Name: Captação de novas nanopartículas revestidos de lipídeos contendo Falcarindiol por células-tronco mesenquimais humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprenda a fabricar nanopartículas revestidas de lipídeos contendo falcarindiol usando o método de injeção rápida. Este sistema de liberação de fármacos demonstra captação eficaz por células-tronco mesenquimais humanas.

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Os autores agradecer Dr. Moustapha Kassem (Hospital da Universidade de Odense, Dinamarca) para as células-tronco mesenquimais humanas. Os autores graças centro dinamarquês de Bioimaging médico para acesso de seus microscópios. Os autores graças as Carlsberg e Villum bases de apoio financeiro (C.L.A). Os autores reconhecem o apoio financeiro fornecido pelo prêmio Niels Bohr Professorship da Fundação Nacional de pesquisa dinamarquês.

1. síntese de nanopartículas solvente de rápida mudança técnica
<ol><li>Configurar o seguinte para a preparação das nanopartículas: um concentrador de amostra/aquecedor do bloco, num exsicador, um sistema de distribuição digital com uma seringa de vidro de 1 mL, um frasco de vidro de 12 mL, um agitador magnético, uma pulga magnético (15 mm x 4,5 mm, em uma forma cilíndrica com revestimento de politetrafluoroetileno [PTFE]) dentro do frasco de vidro e um evaporador rotatórios.</li>
	<li>Dispense a 2,4 mL de 250 µM falcarindiol estoque dissolvido na mistura de água de EtOH 70% em um frasco de cintilação.</li>
	<li>Evapore a fracção líquida, usando o concentrador de amostra para cerca de 4 h, para obter o falcarindiol seco.<ol>
<li>Inserir o frasco de cintilação no aquecedor do bloco; o concentrador de amostra fornece gás da amostra, usando agulhas de aço inoxidável, concentrando-se a amostra. Evaporar à temperatura ambiente; Não use calor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez seco, adicione os seguintes componentes do revestimento lipídico dentro do frasco de cintilação acima mencionados: 16,3 µ l de 31,64 mM DSPC clorofórmio solução estoque, 3,4 µ l da solução de clorofórmio 17,82 mM DSPE PEG 2000, 24 µ l de caldo de clorofórmio colesterol 25 mM solução e 6 µ l de 4mm DiI solução de clorofórmio. Limpe a seringa com clorofórmio após a adição de cada componente para evitar a contaminação cruzada. Atenção: Feche imediatamente os frascos contendo lipídeos, para que o solvente não evapore e, desse modo, modificar a concentração. Trabalho em uma coifa. Nota: As concentrações de soluções estoque de clorofórmio podem variar, dependendo do fornecedor do produto químico ou diluições feitas no laboratório.</li>
	<li>Envolva o frasco com papel alumínio para proteger DiI de luz. Deixe a amostra durante a noite no exsicador evaporar o clorofórmio.</li>
	<li>Dissolva a amostra dessecada em etanol absoluto, até um volume final de 1,2 mL, que dá as concentrações finais de DSPC, DSPE PEG 2000, colesterol e DiI de 0,43 mM, 0.05 mM, 0.5 mM e 0,02 mM, respectivamente. Esta solução representa a fase orgânica.</li>
	<li>Leve o frasco de vidro de 12 mL, preenchê-lo com 9 mL de água purificada e adicionar a pulga magnética dentro do frasco contendo 9 mL de água. Manter o frasco no agitador magnético, agitando a 500 rpm (Figura 1).</li>
	<li>Conecte a seringa de vidro de 1 mL para o sistema de distribuição e limpe-o com clorofórmio para evitar qualquer contaminação. Isto por, lentamente puxando o clorofórmio para a seringa de vidro e dispensação manualmente em um coletor de resíduos, pelo menos 10 tiems. Atenção: Isso deve ser feito sob uma coifa.</li>
	<li>Encha a seringa com etanol. Escorva substitui o velho solvente, bem como remove quaisquer bolhas de ar. Atenção: Isso deve ser feito sob uma coifa.</li>
	<li>Usando a seringa, Aspire 1 mL da fase orgânica.</li>
	<li>Insira a seringa para o frasco de vidro, até o meio da marca d'água a 9 mL e mantê-lo firme no meio do frasco (como mostrado na Figura 1).</li>
	<li>Injete a solução na velocidade selecionada da injeção (833 µ l/s) pressionando o botão de distribuição no sistema de distribuição (Figura 2). Isso gera 10 mL de 50 µM revestidos de lipídeos nanopartículas de falcarindiol em 10% etanol contendo água. Nota: Esta velocidade de injeção foi encontrada para alcançar as partículas mais finas, obtendo uma distribuição granulométrica estreita. É fundamental ter a certeza de que a seringa está no centro, estacionário e em linha reta quando a solução de distribuição.</li>
	<li>Imediatamente após a injeção, retire o frasco do agitador e transferir a amostra para um balão de fundo redondo de 50 mL (RBF).</li>
