Name: Fagocitose de macrófagos alveolares e apuramento de bactérias em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprenda a analisar a função fagocítica de macrófagos alveolares murinos e avaliar o apuramento bacteriano pulmonar usando Pseudomonas aeruginosa. Este método auxilia pesquisadores a estudar respostas imunes in vivo.

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Este trabalho é apoiado pela concessão de R01HL116826 para X. Zhao.

Este protocolo segue as diretrizes do cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da faculdade de medicina de Virgínia Oriental.
1. fluorescente grânulos fagocitose
<ol><li>Eutanásia o mouse (C57BL/6J, 6 semanas de idade, sexo feminino) por CO2 asfixia conforme protocolos IACUC para a ética eutanásia de animais.</li>
	<li>Coloque o mouse de barriga para cima em um tabuleiro de dissecação, coberto com toalhas de papel. Segure as patas com seus membros abertos e ligar uma cadeia de caracteres em seus dentes da frente para puxar sua cabeça de volta para que a traqueia está posicionada em linha reta e nível.</li>
	<li>Molhe a garganta, peito e barriga com etanol a 70% para desinfetar e evitar as peles de degola para as ferramentas do rato.</li>
	<li>Usando pinças regulares, puxe a pele na linha central do corpo e corte com tesoura cirúrgica acima da linha central para a parte superior da garganta.</li>
	<li>Usando a extremidade sem corte de tesoura cirúrgica padrão, cuidadosamente afastar os músculos e tecidos conectivos na garganta e usar tesouras de primavera (micro-tesouras) para expor a traqueia.</li>
	<li>Segurando um anel de cartilagem com a pinça, cuidadosamente faça uma pequena incisão (~1.5 mm), utilizando micro-tesouras, na face da traqueia de ventrículo e introduza uma cânula de 18 G na traqueia.</li>
	<li>Delicadamente lavagem 3 mL de tampão fosfato salino (PBS), 1 mL de cada vez. Cada vez que retirar delicadamente o líquido na seringa e reinfuse-lo de volta para o pulmão, 3x na sucessão. Depois de coletar a LBA, realize deslocamento cervical para garantir a eutanásia. Transfira a PBS coletada (~2.8 mL), que é o líquido de lavagem broncoalveolar (LBA), para um tubo, centrifugar a 1.000 x g por 10 min e coletar o sedimento. Adicione 1 mL de PBS fresco para o tubo e centrifugar a 1.000 x g durante 10 minutos lavar os detritos e coletar os macrófagos alveolares peletizados.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 2 mL do meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) com 10% inactivadas nonheat fetal de soro bovino (FBS) e cultura primária macrófagos alveolares na mesma mídia para 2 dias em um prato de vidro-inferior a 37 ° C numa atmosfera umidificada.</li>
	<li>Aspire a velha mídia, lave-a com 1 mL de PBS e adicionar 2 mL de mídia fresca. Adicionar contas FITC (decapeptídeo látex grânulos, 2 µm de diâmetro, 50 contas/celular) e incubar durante 1 h a 37 ° C numa atmosfera umidificada.</li>
	<li>Lave extensivamente com PBS (1 mL por vez, para um total de cinco lavagens) para remover contas extracelulares. Imagem 100 células aleatoriamente e contar as células com grânulos intracelulares (488 nm). Nota: índices Phagocytic são o número de grânulos ingeridos, dividido pelo número total de macrófagos; a percentagem de células fagocíticas é o número de macrófagos que ingerir pelo menos um grânulo dividido pelo número total de macrófagos16.<ol>
<li>Alternativamente, após uma incubação de 1 h com miçangas, lavam-se as células com 3 mL de PBS e processá-los por citometria de fluxo para a quantificação de fagocitose. Da mesma forma, o processo AMs sem grânulos como células imaculadas ou controle. Calcular a percentagem de positividade e dizer a intensidade da fluorescência, utilizando software de citometria de fluxo, selecionando as opções no software.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. FcγR e CR-mediada por fagocitose
<ol><li>Para a opsonização, incube 2 x 108 ovelhas células vermelhas do sangue (SRBCs) com 50 µ l de coelho anti-SRBC-IgM ou 50 µ l de coelho anti-SRBC-IgG por 30 min em temperatura11.</li>
	<li>Incube SRBCs IgM-opsonizada com 50 µ l de soro humano C5-deficiente (C5D) por 30 min a 37 ° C para corrigir os fragmentos do complemento C3b e C3bi na SRBCs IgM-revestido.</li>
	<li>Murino macrófagos células (MH-S) da semente (10.000 células/poço) em uma placa de 96 poços e incubar durante a noite para obter uma confluência de ~ 70%. Adicione 100 µ l de 1 x 107/mL opsonizada SRBCs a cada poço das células MH-S e incubar durante 1 h a 37 ° C. Lavagem sem uma ligação SRBCs muito rapidamente (~ 1 min) com 100 µ l de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK).</li>
	<li>Lisar as células com SDS 0,1% e adicionar 50 µ l de 2,7-diaminofluorene (DAF) contendo 3% de peróxido de hidrogênio e ureia 6m. Medir a absorvância da formação de hemoglobina-catalisada fluorene azul a 620 nm.</li>
