Name: Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Aprenda a detectar locais de ubiquitinação proteica por enriquecimento de peptídeos diGly e espectrometria de massa. Este método robusto oferece maior cobertura do ubiquitinoma para pesquisas em regulação celular.

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Este trabalho faz parte do projeto "Proteínas no Trabalho", um programa do Centro de Proteômica dos Países Baixos financiado pela Organização Holandesa para a Pesquisa Científica (NWO) como parte do Roteiro Nacional de Instalações de Pesquisa em Larga Escala (projeto número 184.032.201 ).

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (EDC) da Erasmus MC.
1. Preparação da amostra
<ol><li>Células cultivadas<ol>
<li>Selecione uma linha de interesse celular (por exemplo, HeLa ou osteossarcoma [U2OS]) e crie as células no Minimal Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, complementada com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor (FBS) e 100 unidades/mL penicilina/estreptomicina.</li>
		<li>Para experimentos de proteômica quantitativa, as células de cultura no DMEM não possuem arginina e lysina. O meio deve ser suplementado com soro bovino fetal dialisado de 10% (FBS), 100 unidades/mL penicilina/estreptomicina e alanina-glutamina. Faça dois tipos de mídia adicionando lysina convencional e arginina ('Light' Medium) ou lysine-8(13C6; 15N2) e arginina-10(13C6; 15N4) ('Heavy' Medium), respectivamente.</li>
		<li>Lotes de culturas de células em Meio Leve (ou seja, sem rótulo) e Meio Pesado (ou seja, rotulado, SILAC) para pelo menos seis duplicações antes da expansão e tratamento para garantir que todas as proteínas da cultura Heavy Medium sejam rotuladas com isótopos estáveis pesados contendo isótopos estáveis pesados contendo isótopos estáveis pesados contendo isótopos estáveis pesados contendo isótopos estáveis pesados contendo Aminoácidos.</li>
		<li>Trate as células por 8 h com 10 μM do inibidor proteasome bortezomib ou um volume equivalente de DMSO como um tratamento simulado. Lave as células com PBS, dissocie-as usando 1% de tripsina/EDTA e pelota as células.</li>
		<li>Lyse a pelota celular de uma placa de cultura de 150 cm2 por condição testada em 2 mL de gelo frio 50 mM Tris-HCl (pH = 8,2) com 0,5% de desoxicolato de sódio (DOC). Ferva o lysate a 95 °C por 5 min e sônica por 10 min (ajuste "H" para o sônico listado na Tabela de Materiais) a 4 °C. Não recomendamos o uso de inibidores de deubiquitinase como n-etilmaleimida (NEM), pois isso pode introduzir modificações proteicas indesejadas que podem complicar a identificação de peptídeos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tecido cerebral in vivo<ol>
<li>Ao utilizar tecido in vivo, lite o tecido em um tampão frio de gelo contendo 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 12 mM de sódio DOC e 12 mM de sódio N-lauroylsarcosinato17. Sonice o lysate por 10 min (ajuste "H" para o sônico listado na Tabela de Materiais) a 4 °C e ferva o lysato por 5 min a 95 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificar a quantidade total de proteína usando um kit de ensaio de proteína BCA de absorção colorimétrica. A quantidade total de proteína deve ser de pelo menos vários miligramas para uma imunoprecipitação de peptídeos diGly bem sucedida (IP). Para os experimentos SILAC, misture as proteínas leves e pesadas rotuladas em uma razão 1:1 com base na quantidade total de proteínas.</li>