	<li>Anexar a RBF para o evaporador rotativo e evaporar 1 mL de solvente orgânico, usando o evaporador rotativo na temperatura de quarto. Evite a formação de bolhas em excesso. Nota: Este passo levará ~ 5 min.</li>
	<li>Transferi a suspensão de nanopartículas da RBF para outro frasco de vidro de 12 mL. Certifique-se de que o volume é 9 mL. Dividi a amostra em dois frascos de vidro de 12 mL (colocar 4,5 mL em cada).</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de água ultrapura para um dos frascos e 0,5 mL de 10 x fosfato salino (PBS) para o outro frasco. Retire 1 mL de cada amostra para a medição de tamanho de partícula.</li>
</ol>2. análise de tamanho de partícula utilizando a técnica DLS
Nota: Tamanho foram efectuadas medições usando um analisador de DLS que determina as distribuições de tamanho de partícula. É equipado com laser 100 mW que opera no comprimento de onda de 662.2 nm e com um detetor de fotodiodo avalanche colocado em um ângulo de 90° para o ângulo incidente. O feixe é espalhado pelas nanopartículas e detectado pelo fotodetector.
<ol><li>Ligue o instrumento DLS e regular a temperatura desejada a 20 ° C, até que se estabiliza.</li>
	<li>Definir os parâmetros do instrumento da seguinte forma: tempo de aquisição de dados = 4 s, o número de aquisições = 30, função autoatenuação = On e os prazos de autoatenuação = 0.</li>
	<li>Encher a cubeta plástica com 1 mL de suspensão de nanopartículas e iniciar a medição.</li>
	<li>Relatar o tamanho medido dependendo do solvente utilizado (água ou PBS). Nota: A medição em PBS é feita para ter uma ideia aproximada do tamanho das células em meio ao tratar as células. O tratamento com células será feito com as nanopartículas dissolvidas na água.</li>
	<li>Repita as medições 24 h após a síntese, para verificar a agregação de partículas.</li>
</ol>3. célula tratamento
<ol><li>Cresce hMSCs em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina, em uma câmara de humified a 37° C com 5% de CO2. Cuidado: Trabalho no bairro fluxo Laminar estéril para etapas 3.1, 3.2 e 3.3.</li>
	<li>Células de sementes aproximadamente 50.000 para obter uma densidade de célula de aproximadamente 30% em lamelas de #1.5 anteriormente absoluto-EtOH-esterilizado colocado em placas de 6-poços. Adicione MEM para poder ter um volume final de 3 mL em cada poço. Incube por 24 h sob as mesmas condições como na etapa 3.1. As células 24 h antes do tratamento de sementes. Nota: É fundamental que as células são semeadas pelo menos 24 h antes do tratamento de nanopartículas, para certificar-se que as células estão em uma confluência adequada.</li>
	<li>Sem retirar o meio, adicionar 3 µ l da solução de nanopartículas, para uma concentração final de falcarindiol de 5 µM. Incubar por 24 h nas mesmas condições como na etapa 3.1. Nota: A preparação das nanopartículas foi realizada no dia do tratamento celular, para evitar a agregação das partículas.</li>
	<li>Posteriormente, após 24 h de tratamento, lavar as células 2 x com PBS, corrigi-los em formol 4% durante 10 minutos à temperatura ambiente e armazená-los em PBS a 4° C por até diversos meses até fotografada. Atenção: Isso deve ser feito sob uma coifa.<ol>
<li>Alternativamente, após a fixação, um ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração nuclear pode ser executada. Por isso, após a fixação das células, permeabilize-lhes com 0,1% Triton X-100 por 30 min, lavá-los 2 x com PBS e manchá-las com 250 µ l de 300 nM DAPI por 5 minutos, protegido da luz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. microscopia
<ol><li>
Microscopia de fluorescência
	<ol>
<li>Use um microscópio de fluorescência widefield equipado com uma câmera CCD elétron-multiplicado para adquirir imagens. Use o 150 x 1,45 nd objectivo de óleo e o canal de GFP LP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopia confocal
	<ol>
<li>Adquirir imagens de microscopia confocal, usando a 63 x objetivo de óleo at 1.4, um laser de argônio (514 nm) para DiI e um laser de dois fotões (780 nm) para DAPI, para verificar a absorção das nanopartículas nas células.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Um protocolo detalhado para a fabricação de nanopartículas revestidos de lipídeos, para entrega de drogas com o simples, rápido, reprodutível e escalável injeção rápida método de deslocamento do solvente foi seguido27,28 e é apresentado neste trabalho, como aplicado a falcarindiol. Controlando a velocidade da injeção da fase orgânica em fase aquosa e usando lipídios revestimento em concentrações adequadas para revestir o núcleo falcarindiol, partícula na faixa de...