	<li>Determine o número de SRBCs por meio de uma curva padrão em valores de absorvância 620 nm com um número conhecido de SRBCs. Da mesma forma, o processo MH-S células incubadas com nonopsonized SRBCs para usar como controles negativos.</li>
</ol>3. PRR mediada por fagocitose
<ol><li>Siga os passos 1.1-1.9 para o isolamento e cultivo de macrófagos alveolares primário de rato.</li>
	<li>Depois de 2 dias, remova a mídia, lavam-se as células com 1 mL de PBS e adicione 500 µ l de mídia fresca contendo bioparticles de ZnPPIX-A Alexa Fluor-488-conjugado (100 partículas/prato).</li>
	<li>Incubar durante 1 h a 37 ° C. Pare a fagocitose adicionando 500 µ l de PBS gelado.</li>
	<li>Lave as células extensivamente com PBS (1 mL por vez, para um total de cinco lavagens). Fixe as células com paraformaldeído 4% durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar as células extensivamente com PBS (1 mL por vez, para um total de cinco lavagens) e manter as células em 500 µ l de PBS.</li>
	<li>Imagem as células sob contraste de interferência diferencial e um canal fluorescente em 488 nm. Contar AMs contendo ZnPPIX-A bioparticles e determinar a porcentagem de fagocitose.</li>
</ol>4. in Vivo a fagocitose por macrófagos alveolares
Nota: Inocular a p. aeruginosa GFP em uma placa de ágar nutriente e incubar a placa a 37 ° C durante a noite. No dia seguinte, inocular a colônia única a 2 mL de caldo nutriente e crescer a bactéria a 37° C durante a noite.
<ol><li>No dia seguinte, anestesia os ratos com uma administração intraperitoneal de 100 mg/kg quetamina e 10 mg/kg de xilazina. Confirme anesthetization adequada através de uma falta de resposta para o aperto de dedo do pé.</li>
	<li>Coloque o mouse sobre uma placa plana com um elástico entre os incisivos superiores e coloque-o numa posição semirecumbente (45°) com a superfície ventral e rostro virado para cima. Usando a pinça curvada, parcialmente retrai a língua. Usando um microsprayer, intratraquealmente administrar 50 µ l (5 x 106 formadoras unidades [CFU])17 de p. aeruginosa GFP para os pulmões dos ratos anestesiados.</li>
	<li>Após 1 h de infecção, siga os passos 1.1-1.7.</li>
	<li>Ressuspender as células em PBS e cytocentrifuge-los (1.000 x g, 1 min à temperatura ambiente) numa lâmina de vidro.</li>
	<li>Diferencialmente manche os slides cytospin para macrófagos alveolares, neutrófilos e linfócitos, de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Selecione 100 AMs aleatoriamente, contar o AMs contendo bactérias intracelulares e determinar a porcentagem de fagocitose.</li>
</ol>5. in Vivo bactérias autorização usando p. aeruginosa
<ol><li>Inocular a p. aeruginosa em uma placa de ágar de isolamento de p. aeruginosa e incubar a placa a 37 ° C durante a noite. Inocular a colônia única a 2 mL de caldo lisogenia (LB) e crescer a bactéria a 37° C durante a noite. Calcule o UFC, usando a seguinte fórmula. UFC/mL = (número de colônias x fator de diluição) / volume da placa de cultura. Dilua a cultura com PBS para obter o desejado UFC/mL.</li>
	<li>No 1º julgamento, intratraquealmente injetar uma dose subletais de ~2.5 x 105 UFC/mL de p. aeruginosa anestesiado selvagem-tipo (WT) e TRIM72 ratosKO , tal como indicado no passo 4.2. Medir o peso corporal diariamente por 6 dias.</li>
	<li>No teste 2, injete uma segunda dose de p. aeruginosa (5 x 105 UFC/mL) os ratos que sobreviveram no 1º julgamento e medem o peso de corpo por 4 dias.</li>
	<li>No 3º julgamento, usando um conjunto diferente de ratos, injectar WT e TRIM72KO ratos com uma dose letal (3 x 107 UFC/mL) de p. aeruginosa e registar a mortalidade dentro de 2 dias de injeção. Animais apresentando sinais de estresse severo, como perda de peso significativa do corpo, costas encurvada, anorexia ou dispneia será avaliada por veterinários a atendente. Intratáveis animais serão sacrificados imediatamente.</li>
	<li>Morte ou após eutanásia no 2º dia após a injeção, colete tecido pulmonar-todo para a quantificação da carga bacteriana pulmonar na infecção de pico.</li>
	<li>Para testar a carga bacteriana do pulmão, adicionar 200 µ l de solução salina para os tecidos do pulmão e homogeneizar a eles, usando uma configuração previamente testada em um homogeneizador eletrônico que interrompe completamente o tecido pulmonar sem quebrar as bactérias. Ajuste o volume total do pulmão homogenate de 1ml e placa 100 µ l de pulmão lisado em placas de ágar de isolamento de Pseudomonas em 10 vezes diluições em série.</li>
	<li>Incubar as placas a 37 ° C por 24 h e contagem das colônias bacterianas para determinar o CFU por todo pulmão.</li>
</ol>6. análise estatística
<ol><li>Usar o Student t-teste para determinar a significância estatística da diferença entre os dois grupos. Considere uma diferença estatisticamente significante quando p < 0,05. Todos os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM).</li>
</ol>