	<li>Reduza todas as proteínas usando 5 mM 1,4-dithiothreitol por 30 min a 50 °C e, posteriormente, alquila-las com iodoacetamide de 10 mM por 15 min no escuro. Realizar digestão proteica com Lys-C (proporção enzima-substrato de 1:200) por 4 h seguido de digestão noturna com tripsina (razão enzima-substrato de 1:50) a 30 °C ou à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Adicione ácido trifluoroacético (TFA) à amostra digerida a uma concentração final de 0,5% e centrifugue a amostra a 10.000 x g por 10 min, a fim de precipitar e remover todo o detergente. Coletar o sobrenadante contendo os peptídeos para fracionamento subseqüente.</li>
</ol>2. Fracionamento de peptídeos offline
<ol><li>Use cromatografia de fase reversa de pH alto (RP) c18 com material de fase estacionária polimérico (300 Å, 50 μM; ver Tabela de Materiais) carregado em um cartucho de coluna vazio para fracionar os peptídeos tripés. O tamanho do leito de fase estacionária deve ser ajustado à quantidade de proteína digerível a ser fracionado. Prepare um cartucho vazio de coluna de 6 mL (ver Tabela de Materiais) preenchido com 0,5 g de material de fase estacionária para ~10 mg de digestão de proteínas. A relação proteína digesta a fase estacionária deve ser de aproximadamente 1:50 (c/w).</li>
	<li>Carregue os peptídeos na coluna preparada e lave a coluna com aproximadamente 10 volumes de coluna de 0,1% TFA, seguido por aproximadamente 10 volumes de coluna súdo de H2O.</li>
	<li>Eluir os peptídeos em três frações com volumes de 10 colunas de solução de formato de amônio de 10 mM (pH = 10) com 7%, 13,5% e 50% de acetonitrilo (AcN), respectivamente. Liofilo todas as frações para a completude.</li>
	<li>Use anticorpos remanescentes de ubiquitina (K-ε-GG) conjugados à proteína A agarose beads para o imunoenriquecimento de peptídeos diGly. Como a quantidade exata de anticorpos por lote de contas é de propriedade e não divulgada pelo fabricante, recomenda-se usar a mesma definição para um lote de contas como o fabricante faz para evitar confusão. Lave um lote dessas contas 2x com PBS e divida o chorume de contas em seis frações iguais. Consulte a Figura 1 para um esquema experimental detalhado.</li>
	<li>Dissolver as três frações de peptídeos coletadas na etapa 2.3 em 1,4 mL de um tampão composto por 50 mM MOPS, fosfato de sódio de 10 mM e 50 mM NaCl (pH = 7,2), e girar os detritos.</li>
	<li>Adicione os sobrenatantes das frações às contas de anticorpos diGly e incubar por 2 h a 4 °C em uma unidade rotadora. Gire as contas e transfira o sobrenadante para um lote fresco de contas de anticorpos e incuba novamente por 2 h a 4 °C.</li>
	<li>Armazene os sobrenatantes para análise subsequente de proteome global (GP).</li>
	<li>Transfira as contas de cada fração para uma ponta de pipeta de 200 μL equipada com um plugue de filtro GF/F para reter as contas. Coloque a ponta da pipeta com as contas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL equipado com um adaptador de ponta centrífuga. Lave as contas 3x com 200 μL de tampão IAP gelado e, posteriormente, 3x com 200 μL de gelo-frio milliQ H2O. Gire a coluna a 200 x g por 2 min antes de cada passo de lavagem, mas tome cuidado para não deixar a coluna secar. Eluir os peptídeos usando 2 ciclos de 50 μL de 0,15% TFA.</li>
	<li>Dessalificar os peptídeos usando uma ponta de estágio C18 (essencialmente uma ponta de pipeta de 200 μL com dois discos C18) e secá-los para completar usando centrifugação de vácuo.</li>
</ol>3. Nanofluxo LC-MS/MS