Revestidos de lipídeos nanopartículas estão vendo um aumento do interesse em relação a sua função como sistemas de entrega de drogas para terapia de câncer1. Cancros têm uma reprogramação lipid-metabólica alterada2 e uma maior necessidade de colesterol a proliferar3. Eles overexpress LDLs1 e tomar em LDLs mais do que as células normais, na medida em que a contagem de um paciente com câncer LDL pode até mesmo ir para baixo4. Captação de LDL promove agressivo fenótipos5 resultando em proliferação e invasão no câncer de mama6. Uma abundância de receptores LDL (LDLRs) é um indicador de prognóstico do potencial metastático7. Inspirado pelo LDL e sua absorção pelas células de câncer, uma nova estratégia foi chamada: fazer a droga parece alimentar do câncer8. Assim, essas nanopartículas droga entrega projetos novos8,9,10 ter sido inspirado pelo design de núcleo e lipídios-estabilizada do natural LDLs11 como um mecanismo para a entrega de drogas anticâncer para as células cancerosas. Esse passivo segmentação entrega sistema suporta o encapsulamento de, especialmente, drogas hidrofóbicas, que normalmente são dadas em forma de dosagem oral, mas fornecem somente uma pequena quantidade da droga para a corrente sanguínea, então, limitando sua eficácia prevista12. Como com o lipossoma stealth13, um revestimento de polietileno glicol (PEG) ajuda a reduzir qualquer resposta imunológica e amplia a circulação na corrente sanguínea por absorção ideal do tumor, a suposta melhor permeação e retenção (EPR) efeito 14 , 15. no entanto, além de, em alguns casos, a instabilidade na circulação e distribuição indesejável no sistema16, alguns obstáculos foram solucionados, tais como como e em que medida essas nanopartículas estão tomadas por células e o que é seu destino intracelular. É aqui que este livro aborda a absorção de nanopartículas de um determinado medicamento anticâncer hidrofóbico falcarindiol, usando confocal e epifluorescência técnicas de imagem.
O objetivo do estudo é fabricar nanopartículas revestidos de lipídeos, de falcarindiol e estudar sua penetração intracelular em hMSCs. Desse modo, potencialmente estabilizando sua administração, superando os desafios associados com a entrega e melhorar a biodisponibilidade. Assim, avaliar um novo sistema de entrega para esta droga anticâncer. Anteriormente, falcarindiol tem sido administrado por via oral através de uma falcarindiol de alta concentração purificada como um suplemento de alimentos17. No entanto, não há necessidade de uma abordagem mais estruturada entregar esta droga promissora. Portanto, nanopartículas de falcarindiol, com um fosfolipídios e colesterol, encapsulando monocamada com a droga purificada que constituem o núcleo da partícula, foram projetadas. O método de injeção rápida do solvente deslocando, como recentemente desenvolvido por Needham et al 8, é usado neste estudo para encapsular o poliacetileno falcarindiol.
O método anteriormente foi usado para a fabricação de nanopartículas de lipídios para encapsular o diagnóstico de imagens agentes18,19, bem como teste de moléculas (Trioleína)27 e drogas (orlistat, estearato niclosamide)8 de27, ,28. É uma técnica relativamente simples, quando realizadas com as moléculas de certa. Forma nanosized de partículas, no limite de sua nucleação crítico (~ 20 nm de diâmetro), de altamente insolúveis hidrofóbicos solutos dissolvidos em um solvente polar. A troca de solvente é realizada por injeção rápida da solução orgânica em um excesso de antisolvent (geralmente, uma fase aquosa em um 1:9 orgânica: relação volume aquoso)20,21.
O projeto composicional das nanopartículas dão origem a várias vantagens. Os componentes de DSPC:Chol fornecem uma monocamada muito apertada, quase impermeável, biocompatível e biodegradável. O PEG fornece uma interface estericamente estabilizador que age como um escudo de opsonização pelo sistema imunológico, diminuindo qualquer absorção pelo sistema reticuloendotelial (fígado e baço) e protegendo contra o sistema de fagócitos mononucleares, impedindo sua retenção e degradação pelo sistema imunológico e, portanto, aumentando sua circulação no sangue22de meia-hora. Isso permite que as partículas a circular até que eles extravasate em doentes locais, tais como tumores, onde o sistema vascular está com vazamento, permitindo APE-efeito dar origem a acumulação passiva das partículas. Além disso, a camada lipídica permite ter um melhor controle sobre o tamanho das nanopartículas por cineticamente aprisionando o núcleo no seu núcleo fundamental dimensão27,28. Lipídios induzem várias propriedades de superfície (incluindo peptídeo direcionamento, que ainda não estava disponível para este projeto), um núcleo de droga pura e uma baixa polidispersividade22,,27,28. O método utilizado para análise de tamanho de partícula é DLS, uma técnica que permite que os pesquisadores medir o tamanho de um grande número de partículas ao mesmo tempo. No entanto, esse método pode influenciar as medições para tamanhos maiores, se as nanopartículas não são monodispersas23. Esta questão é avaliada com o casaco de lipídios também. Mais detalhes desses projetos fundamentais e a quantificação de todas as características são dadas em outras publicações27,28.
A droga encapsulada nas nanopartículas é falcarindiol, um poliacetileno dietético encontrado em plantas da família Apiaceae. É um metabólito secundário do alifáticos C17poliacetilenos tipo que foi encontrado para exibir efeitos de promoção da saúde, incluindo a actividade anti-inflamatória, efeitos anti-bacterianos e citotoxicidade contra uma ampla gama de linhas de células de câncer. Sua alta reatividade está relacionada à sua capacidade de interagir com diferentes biomoléculas, atuando como um Agente alquilante muito reativo contra mercapto e grupos amino24. Falcarindiol tem sido mostrado anteriormente para reduzir o número de lesões neoplásicas no cólon17,25, embora os mecanismos biológicos são ainda desconhecidos. No entanto, é o pensamento que ele interage com biomoléculas tais como NF-κB, COX1, COX-2, e citocinas, inibindo seus tumor progressão e célula proliferação processos, levando a prender o ciclo celular, o retículo endoplasmático (ER) stress e apoptose 17,26 em células cancerosas. Falcarindiol é usado neste estudo como uma droga anticancerígena exemplo devido ao seu potencial anticancer e mecanismo estão sendo estudados atualmente, e porque ele mostra efeitos anticâncer promissores. A absorção celular das nanopartículas é testada em hMSCs e fotografada usando epifluorescência e microscopia confocal. Este tipo de célula foi escolhido devido a seu grande tamanho, tornando-os ideais para microscopia.