<ol><li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages%3A+plasticity+in+a+tissue-specific+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li>
<li>Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Dysfunction+in+Respiratory+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).</li>
<li>Broug-Holub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+required+for+protective+pulmonary+defenses+in+murine+Klebsiella+pneumonia%3A+elimination+of+alveolar+macrophages+increases+neutrophil+recruitment+but+decreases+bacterial+clearance+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival.</a> Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).</li>
<li>Knapp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+have+a+protective+antiinflammatory+role+during+murine+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).</li>
<li>Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemokines+in+the+pathogenesis+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).</li>
<li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae%2C+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).</li>
<li>Greenlee-Wacker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+neutrophils+and+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation.</a> Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).</li>
<li>Haslett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+apoptosis+and+its+role+in+the+resolution+and+control+of+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).</li>
<li>Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+engulfment+of+apoptotic+neutrophils+contributes+to+the+resolution+of+acute+pulmonary+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).</li>
<li>Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+phagocytic+uptake+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Opsonic+Phagocytosis+via+Fc%CE%B3+Receptors+and+complement+receptors+on+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).</li>
<li>He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+macrophage+complement+receptor+CRIg+in+immune+clearance+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation.</a> Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).</li>
<li>Nagre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Macrophage+Complement+Receptor+CRIg+by+TRIM72+Polarizes+Innate+Immunity+of+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+to+Determine+the+Engulfment+of+Apoptotic+Cells+by+Macrophages+using+pHrodo+Succinimidyl+Ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li>
<li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li>
<li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Durante a execução de uma função de troca de gás, o pulmão persistentemente confronta alérgenos, patógenos e partículas estranhas. AMs fornecem a primeira linha de defesa em virtude da sua função principal, ou seja a fagocitose. AMs também coordenam com outras células do sistema imunológico em destruir os patógenos e na resolução da inflamação. Aqui, descrevemos os métodos para avaliar especificamente a fagocitose por AMs isolada do pulmão do rato. O protocolo apresentado neste manuscrito explica um estudo detalhado da f...