<ol><li>Realize experimentos LC-MS/MS em um espectrômetro de massa sensível acoplado a um sistema LC de nanofluxo.</li>
	<li>Use uma coluna de fase invertida de 50 cm embalada internamente com um diâmetro interno de 75 μm embalado com resina CSH130 (3,5 μm, 130 Å) e eluie os peptídeos com um gradiente de 2-28% (AcN, 0,1% FA) sobre 120 min a 300 nL/min. Alternativamente, use colunas de LC disponíveis comercialmente com propriedades similares. Mantenha a coluna a 50 °C usando um forno de coluna, por exemplo (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Faça a análise de espectrometria de massa.<ol>
<li>O espectrômetro de massa deve ser operado no modo de aquisição dependente de dados (DDA). Os espectros de massa MS1 devem ser coletados em alta resolução (por exemplo, 120.000), com uma configuração de meta de controle de ganho automatizado (AGC) de 4E5 e um tempo máximo de injeção de 50 ms no caso de um espectrômetro de massa Orbitrap.</li>
		<li>Realize a análise de espectrometria de massa no modo "Maior Intensidade Primeiro" primeiro. Dessa forma, o íon mais intenso é selecionado primeiro para fragmentação, depois o segundo mais alto, e assim por diante, usando o método de velocidade máxima com um tempo total de ciclo de 3 s. Posteriormente, realize uma segunda rodada de análise DDA MS no modo "Menor Intensidade Primeiro", de modo que o íon menos intenso seja selecionado primeiro, depois o segundo mais baixo, e assim por diante. Essa estratégia garante a detecção ideal de peptídeos de abundancy muito baixos.</li>
		<li>Filtrar os íons precursores de acordo com seus estados de carga (2-7 cargas) e atribuição de pico monoisotópico. Exclua os precursores previamente interrogados dinamicamente para 60 s. Isole os precursores do peptídeo com um filtro de massa quadrúpole definido para uma largura de 1,6 Th.</li>
		<li>Coletar espectros MS2 na armadilha de íons em um AGC de 7E3 com um tempo máximo de injeção de 50 ms e energia de colisão HCD de 30%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análise de dados
<ol><li>Analise os arquivos brutos de espectrometria de massa usando um mecanismo de pesquisa apropriado, como o conjunto de software MaxQuant livremente disponível com base no mecanismo de busca de Andrômeda18,19. No MaxQuant, selecione as configurações padrão com algumas adaptações indicadas abaixo. Defina a especificidade da enzima para tripsina, com o número máximo de decotes perdidos elevado para três. Coloque a lysina com um remanescente diGly (+114.04 Da), oxidação de metionina e acetilação n-terminal como modificações variáveis, e definir carbamidometilação de cisteína como uma modificação fixa.</li>
	<li>Realizar pesquisas de banco de dados contra um arquivo FASTA contendo seqüências proteicas baixadas, por exemplo, do repositório Uniprot<a href="https://www.uniprot.org/downloads" target="_blank">(https://www.uniprot.org/downloads)</a>combinado com uma isca e um banco de dados de contaminantes comum padrão que é fornecido automaticamente pelo MaxQuant. Defina a taxa de detecção falsa (FDR) para 1% e defina a pontuação mínima para peptídeos modificados (diGly) para 40 (valor padrão). Exclua peptídeos identificados com um resíduo de lysina diGly modificado do terminal C de análises posteriores.</li>
	<li>Para a análise quantitativa dos arquivos de experimento SILAC, defina a multiplicidade como "2" e repita a etapa 4.2.</li>
	<li>Realize todas as análises a jusante (por exemplo, estatísticas, análises de ontologia genética) com o módulo Perseus20 do pacote de software MaxQuant.</li>
</ol>

