Name: Efeito de anticorpo Anti-c-fms Osteoclast formação e proliferação de Osteoclast Precursor In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprenda a gerar osteoclastos a partir de medula óssea murina usando M-CSF e RANKL ou TNF-alfa. Este protocolo demonstra o efeito do anticorpo Anti-c-fms na osteoclastogênese, com potencial terapêutico para artrite reumatoide e periodontite.

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Este trabalho foi financiado em parte por um KAKENHI JSPS conceder da sociedade para a promoção da ciência (n. º 16K 11776 H. K., n º 17K 17306 de K. S., n. º 16K 20637 de K. K., n. º 16K 20636 para S., n. º 18K 09862 de I. M.) de Japão.

Todos os procedimentos de animal e cuidados com animais foram realizadas de acordo com os regulamentos e as regras da Universidade de Tohoku.
1. manipulação e dissecação do membro posterior murino
<ol><li>Antes de dissecação, encha um prato com aproximadamente 50 mL de α-MEM, dependendo do tamanho do recipiente e coloque-o no gelo. Isto servirá como um recipiente de coleta até a dissecação de todos os ossos é completa. Para isto e subsequentes experimentos, use α-MEM contendo 10% fetal de soro bovino (FBS), 100 UI/mL penicilina G e 100 estreptomicina μg/mL.</li>
	<li>Eutanásia por inalação de uma overdose de 5% de isoflurano em C57Bl/6J rato.</li>
	<li>Fixar o mouse em posição supina usando pinos perfurados as palmas das mãos e pés e spray completamente com etanol a 70%.</li>
	<li>Faça uma incisão de pele usando uma tesoura cirúrgica estéril e pinças ao nível do quadril e estendê-lo até os pés, expondo os músculos.</li>
	<li>Corte o tendão anexar o músculo quadríceps e o tendão anexar o tendão muscular ao osso. Descasca os músculos expondo as articulações do quadril e o joelho. Localizar estes tendões facilitará liberando ambos os músculos dos seus anexos sem deixar etiquetas de tecidos moles. Não corte no osso.</li>
	<li>Coloque a tesoura entre a cabeça do fêmur e o espaço articular e desviá-la libertando o fêmur, mas manter o osso intacto. Isto irá permitir o desprendimento dos ossos sem o risco de expor a medula óssea.</li>
	<li>Da mesma forma, corte os músculos anexar à tíbia. Corte a tíbia livre de sua fixação na articulação do tornozelo, mantendo o osso intacto para evitar contaminação.</li>
	<li>Raspe qualquer tecido mole restante do fêmur e tíbia usando as lâminas da tesoura e kimwipe e coloque-o em um prato com α-MEM colocado no gelo.</li>
</ol>2. murino membro posterior isolamento de medula óssea
<ol><li>Encha uma seringa de agulha 30G com α-MEM.</li>
	<li>Desconecte-se da tíbia e fêmur longe da articulação do joelho.</li>
	<li>Corte as extremidades do osso longo de ambos os lados com uma tesoura.</li>
	<li>Segure o osso do eixo usando uma pinça, insira a agulha no espaço da medula do osso e liberar lentamente o conteúdo da medula em um prato de cultura de 6 cm. O osso vai aparecer branco, indicando a extração de todo o conteúdo da medula óssea. Repita para todos os ossos.</li>
	<li>Tensão da medula óssea extrair usando um coador de célula de nylon μm 40 em um tubo de centrifuga conico de 50 mL e centrifugar x g por 5 min.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante, lavar com 5 mL de α-MEM e centrifugar a 300 x g durante 5 min. repetir lavagem para um total de 2 vezes.</li>
	<li>
Resuspenda o pellet em 10 mL de α-MEM e realizar uma contagem de células usando um hemocytometer como segue:
	<ol>
<li>Fazer uma diluição de 1:1 da suspensão de células, adicionando 10 μL da suspensão de células de 10 μL de 0,4% trypan azul em um tubo de 1,5 mL e pipetar uma vez.</li>
		<li>Cubra a câmara de hemocytometer com uma tampa corrediça e transferir a suspensão do corante para o hemocytometer. É importante para não encher demais ou underfill da câmara e permitir a suspensão encher a câmara por ação capilar.</li>