<table><tbody><tr><td>Frasco para injetáveis com gargalo de rosca de 12 mL (vidro transparente, rosca 15-425, 66 X 18,5 mm)</td><td>Microlab Aarhus A/S</td><td>ML 33154LP</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>Greiner Bio One International GmbH</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>EMD Millipore (VWR)</td><td>EM8.18760.1000</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Rathburn Chemicals Ltd.</td><td>RH1009</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Zeiss LSM510</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas espessura #1.5</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co</td><td>117650</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador</td><td>Auto-construção</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Invitrogen</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>DLS</td><td>Beckman Coulter</td><td>DelsaMAXpro 3167-DMP</td><td></td></tr><tr><td>DSPC (estoque de clorofórmio)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850365C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DSPE PEG 2000 (estoque de clorofórmio)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>880120C</td><td></td></tr><tr><td>eVol XR</td><td>SGE ciência analítica, Trajan Scientific Australia Pty Ltd.</td><td>2910200</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Olymous IX81</td><td></td><td>com TIRF manual e Andor iXon</td></tr><tr><td>EMCCD Incubator</td><td>Panasonic&nbsp;</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Flea</td><td>VWR Chemicals</td><td>15 x 4,5 mm</td><td>Forma cilíndrica com revestimento de PTFE</td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>IKA</td><td>RT-10</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Media</td><td>Gibco</td><td>32561-029</td><td></td></tr><tr><td>PBS tablets para cultura de células</td><td>VWR Chemicals</td><td>97062-732</td><td></td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>VWR Chemicals</td><td>97063-708</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fosfato salina (PBS, pH 7.4)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>Rotavapor, B&uuml; Concentrador de amostras chi Labortechnik AG</td><td>R-210</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Stuart, Companhia de Instrumentos Cole-Parmer, LLC</td><td>SBHCONC / 1</td><td></td></tr></tbody></table>