<ol><li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li>
<li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%3A+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li>
<li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li>
<li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li>
<li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li>
<li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li>
<li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li>
<li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proteome-wide%2C+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284(2011).</li>
<li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li>
<li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li>
<li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
<li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li>
<li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li>
<li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+standard+absolute+quantification+%28PSAQ%29+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li>
<li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflito de interesses.

O protocolo descrito aqui foi aplicado a amostras de diversas fontes biológicas, como células cultivadas e tecido in vivo. Em todos os casos identificamos milhares de peptídeos diGly, desde que a quantidade total de entrada de proteínas fosse de pelo menos 1 mg. O enriquecimento utilizando anticorpos específicos é altamente eficiente, uma vez que apenas no máximo 100-150 peptídeos diGly muito baixos abundantes foram identificados a partir de lysatos celulares inteiros se não foram aplicados procedimentos de enriqueciment...

A conjugação de ubiquitina às proteínas marca-as para a degradação pelo proteasome e é um processo crucial na proteostasis. O grupo carboxyl c-terminal de ubiquitina forma uma ligação isopeptídeo com o grupo lysine ε-amino da proteína alvo1,2. Além disso, a ubiquitina pode ser anexada a outros módulos de ubiquitina, resultando na formação de estruturas homogêneas (ou seja, K48 ou K11) ou ramificadas (i.e., heterogêneas ou mistas) estruturas de poliubiquitina1,3. A função mais conhecida da ubiquitina é seu papel na degradação proteasômica, mediada pela poliubiquitina ligada ao K48. No entanto, tornou-se claro que tanto a mono- como a poliubiquitina também desempenham papéis em muitos processos que são independentes da degradação pelo proteasome. Por exemplo, as cadeias ligadas ao K63 têm papéis não degradativos no tráfico intracelular, degradação lisossômica, sinalização de quinase e resposta de dano de DNA4,5. Os outros seis tipos de ligação são menos abundantes e seus papéis ainda são em grande parte enigmáticos, embora as primeiras indicações sobre suas funções na célula estejam surgindo, em grande parte devido ao desenvolvimento de novas ferramentas para permitir a detecção específica de ligação6,7.
A espectrometria de massa tornou-se uma ferramenta indispensável para análises de proteome e hoje em dia milhares de proteínas diferentes de praticamente qualquer fonte biológica podem ser identificadas em um único experimento. Uma camada adicional de complexidade é apresentada por modificações pós-traduções (PTMs) de proteínas (por exemplo, fosforilação, metilação, acetilação e ubiquitinação) que podem modular a atividade proteica. A identificação em larga escala de proteínas portadoras de PTM também foi possível graças aos desenvolvimentos no campo de espectrometria de massa. A estequiometria relativamente baixa de peptídeos portadores de PTMs em comparação com suas contrapartes não modificadas apresenta um desafio técnico e passos de enriquecimento bioquímico são geralmente necessários antes da análise de espectrometria de massa. Ao longo das últimas duas décadas, vários métodos específicos de enriquecimento foram desenvolvidos para a análise de PTMs.
Devido aos papéis multifacetados da ubiquitina proteica na célula, há uma grande demanda para o desenvolvimento de métodos analíticos para a detecção de locais de ubiquitina em proteínas8. A aplicação de métodos espectrométricos de massa levou a uma explosão do número de locais de ubiquitina identificados em proteínas de mosca-das-frutas, camundongos, humanos e leveduras99,10,,11,,12,,13,,14. Um passo importante foi apresentado pelo desenvolvimento de estratégias de enriquecimento baseadas em imunoprecipitação no nível do peptídeo usando anticorpos direcionados contra o motivo remanescente k-ε-GG (também referido como "diglycine" ou "diGly"). Estes peptídeos diGly são produzidos após a digestão de proteínas ubiquitinas usando tripsina como protease15,16.
Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho otimizado para enriquecer para peptídeos diGly usando imunopurificação e detecção subseqüente por espectrometria de massa orbitrap. Usando uma combinação de várias modificações dos fluxos de trabalho existentes, especialmente nas fases de preparação da amostra e espectrometria de massa, agora podemos identificar rotineiramente mais de 23.000 peptídeos diGly de uma única amostra de células HeLa tratadas com um proteasome inibidor e ~10.000 de células HeLa não tratadas. Aplicamos este protocolo a lysates de rotulagem de isótopos não rotulados e estáveis com aminoácidos na cultura celular (SILAC) rotulados células HeLa, bem como a amostras endógenas, como tecido cerebral.
Este fluxo de trabalho apresenta uma valiosa adição ao repertório de ferramentas para a análise de locais de ubiquitina, a fim de descobrir a ubiquitinome profunda. O protocolo a seguir descreve todas as etapas do fluxo de trabalho em detalhes.