		<li>Coloque o hemocytometer em um palco de microscópio. Com objetivo de x 10, concentre-se na Praça do centro. Conte todas as células vinculadas por 3 linhas. Para se certificar de que as células não são contadas duas vezes, conte os cantos superiores e direito de cada quadrado. Células mortas aparecerá azul escuro, estas são excluídas da contagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dependendo da aplicação a jusante, propagar as células dentro de um vaso de cultura apropriado. Para esta experiência particular, siga seção 3.</li>
</ol>3. geração de BMM
<ol><li>Semente de 1 x 107 células/10 mL em um 10cm cultura prato e adicionar M-CSF 100 ng/mL. A concentração final de M-CSF é 100 ng/mL de meio de cultura. Incube a cultura a 37 ° C, 5% de CO2 por 3 dias.</li>
	<li>Depois de 3 dias, retire o meio de cultura, lavar as células vigorosamente com 10 mL de salina tamponada fosfato (PBS) duas vezes para remover as células não-aderentes, adicionar 5 mL de 0,02% de temperatura do trypsin-EDTA em PBS e incubar a 37 ° C, 5% de CO2 por 5 min.</li>
	<li>Separe as células pipetando minuciosa. Certifique-se que as células têm sido desanexadas, observando a cultura sob um microscópio (as células devem aparecer arredondados e flutuante na mídia). Se as células continuam a ser anexadas, repita a pipetagem minuciosamente para desanexá-los. Quando as células têm sido desanexadas, adicione 5 mL de α-MEM para inactivar a reação.</li>
	<li>Coletar as células em um tubo cônico de 50 mL e centrifugar x g por 5 min. descartar o sobrenadante e lavar com 5 mL de α-MEM.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g por 5 min e resuspenda o pellet em 10 mL de α-MEM.</li>
	<li>Realize uma contagem de células, conforme descrita na etapa 2.7.1.</li>
	<li>Semente de 1 x 106 células/10 mL em um 10cm cultura prato e adicionar M-CSF 100 ng/mL. A concentração final de M-CSF é 100 ng/mL de meio de cultura. Incube a cultura a 37 ° C, 5% de CO2 por 3 dias.</li>
</ol>4. geração de osteoclastos de BMM como precursores de Osteoclast
<ol><li>Após 3 dias, colhem as células anexadas que representam BMM como precursores de osteoclasto, seguindo passos 3.2-3.7.</li>
	<li>BMM semente em 5 x 104 células/200 μL de α-MEM em um prato bem 96. Adicione RANKL para uma concentração final de 50 ng/mL ou TNF-α, para uma concentração final de 100 ng/mL. Adicione o M-CSF para uma concentração final de 100 ng/mL a cada poço.</li>
	<li>Adicione o anticorpo anti-c-fms (concentração final de 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) a cada poço.</li>
	<li>Incube a 37 ° C, 5% de CO2 por 4 dias. Mudar a mídia todos os dias por 4 dias.</li>
</ol>5. mancha de fosfatase ácida tartarato-resistente (TRAP)
<ol><li>Após 4 dias de incubação, Aspire cuidadosamente o meio de cultura de cada poço. Lave bem uma vez com 200 μL de temperatura 1X PBS.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de formol a 10% a cada poço para fixação e incube por 1h à temperatura ambiente. Aspirar a formalina e lave cada poço 3 vezes com água desionizada.</li>
	<li>Adicione 200 μL de 0,2% Triton X-100 em PBS a cada bem para permeabilização e incubar por 1h à temperatura ambiente. Aspirar o Triton X-100 e lave cada poço 3 vezes com água desionizada.</li>
	<li>Adicione 200 μL de solução de mancha de armadilha para cada poço. Visualize a mancha sob o microscópio. Vai demorar de 10 a 30 min para a mancha desenvolver adequadamente.</li>
	<li>Aspire a mancha e lave cada bem com água desionizada 3 vezes e secar ao ar. Manter à temperatura ambiente para usar em observação posterior.</li>
</ol>6. proliferação ensaio
<ol><li>BMM semente como precursores de osteoclast em 5 x 103 células/200 μL de α-MEM em um prato bem 96. Adicione o M-CSF para uma concentração final de 100 ng/mL a cada poço.</li>
	<li>Adicione o anticorpo anti-c-fms (concentração final de 0, 1, 10, 100, 1.000 ng/mL) e incubar a 37 ° C, 5% de CO2 por 3 dias sem mudança de média.</li>
	<li>Após 3 dias, lavam-se as células com PBS 1x. Adicione 100 μL de α-MEM a cada poço.</li>
	<li>Adicionar 10 μL de célula contando solução kit e incubar a 37 ° C, 5% de CO2 por 2 h e determinar a absorbância de cada poço a 450 nm, utilizando um leitor de microplacas.</li>
</ol>