captação de novas nanopartículas revestidos de lipídeos contendo falcarindiol por células-tronco mesenquimais humanas

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanopartículas são o foco de um crescente interesse em sistemas de distribuição de drogas para terapia do câncer. Nanopartículas revestidos de lipídeos são inspiradas na estrutura e tamanho por lipoproteínas de baixa densidade (LDLs), porque as células cancerosas têm uma maior necessidade de colesterol a proliferar, e isto tem sido explorado como um mecanismo para a entrega de drogas anticâncer para câncer células. Além disso, dependendo da química de drogas, encapsulando a droga pode ser vantajoso para evitar a degradação da droga durante a circulação em vivo. Portanto, neste estudo, este projeto é usado para fabricar nanopartículas revestidos de lipídeos, da falcarindiol de drogas anticâncer, fornecendo um sistema de entrega de novo potencial de falcarindiol a fim de estabilizar a sua estrutura química contra a degradação e melhorar a sua absorção por tumores. Nanopartículas de Falcarindiol, com um monolayer fosfolipídios e colesterol, encapsulando o núcleo de droga purificada da partícula, foram projetadas. O revestimento monocamada de lipídios é composto por 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), colesterol (Chol) e 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) juntamente com a fluorescente etiqueta DiI (molares rácios de 43:50:5:2). As nanopartículas são fabricadas usando o método de injeção rápida, que é uma técnica simples e rápida para precipitar nanopartículas por bom-solvente antitroca solvente. Consiste em uma injeção rápida de uma solução de etanol contendo os componentes de nanopartículas em uma fase aquosa. O tamanho das nanopartículas fluorescentes é medido usando Difusão dinâmica da luz (DLS) 74,1 ± 6,7 nm. A absorção das nanopartículas é testada em células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) e fotografada usando fluorescência e microscopia confocal. A absorção das nanopartículas é observada em hMSCs, sugerindo que o potencial para tal um sistema de entrega de droga estável para falcarindiol.

Dois tipos diferentes de nanopartículas foram fabricados, ou seja pura falcarindiol nanopartículas e nanopartículas falcarindiol revestidos de lipídeos. Foram testadas diferentes concentrações de lipídios e colesterol. Conforme mostrado na tabela 1, nanopartículas não revestidas, formou-se em água e medido em PBS tinham um diâmetro de 71 ± 20,3 nm com um índice de polidispersividade (PDI) de 0.571. Esses parâmetros foram medidos em um analisador DLS. As nanopartículas rev...