MGA é os principais fagócitos residentes no alvéolo na fase de repouso e um dos principais players de inatas respostas imunes através do reconhecimento e internalização dos patógenos inalados e partículas estranhas1,2. Tem sido relatado que AMs são essenciais para a habilitação rápida de muitos patógenos pulmonares tais como p. aeruginosa e Klebsiella pneumonia3,4, por uma deficiência na fagocitose AM muitas vezes resulta em respiratória infecções, como pneumonia aguda, que causam maiores taxas de mortalidade e morbidade.
AMs também iniciar inatas respostas inflamatórias no pulmão através da produção de citocinas e quimiocinas como TNF-α e IL-1 β, que conversa cruzada com outras células do ambiente alveolar para produzir quimiocinas e recrutar inflamatórios neutrófilos, monócitos, e células do sistema imunológico adaptativas no pulmão5. Por exemplo, a IL-1 β, produzido por AMs ajuda a prime a liberação do neutrófilos chemokine CXCL8 de células epiteliais6. Além disso, AMs contribuam para a fagocitose de apoptotic leucócitos polimorfonucleares (PMN), falha de que leva para o escapamento sustentado de enzimas intracelulares de PMN ao tecido circundante, resultando em danos nos tecidos e inflamação prolongada 7 , 8 , 9.
Fagocitose por AMs é mediada por um reconhecimento direto de padrões moleculares associados patógeno na superfície do patógeno pelos receptores de reconhecimento padrão (PRRs) do AMs ou pela ligação de patógenos opsonized com receptores efetoras imune da AMs 10. por último, AMs podem reconhecer os alvos opsonizados com imunoglobulina (IgG) através de seus receptores Fcγ (FcγR) ou os patógenos revestidos com fragmentos de complemento, C3b e C3bi, através de seus receptores de complemento (CR)11. Entre receptores de complemento, o CR da superfamília imunoglobulina (CRIg) seletivamente é expresso em macrófagos de tecido12, e uma recente descoberta destacou o papel do CRIg na fagocitose do AM no contexto de pneumonia de p. aeruginosa 13.
Muitos estudos originais usam métodos para avaliar a fagocitose de macrófagos para descrever os mecanismos moleculares do macrófago função14,15. No entanto, métodos como fagocitose in vivo requerem uma quantificação exacta da fagocitose. Aqui, podemos resumir uma metodologia detalhada para a fagocitose in vitro e in vivo usando o isotiocianato de fluoresceína (FITC)-pérolas de vidro e proteína de p. aeruginosa verde fluorescente (GFP), respectivamente. Além disso, vamos explicar o método de diferenciação entre PRR, CR e fagocitose mediada por FcγR. Finalmente, nós relatamos um método para caracterizar o apuramento bacteriano no mouse no que diz respeito uma pneumonia de p. aeruginosa .

<table><tbody><tr><td>Agulha 18-G</td><td>Nipro Medical&nbsp;</td><td>CI + 1832-2C</td><td>Biologia Molecular grau</td></tr><tr><td>2,7-diaminofluoreno (DAF)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D17106</td><td>Biologia Molecular grau</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>18C27B</td><td>Placa analítica</td></tr> de <tr><td>96 poços</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Cell Biology grau</td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td> Life <td>Technologies</td><td>A10492</td><td>Molecular Biology grade</td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Z23373</td><td>Molecular Biology grau</td></tr><tr><td>C5 deficiente sérum&nbsp;</td>Centrífuga <td>de reagente bioquímico</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C1163</td></tr><tr><td></td><td>Labnet International</td><td>C0160-R</td><td></td></tr><tr><td>Citospin 4 Citocentrífuga</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A78300101 Edição 11</td><td></td></tr><tr><td>Mídia de Cultura de Células DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Grau de Biologia Celular</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Grau de Biologia Celular</td></tr><tr><td>Fluxo Citômetro</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo Software</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Dumont</td><td>0508-SS/45-PS-1</td><td>Adequado para dissecação de animais de laboratório</td></tr><tr><td>Contas de látex carboxilado FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4530</td><td>Grau de Biologia Celular</td></tr><tr><td>GFP-P. aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>101045GFP</td><td>Adequado para&nbsp; ensaios de infecção celular</td></tr><tr><td>Prato de fundo de vidro</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de alta pressão</td> de grau de biologia celular <td>Penn-Century</td><td>FMJ-250</td><td>Adequado para uso em animais de laboratório</td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>Omni International</td><td>TH-01</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Microscópio de</td></tr><tr><td>fluorescência invertida</td> de grau analítico <td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina Cloridrato</td><td>Hospira</td><td>CA-2904</td><td>Grau farmacêutico</td></tr><tr><td>Shandon Kwik-Diff Manchas</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>9990700</td><td>Biologia Celular grau</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td>Biologia Molecular grau</td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427</td><td>Biologia Molecular grau</td></tr><tr><td>MicroPulverizador Aerossolizador</td><td>Penn-Century</td><td>IA-1C</td><td>Adequado para uso em animais</td></tr><tr><td>de laboratório Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Reagente grau</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>Grau de Biologia Celular</td></tr><tr><td>coelho anti-SRBC-IgG&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>Adequado para imuno-ensaios</td></tr><tr><td>de coelho anti-SRBC-IgM&nbsp;</td><td>Cedarline Laboratories</td><td>CL9000-M</td><td>Adequado para imuno-ensaios</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Miltex</td><td>5-2</td><td>Adequado para dissecação de animais de laboratório</td></tr><tr><td>Laringoscópio de Pequenos Animais</td><td>Penn-Century</td><td>LS-2</td><td>Adequado para uso em animais de laboratório</td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)</td><td>BioRad</td><td>1610301</td> Tesoura de Mola <td>de Grau</td></tr><tr><td>Analítico (Med)</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15012-12</td><td>Adequado para dissecação de animais de laboratório</td></tr><tr><td>Tesouras de mola (pequenas)</td> <td>Ferramentas de ciência fina</td><td>91500-09</td><td>Adequado para dissecação de animais de laboratório</td></tr><tr><td>de glóbulos vermelhos de ovelha (SRBCs)&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>55876</td><td>SRBCs lavados, preservados</td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td>Grau de Biologia Molecular</td></tr><tr><td>Xilazina&nbsp;</td><td>Akorn Saúde Animal</td><td>59399-110-20</td><td>Grau farmacêutico</td></tr></tbody></table>