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditioeritritol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>3M Empore C18 Octadecyl disks</td><td>Supelco</td><td>66883-U</td><td>produto descontinuado na Supelco; CDS Analytical é o novo fabricante (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td></tr><tr><td>Formato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Bortezomib</td><td>UBPbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSH130 resina, 3.5 &mu; m, 130 &</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nanoLC 1200</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GF/F plugue de filtro</td><td>Whatman</td><td>1825-021</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lisina, Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lisina-8 (13C6; 15N2), Arginina-10 (13C6; 15N4)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysyl Endopeptidase(LysC)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>129-02541</td><td></td></tr><tr><td>NanoLC forno</td><td>MPI design, MS Wil GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio N-Lauroilsarcosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5125</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos espectrômetro de massa</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce</td><td>ThermoFisher / Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PLRP-S (300 &Aring;, 50 &micro; m) partículas poliméricas de fase reversa</td><td>Agilent Technologies</td><td>PL1412-2K01</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-&epsilon;-GG) Kit</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>5562</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartucho</td><td>Waters</td><td>WAT036790</td><td>Remova o material tC18 do cartucho antes de encher o cartucho com PLRP-S</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, TPCK tratado</td><td>ThermoFisher</td><td>20233</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

A modificação pós-tralácida das proteínas pela pequena ubiquitina proteica está envolvida em muitos eventos celulares. Após a digestão tripé de proteínas ubiquitinadas, peptídeos com um remanescente diglíino conjugado ao grupo epsilon amino de lysina ('K-ε-diglycine' ou simplesmente 'diGly') podem ser usados para rastrear o local original de modificação. A imunopurificação eficiente dos peptídeos diGly combinados com a detecção sensível por espectrometria de massa resultou em um enorme aumento no número de locais de ubiquitinação identificados até o momento. Fizemos várias melhorias neste fluxo de trabalho, incluindo o fracionadode em fase inversa de pH off-line de peptídeos antes do procedimento de enriquecimento, e a inclusão de configurações mais avançadas de fragmentação de peptídeos no multipólo de roteamento de íons. Além disso, a limpeza mais eficiente da amostra usando um plugue baseado em filtro para reter as contas de anticorpos resulta em uma maior especificidade para peptídeos diGly. Essas melhorias resultam na detecção rotineira de mais de 23.000 peptídeos diGly de células cancerígenas do colo uterino humano (HeLa) sobre a inibição proteasome na célula. Mostramos a eficácia dessa estratégia para análise aprofundada dos perfis ubiquitino dos vários tipos de células diferentes e de amostras in vivo, como tecido cerebral. Este estudo apresenta uma adição original à caixa de ferramentas para análise de ubiquitina proteica para descobrir a ubiquitinome celular profunda.

As proteínas ubiquitadas deixam um remanescente de diglycine 114,04 no resíduo de lysina alvo quando as proteínas são digeridas com tripsina. A diferença de massa causada por este motivo foi usada para reconhecer inequivocamente o local da ubiquitina em um experimento de espectrometria de massa. A estratégia que descrevemos aqui é um método de última geração para o enriquecimento e posterior identificação de peptídeos diGly por nanofluxo LC-MS/MS(Figura 1<str...