<ol><li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology%3A+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287(2015).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li>
<li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF%2FRANKL-RANK+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li>
<li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li>
<li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li>
<li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li>
<li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li>
<li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angle+Orthodontist%22%5BJournal%5D)">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li>
<li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Develpoment%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li>
<li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+%28op%2Fop%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li>
<li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li>
<li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste estudo, investigamos o efeito do anticorpo anti-c-fms na formação induzida pelo RANKL osteoclasto, formação de TNF-α-induzida osteoclasto e proliferação de precursor de osteoclast M-CSF-induzida. Nós achamos que a quantidade efetiva de anticorpo anti-c-fms para a inibição da osteoclastogenesis entre formação induzida pelo RANKL osteoclasto, formação de osteoclast induzida por TNF-α e M-CSF-induzida proliferação de precursores osteoclast é diferente.
RANKL Medeia osteoclastogenesis na pre...

Os osteoclastos são células altamente especializadas, e eles diferenciar de células-tronco hematopoiéticas através da fusão de vários precursores do osteoclast. Eles são essenciais para a remodelação óssea saudável e contribuem para a reabsorção óssea patológica associada a doenças inflamatórias osteolíticas, tais como artrite reumatoide e doença periodontal1.
Função Osteoclastogenesis e osteoclasto são mediadas por dois fatores-chave; macrófago colônia de fator (M-CSF) e do receptor ativador de ligante de fator nuclear kappa-B (RANKL). Tanto M-CSF e RANKL são importantes para osteoclast diferenciação2. Outro fator que tem sido mostrado para induzir a formação de osteoclast de macrófagos da medula óssea in vitro é o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α formação mediada osteoclast foi mostrada para ser crítico de osteólise em doenças como artrite reumatoide6, doença periodontal7e osteoporose pós-menopausa8destrutivo.
C-fms é o receptor de membrana do M-CSF e Medeia sua ação. O papel do c-fms é bem documentado na literatura, como foi demonstrado que a administração de um anticorpo contra c-fms (anticorpo anti-c-fms) completamente preso osteoclastogenesis em um modelo de artrite, bem como em TNF-α induzida por erosões ósseas, enquanto osteoclastogenesis distante da articulação inflamada foi ainda robusto9. Administração do anticorpo anti-c-fms inibiu a reabsorção de formação e osso osteoclast induzida pelo lipopolissacarídeo (LPS) em rato Calvárias10 , bem como em periodontite induzida por LPS modelo11. Além disso, anticorpos anti-c-fms inibiam a reabsorção de raiz induzida por estresse mecânico durante de movimento ortodôntico do dente12, bem como o movimento ortodôntico do dente e reabsorção óssea associada de movimento ortodôntico do dente13.
M-CSF foi relatado para ter outras funções que são essenciais para a resposta imune do hospedeiro. A ausência de M-CSF em camundongos op/op com pneumonia bacteriana conduzir ao aumento da carga bacteriana e disseminação bacteriana no fígado com necrose hepática14. Portanto, M-CSF é importante para a resposta imunológica na proteção de infecção.
Este estudo demonstra o efeito do anticorpo anti-c-fms em M-CSF e RANKL ou TNF-α induzida formação osteoclast in-vitro e M-CSF induzida proliferação de precursores do osteoclast. Este protocolo demonstra o isolamento de células de medula murino de ossos longos e as etapas para gerar os macrófagos da medula óssea (BMM) que são considerados as precursoras do osteoclasto e para induzir a diferenciação de BMM em osteoclastos Relaxometria por dois métodos; RANKL ou TNF-α. O protocolo também compara a prisão de osteoclastogenesis em ambos os métodos usando anticorpo anti-c-fms.
O processo pelo qual medula óssea é extraída e posteriormente usada para gerar precursores osteoclasto é confiável em produzir grandes quantidades de culturas osteoclast puro que podem ser usadas em múltiplas aplicações a jusante, tais como testes de drogas. O uso de RANKL ou TNF-α para induzir osteoclastogenesis neste protocolo distingue osteoclastogenesis como um processo fisiológico (RANKL) de osteoclastogenesis como um processo patológico (TNF-α), que por sua vez, fornece dois procedimentos alternativos para guiar a decisão das quais uma é superior em termos de reagentes a ser usada em aplicações a jusante. Este protocolo também fornece um método pelo qual podemos determinar uma concentração adequada de anticorpo anti-c-fms, que pode ser utilizada para estudos posteriores envolvidos na reabsorção óssea e doenças osteolíticas.

