoço.Faça uma incisão retangular da pele à direita para expor o tecido mole do pescoço. Tenha cuidado para não danificar a veia jugular. Use um par de tesouras e uma pinça para fixar os retalhos da pele com dois grampos.Utilizando a ponta da pinça fina, exponha cuidadosamente a veia jugular por preparação contundente. Se necessário, remova o tecido com uma tesoura fina. Evite ferimentos nos galhos da veia.Coloque e feche uma ligadura com um fio de seda na parte distal da veia jugular visível que está em direção à cabeça do rato. Fixar o fio de seda com uma fita para colocar tensão na ligadura. Isso garante uma leve tensão na veia jugular.Prepare uma ligadura em torno da parte proximal da veia jugular. Depois disso, encha o cateter com a solução de equilíbrio e fusão. Conserte o cateter com uma fita para que o cateter esteja alinhando a veia jugular.Controle de bolhas para evitar embolia de ar. Levante a veia jugular com pinças finas no local da inserção. Alinhe o tubo paralelo à veia jugular e perfure a veia jugular visando o lúmen.Insira por aproximadamente dois a quatro milímetros paralelamente ao eixo da veia jugular. Evite movimentos rápidos. Feche a ligadura para consertar o cateter.Controle para o aperto da ligadura visualizando cuidadosamente através do microscópio. Coloque um cotonete úmido sobre o local da cirurgia. Coloque a braçadeira na parte inferior da cauda do rato enquanto o mouse fica em recumedência dorsal.Inicie as medições e repita-as dez vezes por ponto de tempo. Se as medidas da pressão arterial não parecerem corretas e forem produzidos dados falsos, ajuste a posição do manguito da cauda. Antes da fase de equilíbrio, troque o tubo de coleta urinária e coloque-o no gelo.Dobre um cotonete e coloque-o ao redor do pequeno cateter do vaso que é introduzido na veia jugular. Coloque um grampo sobre o cotonete para abolir o fluxo sanguíneo retrógrado ou embolia do ar. Conecte uma agulha de 27 G com uma seringa de um mililitro preenchida com o bolus FITC até a extremidade do cateter do pequeno vaso.Abra o grampo e aplique o bolus FITC de 100 microliter. Feche novamente o grampo e conecte o cateter maior com o cateter menor. Reabra o grampo e inicie a bomba de seringa com uma vazão de 0,008 mililitros por minuto.Continue a infusão por 60 minutos. Nesta fase, são investigadas as drogas eficazes na seletividade glomerular perm. Mude o tubo urinário ponto de tempo zero minuto para outro tubo marrom de 1,5 mililitro.Coloque um cotonete ao redor do cateter do pequeno vaso e desconecte o cateter grande do cateter do pequeno vaso. Encha a seringa com a solução de fase experimental. Coloque-a na bomba de seringa e deixe a bomba de infusão funcionar para que o cateter grande seja preenchido com a solução de fase experimental.Reconecte os cateteres enquanto evita a embolia do ar e reabra o grampo. Inicie a bomba de seringa à taxa de fluxo de 0,008 mililitro por minuto. Continue executando a bomba de seringa por 60 minutos e colete a urina dentro do tubo urinário depois disso.Coloque o tubo de urina no gelo. Neste estudo, a fluorescência da urina de camundongos nativos mostra um pico de 395 nanômetros. FITC polisucrose 70 a uma concentração de 40 microgramas por mililitro na urina do rato exibe um máximo de fluorescência em 525 nanômetros.A urina do rato não perturba a medição da fluorescência da polisucrose FITC 70. Na admissão de 525 nanômetros, o aumento das concentrações de polisucrose FITC 70 mostra um aumento da intensidade da fluorescência. Este método também é capaz de detectar diferenças na permeabilidade glomerular.As colunas brancas representam polisucrose FITC 70 níveis antes do início da estimulação da angiotensina II na fase experimental. Após dosagens por 60 minutos, a permeabilidade glomerular aumentou em comparação com o grupo controle. angiotensina II lavar-se diminuiu a permeabilidade glomerular.Os níveis de polisucrose FITC diminuíram após 60 minutos adicionais de estimulação de angiotensina II ou 60 minutos de lavagem de angiotensina II. O aumento da permeabilidade glomerular devido à angiotensina II pode ser bloqueado por um bloqueador receptor de angiotensina II. A pressão arterial monitorada pelo método do manguito da cauda não apresentou diferenças significativas entre os grupos tratados de controle e angiotensina II.Ao tentar este procedimento é importante evitar a embolia do ar ao mudar as soluções de infusão.

highly-sensitive-measurement-glomerular-permeability-mice-with

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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Medição altamente sensível da permeabilidade glomerular em camundongos com isotiocianato de fluoresceina-polisacarose 70

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