Este artigo descreve o encapsulamento de falcarindiol em revestidos de lipídeos 74 nm nanopartículas. A absorção celular das nanopartículas por células-tronco humanas em gotículas lipídicas é monitorada por imagem fluorescente e confocal. Nanopartículas são fabricadas pelo método de injeção rápida do solvente de movimento, e seu tamanho é medido com a técnica de espalhamento de luz dinâmica.

Captação de novas nanopartículas revestidos de lipídeos contendo Falcarindiol por células-tronco mesenquimais humanas

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

A fabricação de nanopartículas revestidas de lipídios com o método de injeção rápida fornece um sistema estável de entrega de medicamentos para terapia do câncer. Esta técnica é uma técnica simples, rápida, escalável e reprodutível para fabricação de nanopartículas que encapsula drogas hidrofóbicas. Esta técnica é aplicável para a fabricação de nanopartículas diagnósticas e terapêuticas a partir de materiais hidrofóbicos que podem ser efetivamente utilizados em várias condições da doença.Esta técnica de fabricação, juntamente com dLS, pode ser usada para estudar a nucleação e o crescimento de materiais hidrofóbicos, como lipídios, proteínas e polímeros. Conhecer as propriedades químicas físicas da sua substância é fundamental antes de fabricar as nanopartículas. Além disso, certifique-se de usar as concentrações corretas de lipídios de revestimento.A demonstração visual deste método é fundamental para mostrar a simplicidade da técnica de fabricação e mostrar o sucesso da entrega da droga como nanopartículas para as células. É preciso precaução ao trabalhar com clorofórmio e formaldeído, e trabalhar sob um capô de fumaça é necessário. Para começar, dispense 2,4 mililitros de 250 micromolars de solução de estoque falcarindiol dissolvido em 70% de etanol em um frasco de cintilação.Usando um concentrador de amostra, evaporar a fração líquida por aproximadamente quatro horas para obter falcarindiol seco. Usando o concentrador de amostras, entregue gás sobre a amostra à temperatura ambiente para concentrar a amostra. Uma vez seco, adicione os componentes aqui mostrados ao frasco de cintilação em uma capa de fumaça, certificando-se de limpar a seringa com clorofórmio depois de adicionar cada componente para evitar contaminação cruzada.Em seguida, feche imediatamente os frascos contendo os lipídios para que o solvente não evapore e assim modifique a concentração. Enrole o frasco com papel alumínio para proteger a DiI da luz e deixe a amostra durante a noite no desiccator para evaporar o clorofórmio. No dia seguinte, dissolva a amostra dessecada em etanol absoluto para fazer um volume final de 1,2 mililitros.Essa solução representa a fase orgânica. Pegue um frasco de vidro de 12 mililitros e encha-o com nove mililitros de água purificada. Em seguida, adicione uma pulga magnética no frasco contendo nove mililitros de água.Coloque o frasco em um agitador magnético e mexa a 500 rpm. Em seguida, conecte uma seringa de vidro de um mililitro ao sistema de distribuição e puxe lentamente clorofórmio para dentro e para fora da seringa de vidro pelo menos 10 vezes. Distribua o clorofórmio em seu coletor de lixo cada vez.Limpar a seringa com clorofórmio ajuda a evitar qualquer contaminação. Agora forque a seringa com etanol. O escoramento substitui o solvente antigo, bem como remove quaisquer bolhas de ar.Usando a seringa, aspire um mililitro da fase orgânica e insira a seringa no frasco de vidro até o meio da marca de água de nove mililitros. Mantenha-o estável no meio do frasco e injete a solução a 833 microliters por segundo pressionando o botão de distribuição no sistema de distribuição. Isso gera 10 microlitadores de 50 nanopartículas lipídicas micromolar revestidas de falcarindiol em 10% de etanol.Esta velocidade de injeção foi encontrada para alcançar as melhores nanopartículas com distribuição estreita do tamanho das partículas. Durante a injeção, é importante ter certeza de que a agulha está inserida no centro, estável e reta. Imediatamente após a injeção, remova o frasco do agitador e transfira a amostra para um frasco fundo redondo de 50 mililitros.Ataque o frasco ao evaporador rotativo, e evapore um mililitro do solvente orgânico à temperatura ambiente. Tenha cuidado para evitar o excesso de formação de bolhas. Transfira a suspensão da nanopartícula do frasco para outro frasco de vidro de 12 mililitros.Certifique-se de que o volume é de nove mililitros e, em seguida, divida a amostra em dois frascos de vidro de 12 mililitros. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de água ultra pura em um dos frascos e 0,5 mililitro de salina tamponada de fosfato de 10X no outro frasco. Ligue o instrumento de dispersão da luz digital e coloque a temperatura desejada em 20 graus Celsius até estabilizar.Em seguida, defina os parâmetros do instrumento como mostrado aqui. Encha a cuvette de plástico com um mililitro de suspensão de nanopartículas e inicie a medição. Informe o tamanho medido dependendo do solvente utilizado.Sementes aproximadamente 50.000 células em deslizamentos de cobertura estéreis 1.5 colocados em placa de seis poços para obter uma densidade celular de aproximadamente 30%, em seguida, adicionar meio cultura a fim de ter um volume final de três mililitros em cada poço. Incubar as células por 24 horas sob condições de cultura padrão. No dia seguinte, adicione três microlitadores da solução de nanopartículas para uma concentração falcarindiol final de cinco micromolar.Em seguida, devolva as células à incubadora por 24 horas. Após 24 horas de tratamento, lave as células duas vezes com PBS e, em seguida, fixe-as em 4% de formaldeído por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a fixação, permeabilize as células com 0,1%Triton X-100 por 30 minutos.Em seguida, lave-os duas vezes com PBS, e manche-os com 250 microliters de 300 DAPI nanomolar por cinco minutos, protegidos da luz. Coloque o deslizamento da tampa em um slide usando uma gota de PBS. Vire para uma subjetiva de 150x, e transfira o slide para o estágio de um microscópio de fluorescência de campo largo equipado com uma câmera CCD multiplicada por elétrons.Células de imagem usando o canal GFP-LP. Além disso, verifique a absorção das nanopartículas nas células, tomando imagens de microscopia confocal usando um objetivo de óleo de 63x com uma abertura numérica de 1,4. Imagem DiI usando um laser de argônio a 514 nanômetros e DAPI usando um laser de dois fótons a 780 nanômetros.As nanopartículas não revestidas de falcarindiol formadas em água e medidas na PBS apresentaram alta polidispersidade, com índice de DP de 0,571. Este valor indica distribuição ampla e não uniforme de tamanhos de partículas. Em contraste, as nanopartículas revestidas lipídicas de falcarindiol fabricadas neste vídeo foram de 74,1 nanômetros com um índice de polidispersidade de 0,182, indicando uma distribuição relativamente monodisperse e uniforme de tamanhos de partículas.Como primeira observação das nanopartículas dentro das células, imagens de microscopia de epifluorescência foram adquiridas após 24 horas de tratamento. As nanopartículas foram visualizadas como pontos brancos e brilhantes, e pode-se supor que as nanopartículas estavam localizadas dentro das células ao redor do núcleo. Para verificar se as nanopartículas falcarindiais haviam entrado nas células, a microscopia confocal também foi realizada nas células.Um grande número de nanopartículas são mostradas aqui, espalhadas no citoplasma em cada célula. Estes resultados mostram que as nanopartículas agem como um sistema estável de entrega de medicamentos para falcarindiol. Ao tentar este procedimento, é importante injetar a solução na velocidade de injeção certa, mantendo a semeadura estável, no centro, para garantir a mistura adequada.Este procedimento pode ser usado para qualquer droga hidrofóbica para formular nanopartículas terapêuticas ou para agentes de imagem para formular nanopartículas diagnósticas que podem ser usadas em várias condições da doença, como o câncer. Esta técnica permitiu que mais pesquisas fossem conduzidas sobre o mecanismo pelo qual as nanopartículas são tomadas pelas células, bem como sua imagem celular viva e no estudo do efeito anticancerígeno da droga.

uptake-new-lipid-coated-nanoparticles-containing-falcarindiol-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Objetivo da apresentação é mostrar um método altamente reprodutível para gerar matriz associada implantes de células-tronco em defeitos da cartilagem, que pode ser visualizado com ressonância magnética. As células estaminais são rotulados com FDA-approved Ferumoxides, misturado com agarose, implantado em defeitos da cartilagem e fotografada com um scanner MR 7T.