<table><tbody><tr>Anticorpo <td></td><td></td><td>anti-c-Fms</td><td>AFS98, um anticorpo monoclonal, antimurino, c-Fms de rato (IgG2a)</td></tr><tr><td>TNF-&alfa;</td><td></td><td></td><td>TNF-&alfa murino recombinante; preparado em nosso laboratório. TNF-&alfa; fragmento de cDNA clonado por RT-PCR e clonado em um pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) para gerar uma proteína de fusão GST. GST-TNF-&alfa; foi expressa em células de células BL21 de Escherichia coli (Stratagene, La Jolla, CA). As células foram lisadas em condições não desnaturantes e GST-TNF-&alfa; foi purificado sobre uma coluna de glutationa-Sepharose. O GST foi clivado pela protease de pré-cisão (Amersham Biosciences) pelo fabricante' s direções e foi removido por uma coluna de glutationa-Sepharose.</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PEPROTECH</td><td>315-11</td><td>Ligante sRANK Murino Recombinante, Fonte: E. coli</td></tr><tr><td>M-CSF M-CSF</td><td></td><td></td><td>humano recombinante. 1/10 vol de CMG14&ndash; 12 sobrenadante de cultura de linha celular a 5x106&nbsp; células em uma placa de cultura em suspensão de 10 cm.</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Wako</td><td>com L-Glutamina e Soro</td><td></td> Fetal Bovino vermelho de fenol</tr><tr><td></td><td>Biowest</td><td>s1820-500</td><td>Soro Fetal Bovino Origem Francesa</td></tr><tr><td>Placa de cultura</td><td>Corning</td><td></td><td>100 mm x 20 mm placa</td></tr><tr><td>de 96 poços</td><td>Thermofischer Scientific</td><td></td><td>Nun clon Delta surface</td></tr><tr><td>Cell counting kit-8</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Corning</td><td></td><td>40 &mu; m Tubo de</td></tr><tr><td>centrífuga</td> de nylon <td>Corning</td><td></td><td>50 mL CentriStar tampa</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td></td><td>Polioxietileno (10) Éter octifenílico</td></tr></tbody></table>

efeito de anticorpo anti-c-fms osteoclast formação e proliferação de osteoclast precursor in vitro