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

A modificação pós-translacional de proteínas pela pequena ubiquitina proteica está envolvida em muitos eventos na célula. Este estudo apresenta uma adição original à caixa de ferramentas para análise de ubiquitina de proteínas. Usamos técnicas de enriquecimento e espectrometria de massa para descobrir a ubiquitinoma profunda.Fizemos várias melhorias na análise de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas. Estes incluem fracionamento de peptídeos brutos antes do enriquecimento, e a aplicação de configurações de fragmentação de peptídeos mais avançados no Orbitrap. Ao todo, isso resulta em uma cobertura maior do ubiquitinome.Vários aspectos do protocolo são difíceis de descrever em palavras. A visualização de alguns dos principais passos é essencial para poder repetir essas análises por diferentes operadores em um laboratório diferente. O procedimento será demonstrado por Karel Bezstarosti, que é técnico sênior do meu laboratório.Comece preparando células cultivadas ou tecido cerebral do rato para o experimento. Se trabalhar com células, lise a pelota celular de uma placa de cultura quadrada de 150 centímetros em dois mililitros de gelo frio, 50 mililitros Tris HCL com desoxicolato de sódio de 0,5%. Ferva o lise a 95 graus Celsius por cinco minutos.Em seguida, sonicate-lo a quatro graus Celsius por 10 minutos. Se usar tecido cerebral de camundongo in vivo, lise-o em um tampão gelado frio contendo 100 mililitros Tris HCL, 12 milimilas de desoxicosolato de sódio e 12 milimilas de sódio N-lauroylsarcosinate. Sonicar o lysate por 10 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, ferva por cinco minutos a 95 graus Celsius. Em seguida, quantita a quantidade total de proteína usando um kit de ensaio de proteína BCA de absorção calorimétrica, que deve ser pelo menos vários miligramas para imunoprecipitação de peptídeo diGly bem sucedida. Para experimentos SILAC, misture as proteínas leves e pesadas rotuladas em uma razão de um para um com base na quantidade total de proteínas.Reduza todas as proteínas com 5 mililitros DTT por 30 minutos a 50 graus Celsius. E, posteriormente, alquilá-los com iodoacetamida milimolalar por 15 minutos no escuro. Em seguida, realize a digestão proteica com Lys-C por quatro horas.E digestão de trippsina durante a noite a 30 graus Celsius, ou à temperatura ambiente. No dia seguinte, divida a amostra em dois tubos Eppendorf mililitros e adicione TFA à amostra digerida a uma concentração final de 0,5% Centrifuge-a a 10.000 vezes G por 10 minutos para precipitar e remover todo o detergente. Colete o peptídeo contendo supernascida para fracionamento subsequente.Use cromatografia c18 de alta fase reversa de pH para fracionar os peptídeos fáticos. Prepare um cartucho vazio de seis mililitros cheio de 0,5 gramas de material de fase estacionária para cerca de 10 miligramas de digestão proteica. Coloque os peptídeos na coluna preparada e lave-o com aproximadamente 10 volumes de 0,1% TFA, seguido por 10 volumes de água.Elute os peptídeos em três frações usando 10 volumes de coluna de formato de amônio mililamlar com sete, 13,5 e 50% de acetonitrilo, respectivamente. Então, litolyse todas as frações. Um lote de anticorpos remanescentes de ubiquitina conjugados à proteína A agarose bead slurry é dividido em seis frações iguais.Dissolva as três frações de peptídeos de acordo com as instruções do manuscrito e gire os detritos. Adicione os supernaciantes das três frações ao chorume de contas, mantendo as outras três frações no gelo. E incuba-los por duas horas a quatro graus Celsius em uma unidade rotadora.Então, gire as contas. Transfira o supernatante para um lote fresco de contas. E repita a incubação com as três frações restantes de chorume.Armazene os supernacantes para análises proteome globais subsequentes. E transfira as contas para 200 dicas de pipeta microliter equipadas com um plugue de filtro GFF. Coloque as pontas em tubos de 1,5 mililitro equipados com um adaptador de ponta centrífuga e lave as contas três vezes com 200 microliters de tampão IAP gelado, seguido por três lavagens com água gelada purificada.Gire as colunas a 200 vezes G por dois minutos entre as lavagens, certificando-se de não deixar a coluna secar. Após a lavagem final, elute os peptídeos com dois ciclos a 50 microliters de 0,15%TFA. Desalque os peptídeos com uma ponta de estágio C18 e seque-os com