Melhorando a extrusão de alta viscosidade de microcristais de tempo-resolvido Serial Femtosecond cristalografia em Lasers de raio-x

Este protocolo foi projetado para garantir que os problemas frequentemente encontrados durante experimentos cristalográficos em série resolvidos no tempo não comprometam a qualidade dos dados. Uma grande vantagem deste método é sua adaptabilidade aos sistemas de cristal individuais. O teste de extrusão da câmera de alta velocidade também nos permite medir diretamente a estabilidade da extrusão.

Primeiro, carregue 50 microliters de monooleína cristalina baseada lCP em uma seringa de 100 microliteres cerca de 30 minutos antes da injeção. Para injeção em um ambiente de vácuo, carregue cinco microliters de MAG 7.9 e cinco microliters de parafina líquida na parte de trás de uma segunda seringa. Segurando a seringa verticalmente, expulse as bolhas de ar da seringa.

Conecte a seringa com MAG 7.9 e a parafina a um acoesteador padrão de seringa. E purgar o ar do acoelhador pressionando suavemente o êmbolo até que um pequeno volume da mistura seja visível na ponta da agulha do acoelhista. Conecte a seringa amostra à seringa que leva o carro para não introduzir ar na amostra.

Misture o lipídio e a parafina passando a amostra através do acoalador várias vezes. Em seguida, carregue 20 microliters de LCP pré-xado em outra seringa de 100 microliteres. Remova a seringa vazia do acoedador e conecte o LCP pré-xizado ao cristal contendo seringa usando um acoedador de seringa padrão.

Então, passe a amostra pelo acoalador 100 vezes. Para trazer a amostra para a fase cúbica, adicione três microliters de monooleína e misture 50 vezes. Repita este procedimento apenas até que uma fase transparente tenha se formado para evitar um excesso de monooleína.

Como um teste preliminar para rigidez e extrudabilidade da amostra, desprende a seringa vazia do acoalador de seringa, e segurando a seringa verticalmente, esprema uma pequena quantidade de amostrador através do acoalador. Se a amostra extrudada formar um cilindro vertical, então a amostra está pronta para testes de extrusão. Ajuste o volume total da amostra para 100 microliters adicionando LCP mais pré-misturada.

Conecte a seringa de amostra e duas seringas vazias ao acoestrador de seringa de três vias. Misture pelo menos 50 vezes passando metade da amostra para a segunda seringa e, em seguida, pressionando ambas as metades da amostra para a terceira seringa simultaneamente. Coloque a seringa contendo a amostra mista sob um microscópio estéreo para verificar uma distribuição homogênea de cristais.

Purigue uma bomba HPLC e todas as linhas de água para garantir que as taxas de fluxo sejam precisas. Em seguida, purgar o estágio hidráulico do injetor. Em seguida, ligue e conecte a câmera ao software fornecido.

Com um vídeo ao vivo rodando para feedback visual, posicione a ponta do bocal no centro do quadro e coloque-a em foco com o estágio de três eixos. Defina a taxa de quadros na câmera para 1.000 quadros por segundo. Em seguida, defina a resolução para 512 por 512 pixels.

Com o tempo de exposição agora definido pela taxa de quadros, ajuste o nível de iluminação até que o bocal esteja visível. Reposicione a ponta do bocal para que se centralize para a esquerda para a direita e esteja localizada no terço superior do quadro. Configure a câmera no modo lapso de tempo.

Defina o intervalo para 30 segundos e as repetições para 40 vezes. Ajuste o modo de gatilho como aleatório. E digite o número de quadros para gravar para 1.000.

Agora, carregue o reservatório com 20 microliters da amostra de teste e anexe o bocal capilar. Conecte o reservatório preenchido ao injetor. Em seguida, conecte a linha de gás à porta no bocal e inicie o fluxo de gás.

Depois disso, inicie simultaneamente a bomba e a gravação da câmera. Monitore a extrusão até que a pressão da bomba aumente bruscamente perto do tempo final esperado. Em seguida, pare de gravar, desligue a bomba e desligue a pressão do sistema abrindo a válvula de alívio.

A seguir, abra o arquivo de vídeo com o software de análise e calibrar as ferramentas de medição. Encontre um quadro no vídeo onde há um recurso rastreável visível na extrusão. Grave o número do quadro.

Em seguida, avance o vídeo para um quadro onde o mesmo recurso é visível, mas mudou de sua posição na etapa anterior. Grave o número do quadro. Usando a ferramenta de medição em linha reta, meça a distância do ponto inicial e final do recurso através da medida de análise.

Repita os passos anteriores algumas vezes para cada segmento do vídeo. Finalmente, plote a série de dados. O material inicial ideal para o procedimento descrito aqui são altas densidades de microcristais incorporados em um meio portador viscoso para o injetor.

Cristais proteicos foram usados para coletar dados TRSFX sobre a bactéria bombeada de prótons rhodopsin, que revelou as alterações ultra rápidas que ocorrem após a absorção de fótons. Após a preparação da amostra utilizando um acotrador de três vias, a inspeção visual do material na seringa mostra homogeneidade amostral. E imagens de microscópio podem confirmar a densidade dos cristais.

A amostra está na fase cúbica quando o meio de entrega é claro e viscoso. Misturas turvas são uma indicação de que a amostra está em uma fase esponja ou lamelar, mas não são conclusivas, pois a alta densidade cristalina pode obscurecer a clareza do LCP. Um teste de baixa pressão para identificar a fase da esponja pode ser realizado puxando o êmbolo da seringa para longe da amostra.

Durante o teste do jato, a amostra deve extrusir uma longa coluna contínua de LCP que se move a uma velocidade quase constante. Amostras que são executadas em um modo gotejamento indicam que a viscosidade é muito baixa. Dados de amostras que formam uma coluna devem mostrar que a extrusão permanece acima de uma velocidade mínima ditada pelos parâmetros experimentais.

Após a otimização usando este protocolo, os dados cristalográficos serial de resolução de tempo podem ser coletados em uma instalação especializada. Isso revelará as mudanças conformais em toda a proteína à medida que executa sua função.