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Remodelação óssea é um processo complexo e que envolve períodos de deposição e reabsorção. Reabsorção óssea é um processo pelo qual osso é dividido pelos osteoclastos em resposta a diferentes estímulos. Precursores de osteoclast diferenciarem-se em osteoclastos Relaxometria em resposta à colônia de macrófago fator (M-CSF) e do receptor ativador de ligante fator nuclear Kappa-B (RANKL). Sob condições patológicas, o perfil de citocinas é diferente e envolve uma mistura de citocinas inflamatórias. Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) é dentre as citocinas mais importantes, como pode ser encontrada em grandes quantidades em áreas envolvidas com osteólise inflamatória. O propósito do presente protocolo é fornecer um método pelo qual murino de medula óssea é isolada para gerar osteoclastos através de indução com M-CSF e RANKL ou TNF-α, que posteriormente será inibido, aumentando as doses de anticorpo anti-c-fms, o receptor para o M-CSF. Esta experiência destaca o valor terapêutico do anticorpo anti-c-fms em doenças de reabsorção óssea inflamatória.

O propósito do presente protocolo é avaliar o efeito do anticorpo anti-c-fms na formação osteoclast na presença de RANKL ou TNF-α e para determinar o efeito do M-CSF na proliferação de precursores do osteoclast. Neste protocolo, nós fornecemos um processo confiável, pelo qual grandes quantidades de culturas puras osteoclast são geradas. Nós também fornecemos uma maneira de testar a concentração adequada de anticorpo anti-c-fms para inibir a formação de osteoclast sob condições de cultura ...

Este protocolo inclui a dissecação de murino de ossos longos e isolamento de medula óssea, para gerar os macrófagos da medula óssea e produzir osteoclastos usando macrófago da colônia fator (M-CSF) e do receptor ativador de ligante fator nuclear Kappa-B (RANKL) ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a sua detenção por anticorpo anti-c-fms, receptor de M-CSF.