centrifugação de vácuo.Realize experimentos LC-MS/MS em um espectrômetro de massa sensível acoplado a um sistema LC de nanofluxo. A coluna é montada de acordo com as instruções do manuscrito e mantida a 50 graus Celsius. Opere o espectrômetro de massa no modo de aquisição dependente de dados.Colete o espectro de massa MS1 em alta resolução com um ajuste de alvo controlado de ganho automatizado de 4E5 e um tempo máximo de injeção de 50 milissegundos. Realize a análise de espectrometria de massa no primeiro modo mais intenso, usando o método de velocidade máxima com um tempo total de ciclo de três segundos. Em seguida, realize uma segunda rodada de análise DDA MS no primeiro modo menos intenso, o que garantirá a detecção ideal de peptídeos de baixa abundância.Filtre os íons precursores de acordo com seus estados de carga e atribuição de pico monoisotópico. E exclua precursores previamente interrogados dinamicamente por 60 segundos. Isole precursores de peptídeos com um filtro de massa quadrupole definido para uma largura de 1,6 Thomson.Em seguida, colete espectros MS2 na armadilha de íons em um controle de ganho automatizado de 7E3 com um tempo máximo de injeção de 50 milissegundos e energia de colisão HCD de 30% Analise os arquivos brutos de espectrometria de massa usando um mecanismo de busca apropriado, como o pacote de software MaxQuant disponível livremente baseado no mecanismo de busca de Andrômeda. Abra o MaxQuant e selecione os arquivos de dados brutos apropriados. Defina o número de processadores e clique na guia parâmetros específicos do grupo.Selecione a digestão e deixe três decotes perdidos. Em seguida, selecione modificações e adicione diGly às modificações variáveis. Selecione a guia de parâmetros globais e adicione o banco de dados de sequência de proteínas correto.Deixe as outras configurações como padrão e pressione comece a realizar a pesquisa do banco de dados. Para análise quantitativa dos arquivos de experimento silac, defina a multiplicidade para dois e selecione os rótulos pesados de aminoácidos. Quando a pesquisa estiver concluída, importe os arquivos de texto para Perseus.Este protocolo foi utilizado para identificar sítios de ubiquização em proteínas de células cultivadas e material in vivo, detectando peptídeos diGly com nanofluto LC-MS/MS. Várias melhorias foram feitas no protocolo existente, o que resultou em maior número de peptídeos diGly detectados. Foi realizado um fracionamento bruto em três frações antes da imunoprecipitação.Uma das frações contém o próprio peptídeo de diGly típtico modificado K48 da ubiquitina, que é caracterizado por um grande pico no cromatograma LC. Além disso, o regime de fragmentação de peptídeos foi ajustado para combinar as corridas de LC-MS com os mais altos primeiros e menores regimes de fragmentação do primeiro e menor regime de fragmentação no procedimento de análise de dados, que produziu mais de 4.000 peptídeos únicos adicionais. Mais de 23.000 peptídeos diGly podem ser rotineiramente identificados a partir de uma única amostra de células HeLa tratadas com um inibidor proteasome.De todos os peptídeos diGly identificados ao longo de três telas de replicação biológica, mais de 9.000 estavam presentes em todos os três, enquanto mais de 17.000 estavam presentes em pelo menos duas das três réplicas. O número de identificações de peptídeos é altamente contingente na quantidade de material de entrada. Um número aproximado de peptídeos diGly identificados pode ser esperado dependendo do material inicial, mas esses números são apenas estimativas e também dependerão do tipo de espectrômetro de massa utilizado.Ao realizar este protocolo, a experiência prévia com métodos de proteômica baseada em espectrometria de massa e manuseio e análise de quantidades de amostras minuciosas certamente seria vantajosa. O software MaxQuant pode ser substituído por qualquer outro algoritmo de pesquisa de banco de dados. Também pode ser usado um tipo diferente de espectrômetro de massa.Os resultados em termos de identificação de peptídeos podem ser ligeiramente diferentes, mas isso é típico para qualquer ensaio de proteômica baseada em espectrometria de massa. A ubiquitina é importante no progresso da degradação da proteína mediada, mas também desempenha um papel em muitos outros processos na célula. O conhecimento mais profundo da ubiquitina como modificação pós-translacional é crucial para entender melhor sua função.