fagocitose de macrófagos alveolares e apuramento de bactérias em ratos

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Macrófagos alveolares (AMs) guardam o espaço alveolar do pulmão. Fagocitose por AMs tem um papel fundamental na defesa contra a invasão de agentes patogénicos, a remoção de células mortas ou partículas estranhas e na resolução de respostas inflamatórias e remodela o tecido, processos que são mediadas por diversos receptores de superfície de o AMs. Aqui, nós relatamos métodos para a análise da função fagocitária do AMs usando estratégias experimentais e ensaios in vitro e in vivo para diferenciar os receptores de reconhecimento padrão-, complemento do receptor e gama Fc mediada fagocitose. Finalmente, discutimos um método para estabelecer e caracterizar um modelo de uma pneumonia de p. aeruginosa em camundongos para avaliar bacteriana liberação in vivo. Estes ensaios representam os métodos mais comuns para avaliar funções AM e também podem ser usados para estudar a função de macrófagos e liberação bacteriana em outros órgãos.

Primeiro realizamos o experimento para analisar a fagocitose por mouse AMs primários. Ao longo de todas as análises, comparamos AMs isolados de ratos deKO WT e TRIM72. Como mostrado na Figura 1A, microscopia de fluorescência revelou que fagocitose dos grânulos de vidro-FITC pelo mouse AMs primárias ocorre após 1 h de incubação. Figura 1 B mostra a análise da fagocitose por citometria d...

Aqui nós relatamos métodos comuns para analisar a função fagocitária de macrófagos alveolares murino e apuramento bacteriano do pulmão. Esses métodos estudam in vitro fagocitose dos grânulos de isotiocianato de fluoresceína e fagocitose in vivo de Pseudomonas aeruginosa verde proteína fluorescente. Também descrevemos um método para limpar p. aeruginosa em camundongos.

Fagocitose de macrófagos alveolares e apuramento de bactérias em ratos

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Pseudomonas aeruginosa é um patógeno de nível BSL-2. Lembre-se de seguir todas as práticas de segurança de nível BSL-2 ao manusear este organismo. Aqui demonstraremos o isolamento celular primário, a fagocitose in vitro e a análise da via fagocítica, e a phagocytose in vivo e a avaliação de liberação bacteriana em camundongos.A entrega intratraqueal bem sucedida requer prática para dominar. Certifique-se de que a microsprayer está devidamente carregada, a agulha está entre as duas dobras vocais e a velocidade do êmbolo está devidamente controlada. Comece prendendo o rato na posição supina com os membros espalhados em uma placa de dissecção coberta com toalhas de papel e enganchando uma corda sob os dentes da frente para retrair a cabeça para que a traqueia seja posicionada em linha reta e nivelada.Desinfete o rato com 70% de etanol e use fórceps regulares para puxar a pele na linha central do corpo. Use uma tesoura cirúrgica para cortar a pele do abdômen até o topo da garganta. Use a extremidade cega da tesoura cirúrgica padrão para dissecar cuidadosamente o músculo da garganta e os tecidos conjuntivos.Abra a parede abdominal abaixo da caixa torácica. Corte o diafragma e corte a pa

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Descrevemos os protocolos para a colheita murinos macrófagos alveolares, que são residentes as células imunes inatas no pulmão, e examinando a sua ativação em resposta a co-cultura com nanopartículas polianidrido.

