Observação em tempo real da reação de troca de fita de DNA mediada por Rad51
13 de fevereiro de 2019
Fluorescência ressonância energética baseada em transferência em tempo real observação sistemas do DNA vertente reação de troca, mediada por Rad51 foram desenvolvidos. Usando os protocolos aqui apresentados, somos capazes de detectar a formação de intermediários de reação e sua conversão em produtos, também na análise da cinética enzimática da reação.
Este método pode ajudar a decifrar os passos na troca de fios de DNA e revela os papéis da molécula de diferentes proteínas envolvidas na combinação durante o reparo. Com esta técnica podemos monitorar a troca de fios de DNA em tempo real sem qualquer interrupção na reação e usar o teatro operacional para determinar a cinética de cada passo de reação. Com alguns pequenos ajustes, essa técnica pode ser aplicada para estudar as atividades de proteínas purificadas de recombinação derivadas de outras espécies, como mamíferos e plantas.
Demonstrando o procedimento será Kentaro Ito, um Post Doc do meu laboratório. Para começar, prepare o buffer de reação A de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, adicione 36-nanomole 16FA-oligonucleotídeo ao buffer para o ensaio de emparelhamento de DNA.
Incubar a mistura a 37 graus Celsius por cinco minutos. Adicione a proteína RAD-51 em uma concentração final de 1,5 micro mols à mistura e incuba-a a 37 graus celsius por cinco minutos. Adicione a proteína SWI5-SFR1 a uma concentração final de 0,15 micro mols à mistura, e incuba-a a 37 graus Celsius por mais cinco minutos.
Transfira 1,5 mililitros da mistura em uma cuvette de quartzo de 1,0 por 1,0 cm contendo um agitador magnético. Insira a cuvette em um espectrofluorômetro e prossiga para ajustar o controlador de temperatura e o agitador magnético. Regissei a alteração na emissão de fluorescência famácida em 525 nanômetros após excitação em 493 nanômetros em intervalos de um segundo por 100 segundos.
Finalmente, com uma seringa, injete ROX rotulado DNA de dupla cadeia em uma concentração final de 36 nano toupeiras no cuvette. Regissore a variação da emissão de fluorescência em intervalos de um segundo por 30 minutos. Para comparar o espectro de fluorescência entre os substratos e os produtos finais, insira cada cuvette contendo os 16 fa-oligonucleotídeos com ou sem RAD-51 em um espectrofluorômetro e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Em seguida, regise a emissão de fluorescência fam de 500 a 600 nanômetros após a excitação em 493 nanômetros. Para testar o efeito do RAD-51 no espectro da fluorescência, adicione RAD-51 em uma concentração final de 1,5 micro mols. E incubar a mistura a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Finalmente, registos o espectro de fluorescência de 500 a 600 nanômetros após excitação em 493 nanômetros. A eficiência máxima do FRET é obtida medindo a redução máxima da intensidade da fluorescência quando todo substrato de DNA de uma única faixa é convertido em DNA de dupla renda no ensaio de pareamento. Ou medindo o aumento máximo da intensidade quando todo substrato de DNA de dupla fita é convertido em DNA de um único fio no ensaio de deslocamento.
Em ambos os ensaios, a adição de proteína RAD-51 não afetou a emissão de fluorescência da FAM, nem sua eficiência saciante pelas rochas. Os efeitos das reações espontâneas entre DNAs substratos e o branqueamento fotográfico subsequente são pequenos. Como mostrado pelas mudanças insignificantes na emissão de FAM sem RAD-51, em comparação com as mudanças substanciais vistas com o RAD-51.
A adição do complexo SWI5-SFR1 estimula fortemente a atividade de pareamento do RAD-51. A reação de emparelhamento é simulada usando um modelo de três etapas, consistindo na formação do primeiro intermediário de três fios, transição para o segundo intermediário, e liberação do DNA de um único fio e formação do hetero duplex. Uma comparação do modelo de três etapas com um modelo de duas etapas indica que o modelo de três etapas é mais adequado para simular o emparelhamento de DNA, sem ou com o complexo SWI5-SFR1.
A constante de equilíbrio calculada de cada passo de reação, com ou sem SWI5-SFR1, mostra que o complexo SWI5-SFR1 não estimula a formação do primeiro intermediário de três fios, mas estimula fortemente a transição entre os dois intermediários de três fios, e a liberação do DNA SS. É essencial verificar se cada lote de proteína purificada está livre de contaminação nuclease e helicase.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para observação em tempo real de reações de troca de fita de DNA mediadas por Rad51 usando transferência de energia por ressonância de fluorescência. A técnica permite a detecção de intermediários da reação e análise da cinética enzimática sem interromper a reação.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Biologia Molecular
- Genética
Fundamentos
- A troca de fita de DNA é um processo crucial no reparo do DNA.