detection-protein-ubiquitination-sites-peptide-enrichment-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Ubiquitinação é uma modificação fundamental posttranslational realizado por um conjunto de três enzimas. Mutações dos genes envolvidos nesta modificação estão associadas com diferentes tipos de doenças humanas. Aqui, descrevemos os protocolos para detectar ubiquitinação de proteínas em células...

Detecção de Ubiquitinação Protein

Padrões de Isótopos estáveis ​​e Captura de Anticorpos Anti-Peptide (SISCAPA) casais enriquecimento afinidade de peptídeos com isótopos estáveis ​​de diluição espectrometria de massa (MRM-MS) para fornecer a medição quantitativa de peptídeos como substitutos para suas respectivas proteínas. Aqui nós descrevemos o protocolo usando partículas magnéticas em um formato parcialmente automatizados.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

Neste vídeo, demonstramos a imunoprecipitação baseada em anticorpos de fosfopeptídeos de uma mistura de peptídeos. Os fosfopeptídeos enriquecidos são concentrados a vácuo e armazenados para análise a jusante.

Enriquecimento de fosfopeptídeos: uma técnica de imunoprecipitação baseada em anticorpos para separar peptídeos fosforilados específicos de misturas complexas de peptídeos

Este vídeo descreve um método para extrair e purificar peptídeos ubiquitinilados contendo peptídeos de diglicina remanescentes de uma mistura complexa de peptídeos. O método apresentado pode ajudar na identificação de locais de ubiquitinação originais na proteína.

Extração baseada em imunoafinidade de peptídeos ubiquitinilados: uma técnica para extrair seletivamente peptídeos marcados com ubiquitina de frações peptídicas purificadas

Este protocolo descreve um procedimento para extrair e enriquecer o phosphopeptides de linhas de células de câncer de próstata ou tecidos para uma análise da phosphoproteome através de massa baseado em espectrometria proteômica.

Enriquecimento de Fosfopeptida acoplado com espectrometria de massa livre de rótulo quantitativa para investigar o Phosphoproteome no câncer de próstata

Este protocolo visa estabelecer proteomas específicos de ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls), a fim de identificar alterações desse tipo de modificações pós-translacional (PTMs), associadas a uma condição específica, como tratamento ou fenótipo.

Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

Este método descreve a avaliação das mudanças globais na topologia da cadeia de ubiquitina. A avaliação é realizada pela aplicação de uma abordagem de proteômica direcionada baseada em espectrometria de massa.

Análise da cadeia de Ubiquitin por monitoramento de reação paralela

A ubiquização CENP-A é um importante requisito para a deposição do CENP-A no centromere, herdada por dimerização entre divisão celular e indispensável à viabilidade celular. Aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização da proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) marcada pela EYFP.

Análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do CENP-A marcado pelo EYFP (EYFP-CENP-A)

Fornecemos um protocolo detalhado para um ensaio de ubiquização de um substrato específico e uma ubiquitina-ligase E3 em células mamíferas. As linhas celulares HEK293T foram utilizadas para superexpressão de proteínas, o substrato poliubiquizado foi purificado a partir de lisestês celulares por imunoprecipitação, e resolvido em SDS-PAGE. A imunoblotação foi usada para visualizar esta modificação pós-translacional.

Avaliação da Ubiquização substrato por E3 Ubiquitin-ligase em Lysates de Células Mamárias

O protocolo descreve um método passo-a-passo para purificar proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos usando a proteína supressora de tumor p53 como exemplo. As proteínas p53 ubiquitinadas foram purificadas a partir de células sob rigorosas condições de não desnaturação e desnaturação.

Purificação de proteínas p53 ubiquitinadas de células de mamíferos

A ubiquitinação é um regulador crítico das funções intracelulares das proteínas. Aqui, descrevemos dois métodos de lise celular para detectar os níveis de ubiquitinação de proteínas do substrato em células de mamíferos e comparamos sua eficácia na análise dos níveis de ubiquitinação. A superexpressão proteica em células HEK293T foi induzida por transfecção transitória, e proteínas ubiquitinadas foram detectadas por análise western blot.

Estratégias comparativas para detecção de ubiquitinação em lisados celulares de mamíferos usando SMAD2/SMURF2 como modelo

Aprenda a detectar locais de ubiquitinação proteica por enriquecimento de peptídeos diGly e espectrometria de massa. Este método robusto oferece maior cobertura do ubiquitinoma para pesquisas em regulação celular.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

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