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Os macrófagos desempenham um papel central na homeostase e patologia em muitos tecidos. O protocolo apresentado aqui descreve métodos para esgotar...

Depleção e reconstituição de macrófagos em Ratos

Fonte: Nagre, N., et al. Macrófago alveolar, fagocitose e eliminação bacteriana em camundongos. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra a avaliação da fagocitose mediada pelo receptor do complemento usando glóbulos vermelhos de ovelha opsonizados com IgM e complemento, seguida de sua absorção por macrófagos de camundongos. A extensão da fagocitose é quantificada medindo um produto cromogênico azul formado por oxidação catalisada por hemoglobina do diaminofluoreno.

Modelagem da Fagocitose Mediada por Complemento Usando Glóbulos Vermelhos Opsonizados In Vitro

Pegue uma cultura aderente de macrófagos murinos.Trate bem o teste com um buffer contendo Wnt5A, uma molécula sinalizadora, e o controle apenas com buffer.Infeccione com um patógeno bacteriano e incube.Nas células testadas, Wnt5A ativa uma cascata de sinalização que potencializa a reorganização do citoesqueleto para impulsionar a absorção bacteriana nos fagossomos, enquanto células controle que não possuem essa sinalização internalizam menos bactérias.Lave para remover bactérias não...

Aprimoramento da depuração bacteriana mediada por Wnt5A em macrófagos múrinos

Um método para avaliar a capacidade dos isolados macrófagos alveolares do rato para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitados por microscopia confocal.

Avaliar a atividade anti-fúngica isolada de macrófagos alveolares por microscopia confocal

Embora o estudo in vitro das interações patógeno-hospedeiro permita a caracterização de respostas imunes específicas, modelos in vivo são necessários para observar os efeitos de respostas complexas. Usando a exposição a Candida albicans seguida de infecção pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, estabelecemos um modelo murino de interações microbianas envolvidas na patogenicidade da pneumonia associada à ventilação mecânica.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Aqui descrevemos o modelo e a abordagem para estudar as funções dos macrófagos alveolares pulmonares na metástase do câncer. Para demonstrar o papel dessas células na metástase, foi utilizado o modelo singênico (4T1) de câncer de mama em conjunto com a depleção de macrófagos alveolares com lipossomas de clodronatos.

Estudar o papel dos macrófagos alveolares em câncer de mama metastático

Vários métodos foram descritos na literatura para a modelagem de pneumonia bacteriana em murganhos. Aqui, nós descrevemos um método de baixo custo, rápida não-invasiva para induzir pneumonia por aspiração (isto é, por inalação) de um inoculo bacteriano pipetados para a orofaringe. métodos a jusante para avaliação da resposta imune inata pulmonar também são detalhados.

Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

Esta comunicação descreve metodologias para isolamento e cultura de macrófagos alveolares dos humanos e modelos murino para fins experimentais.

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Este manuscrito descreve um protocolo para determinar se a exposição ao ozônio, um critério poluente aéreo, prejudica a efferocitose alveolar do macrófago in vivo. Este protocolo utiliza reagentes e técnicas comumente usados e pode ser adaptado a vários modelos de lesão pulmonar para determinar os efeitos sobre a efferocitose do macrófago alveolar.

In vivo avaliação da Efferocitose de macrófago alveolar após exposição ao ozônio

Este protocolo descreve o isolamento de macrófagos intersticiais (MIs) pulmonares e sua transferência adotiva após estimulação com IL-33 dos alvéolos pulmonares em modelo murino, o que pode facilitar o estudo in vivo da fibrose pulmonar idiopática (FPI).

Transferência Adotiva de Macrófagos Estimulados por IL-33 em Modelos de Camundongos Induzidos por Bleomicina para Estudar seu Efeito na Fibrose Pulmonar Idiopática In Vivo

Aprenda a analisar a função fagocítica de macrófagos alveolares murinos e avaliar o apuramento bacteriano pulmonar usando Pseudomonas aeruginosa. Este método auxilia pesquisadores a estudar respostas imunes in vivo.

Fagocitose de macrófagos alveolares e apuramento de bactérias em ratos

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