- Rad51 desempenha um papel significativo na recombinação homóloga.
- Entender a cinética desta reação pode fornecer insights sobre os mecanismos de reparo do DNA.
- Técnicas de monitoramento em tempo real melhoram o estudo desses processos bioquímicos complexos.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um sistema para observar a troca de fita de DNA em tempo real.
- Analisar os papéis de diferentes proteínas na reação.
- Determinar a cinética de cada etapa no processo de troca de fita de DNA.
Métodos Utilizados
- Preparação de buffer de reação e oligonucleotídeos para ensaios de emparelhamento de DNA.
- Incubação das proteínas RAD-51 e SWI5-SFR1 com substratos de DNA.
- Uso de um espectrofluorímetro para monitorar mudanças de fluorescência.
- Análise de intermediários e produtos da reação por meio de medições de emissão de fluorescência.
Principais Resultados
- A adição de SWI5-SFR1 estimula significativamente a atividade de emparelhamento de RAD-51.
- Um modelo de três etapas se ajusta melhor à simulação de emparelhamento de DNA em comparação com um modelo de duas etapas.
- O estudo fornece dados quantitativos sobre a cinética da troca de fita de DNA.
- As medições de fluorescência indicaram efeitos mínimos das reações espontâneas.
Conclusões
- O método desenvolvido permite uma análise cinética detalhada da troca de fita de DNA.
- SWI5-SFR1 aumenta a eficiência de RAD-51 no emparelhamento de DNA.
- Esta técnica pode ser adaptada para estudar proteínas de recombinação de várias espécies.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Real-time observation of DNA strand exchange mediated by Rad51 provides a quantitative framework for evaluating recombination protein function, supporting target validation in DNA repair pathways. The FRET-based assay enables kinetic de-risking of mechanistic hypotheses by resolving transient intermediates, informing lead identification for modulators of homologous recombination. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking protein activity to functional DNA repair outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Rad51-mediated strand exchange to validate therapeutic targets in DNA repair pathways.
- Operational Value: Resolves formation and maturation of three-strand DNA intermediates, clarifying mechanism of action for accessory proteins like Swi5-Sfr1.
- Predictive Value: Supports three-step kinetic modeling that improves confidence in target engagement and pathway modulation predictions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts to measure strand exchange kinetics under varying protein conditions.
- Operational Value: Establishes a homogeneous, solution-based assay format compatible with spectrofluorometric detection for compound screening.
- Assay Readiness: Enables real-time monitoring without reaction disruption, supporting dose-response and time-course analyses for hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Facilitates cross-species comparison of recombination protein activity, supporting extrapolation from model systems to human homologs.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes effects of accessory proteins on specific reaction steps, reducing ambiguity in mechanism-based biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Provides a standardized method to assess functional conservation of Rad51 regulators across species, informing target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where kinetic profiling of DNA repair proteins informs go/no-go decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how Swi5-Sfr1 stimulates intermediate maturation and ssDNA release in Rad51-mediated strand exchange.
- Screening: Delivers reproducible, real-time FRET signals that enable comparison of inhibitor or activator effects on reaction kinetics.
- Analytics: Provides step-resolved rate constants and equilibrium constants that allow quantitative comparison of protein variants or conditions.
- Translational Research: Enables assessment of evolutionary conservation by applying the assay to recombination proteins from mammals and plants.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing recombinase activity, reducing redundant assay development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving transient intermediates and defining rate-limiting steps.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible kinetic data through real-time fluorescence monitoring in a cuvette-based format.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying how accessory proteins modulate specific steps of strand exchange, reducing mechanistic uncertainty.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA repair targets based on quantitative kinetic profiles and evolutionary conservation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, fluorescence spectroscopy, and kinetic data analysis.
- Dependent on access to a temperature-controlled spectrofluorometer with magnetic stirring and syringe injection capability.
- Necessitates standardized protein preparation to exclude nuclease and helicase contaminants that could confound reaction interpretation.
- Requires optimization of oligonucleotide labeling and concentration for each target species to ensure detectable FRET signals.
- Limited to in vitro systems; does not capture chromatin or nuclear context effects present in vivo.