Efeito de anticorpo Anti-c-fms Osteoclast formação e proliferação de Osteoclast Precursor In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Este experimento destaca o valor terapêutico do anticorpo Anti-c-fms em doenças de ruptura óssea inflamatória, como artrite reumatoide e periodontite. O processo pelo qual a medula óssea é extraída e usada para gerar precursores osteoclatos, produz grandes quantidades de osteoclartos puros, que podem ser usados em múltiplas aplicações a jusante. Este protocolo fornece dois métodos alternativos de osteoclastogênese, seja usando ligante RANKL ou TNF alfa.Além disso, este método fornece uma visão do efeito do anticorpo Anti-c-fms na osteoclastogênese. A demonstração visual desse procedimento familiariza o pesquisador com o processo de dissecção e obtenção de células de medula óssea em grandes quantidades. Para começar a encher uma placa que servirá como um recipiente de coleta com aproximadamente 50 mililitros de mem alfa, dependendo do tamanho do recipiente, e colocá-lo no gelo.Use pinos para perfurar as palmas das mãos e pés de um rato eutanizado para fixá-lo em posição supina, e pulverizar completamente com 70% de etanol. Use tesoura cirúrgica estéril e pinça para fazer uma incisão da pele ao nível do quadril e estenda-a até os pés, expondo os músculos. Localize e corte o tendão que prende o músculo quadríceps.Retire o músculo e corte-o ao nível do quadril. Em seguida, localize o tendão anexando o músculo do tendão ao osso. Retire os músculos expondo o osso, e liberte o tendão de seu apego, certificando-se de não cortar no osso.Posicione a tesoura entre a cabeça do fêmur e o espaço articular. Corte nele liberando o fêmur, mas mantendo o osso intacto, o que permitirá o descolamento dos ossos sem risco de expor a medula óssea. Corte os músculos presos à tíbia de forma semelhante.Em seguida, corte a tíbia livre de sua fixação na articulação do tornozelo, mantendo o osso intacto para evitar contaminação. Use as lâminas da tesoura e os lenços de laboratório para raspar qualquer tecido mole restante do fêmur e tíbia e coloque-os na placa preparada com MEM alfa colocado no gelo. A dissecção deve ser realizada cuidadosamente para minimizar a contaminação.É por isso que a remoção completa do tecido mole e a localização óssea são cruciais. Encha uma seringa de agulha calibre 30 com mem alfa. Desconecte a tíbia e o fêmur da articulação do joelho, e corte as extremidades do osso longo de ambos os lados usando uma tesoura.Use pinças para segurar o osso do eixo. Insira a agulha no espaço da medula ao osso e lave lentamente o conteúdo da medula em um prato de cultura de seis centímetros e repita para todos os ossos. O osso ficará branco, indicando a extração de todo o teor de medula óssea.Use um coador de células de nylon de 40 micrômetros para esticar o extrato da medula óssea em um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros. Centrifugar o tubo a 300 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernaspeso.Para lavar, adicione cinco mililitros de MEM alfa à pelota. Pipeta as células para desprender, centrífuga, e repetir a lavagem por um total de duas vezes. Depois de contar essas células isoladas, como descrito no manuscrito, semente 10 milhões de células por 10 mililitros, em um prato de cultura de 10 centímetros, e adicionar M-CSF às células.Incubar a cultura a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por três dias. Remova o meio após três dias e lave as células duas vezes vigorosamente com 10 mililitros de PBS para remover células não aadeentes. Adicione cinco mililitros de temperatura ambiente 0,02% trypsin-EDTA e PBS, e incubar a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por cinco minutos.Pipeta completamente as células para desprender. Observe a cultura sob um microscópio para garantir que as células tenham sido separadas e apareçam arredondadas e flutuando na mídia. Quando as células foram separadas, inativa a reação adicionando cinco mililitros do MEM alfa.Colete as células em um tubo cônico de 50 mililitros e centrífuga a 300 vezes G durante cinco minutos. Depois de descartar o supernaspe, lave com cinco mililitros de alfa MEM, e centrífuga novamente a 300 vezes G por cinco minutos. Suspenda a pelota em 10 mililitros de alfa MEM.Semente 1 milhão de células por 10 mililitros em um prato de cultura de 10 centímetros, e adicionar M-CSF. Incubar a cultura a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por três dias. Colher as células anexadas, que representam os BMMs como precursores osteoclatos após três dias, como feito anteriormente durante a geração de BMMs.Semente os BMMs a 50.000 células por 200 micro litros de MEM alfa em uma placa de 96 poços por poço. A cada poço, adicione estímulos desejados. E então adicione M-CSF para uma concentração final de 100 nanogramas por mililitro.Adicione anticorpo Anti-c-fms a cada poço. Incubar a placa a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por quatro dias, enquanto muda a mídia a cada dois dias durante quatro dias. E, em seguida, proceder com manchas e ensaios, como descrito no manuscrito.Foi avaliada a formação osteoclasta na cultura tratada M-CSF e RANKL, com anticorpo Anti-c-fms. Com 101.000 nanogramas por anticorpo anti-c-fms mililitro, observou-se uma diminuição significativa no número de osteoclatos em comparação com o controle. Considerando que, com um em cada 10 nanogramas por anticorpo anti-c-fms mililitro, não houve diminuição significativa.Em seguida, foi avaliada a formação osteoclasta na cultura tratada alfa M-CSF e TNF, com anticorpo Anti-c-fms. Com 10, 100, 1.000 nanogramas por anticorpo anti-c-fms mililitro, observou-se uma diminuição significativa no número de osteoclatos em comparação com o controle, sem diminuição significativa em um nanograma por mililitro. E a cultura M-CSF com 1, 10, 100 nanogramas por anticorpo anti-c-fms mililitro, não houve diminuição significativa no número de precursores osteoclades em comparação com o controle.No entanto, a 1.000 nanogramas por mililitro, houve uma diminuição significativa no número de precursores do osteoclato, indicando que uma concentração de até 1.000 nanogramas por mililitro é necessária para inibir significativamente a proliferação de precursores osteoclatos. Certifique-se de liberar as ligações mantendo o osso intacto, o que minimizará a chance de contaminação.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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A Novel In vivo Técnica Gene Transferência e In vitro Ensaios baseados em células para o Estudo da perda óssea em Distúrbios Osteomusculares

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