Implantação de Ferumoxides identificadas células-tronco mesenquimais em defeitos da cartilagem

Nós descrevemos uma técnica para rotulagem e rastreamento de células-tronco com FDA-approved, óxido de ferro superparamagnético (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Esta técnica de imagem celular que utiliza a ressonância magnética (RM) para visualização, é facilmente acessível a longo prazo de monitoramento e diagnóstico de engraftments tronco bem ou mal sucedidas de células em pacientes.

Rotulagem células-tronco com Ferumoxytol, uma FDA-Approved nanopartículas de óxido de ferro

As propriedades imunomoduladoras de células-tronco mesenquimais humanas (MSC) aparecem cada vez mais relevante para a aplicação clínica. Usando um sistema de co-cultura de MSCs e leucócitos do sangue periférico de pré-corados com o éster succinimidilo corante fluorescente carboxifluoresceína (CFSE), descreve-se a avaliação in vitro de MSC imunomodulação em proliferação e subpopulações efectoras de leucócitos específicos.

Avaliação das propriedades imunomoduladora de mesenquimais humanas Células-Tronco (MSCs)

Este protocolo descreve uma maneira eficiente para monitorar a persistência de célula e biodistribuição do adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas (haMSCs) por fluorescência far-red rotulagem em um modelo de osteoartrite (KOA) de joelho do rato através de injeção intra-articular de (IA).

Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico

Este protocolo descreve a transiente engenharia genética de células-tronco dentárias extraídas do folículo dental humano. A estratégia de modificação não-virais aplicada pode tornar-se uma base para a melhoria dos produtos terapêuticos células-tronco.

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

Este protocolo demonstra como isolar pequenas vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs) com uma configuração simples de bancada em escala laboratorial. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores de sEVs e morfologia de hUC-MSC-sEVs isolados são caracterizados por análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente.

Um Método Simples de Filtração de Bancada para Isolar Pequenas Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Humanas

Este protocolo descreve o uso da classificação de células mesenquimais humanas ativadas por fluorescência usando o método de triagem de célula única. Especificamente, o uso de triagem unicelular pode atingir 99% de pureza das células imunofenotipadas de uma população heterogênea quando combinado com uma abordagem multiparamétrica baseada em citometria de fluxo.

Triagem unicelular de células-tronco mesenquimais imunofenotipadas de dentes decíduos esfoliados humanos

Este protocolo descreve todos os procedimentos, desde a cultura de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) e coleta de sobrenadante até a extração de vesículas extracelulares (EVs) usando ultracentrifugação.

Purificação e Caracterização de Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Tecido Adiposo Humano

O isolamento de MSCsaltasde MFGE8BAMBI , um dos três principais subgrupos que constituem UC-MSCs humanas heterogêneas, é útil para entender completamente as características e funções desse subtipo para sua futura aplicação para melhorar a eficácia clínica em doenças específicas. Aqui, apresentamos um método para classificar BAMBIaltoMFGE8alto UC-MSCs.

Isolamento de células estromais mesenquimais derivadas do cordão umbilical alto BAMBIhumanoMFGE8alto

Esse protocolo visa introduzir um método para produzir e purificar biomiméticos extracelulares derivados de células-tronco mesenquimais (MSC) para terapia gênica. A nanovesícula é confinada com bicamadas lipídicas derivadas da MSC e encapsula AAVs recombinantes que carregam o gene de interesse no lúmen. Essa nanovesícula oferece um vetor aprimorado para a entrega de genes in vivo .

Desenvolvimento de Nanovesículas Envolvidas em Membrana por Células-Tronco Mesenquimatosas para Entrega Aprimorada de Genes

Aprenda a fabricar nanopartículas revestidas de lipídeos contendo falcarindiol usando o método de injeção rápida. Este sistema de liberação de fármacos demonstra captação eficaz por células-tronco mesenquimais humanas.

Captação de novas nanopartículas revestidos de lipídeos contendo Falcarindiol por células-tronco mesenquimais humanas

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