Name: Cultivo de microalgas verdes em fotobiorreatores coluna de bolha e um ensaio para lípidos neutros (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprenda a construir um fotobiorreator de coluna de bolha para cultivar microalgas verdes e avaliar o conteúdo de lípidos neutros. Este método econômico e personalizável é ideal para pesquisas em biocombustíveis e biologia algal.

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Suporte para esta pesquisa foi fornecido pelo USDA, Instituto Nacional de alimentos e agricultura Hatch projeto ALA0HIGGINS e escritórios da Universidade de Auburn de reitor, Vice-Presidente de pesquisa e o Samuel Ginn faculdade de engenharia. Suporte também foi fornecido pelo NSF conceder CBET-1438211.

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<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycoremediation+of+dairy+and+winery+wastewater+using+Diplosphaera+sp.+MM1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Phycology%22%5BJournal%5D)">Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1.</a> Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).</li>
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<li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil+accumulation+mechanisms+of+the+oleaginous+microalga+Chlorella+protothecoides+revealed+through+its+genome%2C+transcriptomes%2C+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes.</a> BMC Genomics. 15, (2014).</li>
<li>Burch, A. R., Franz, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+nitrogen+limitation+and+hydrogen+peroxide+treatment+enhances+neutral+lipid+accumulation+in+the+marine+diatom+Phaeodactylum+tricornutum%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum.</a> Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).</li>
<li>Brennan, L., Owende, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofuels+from+microalgae--A+review+of+technologies+for+production%2C+processing%2C+and+extractions+of+biofuels+and+co-products%5BTitle%5D)+AND+%22Renewable+Sustainable+Energy+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofuels from microalgae--A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products.</a> Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).</li>
<li>Branyikova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microalgae+-+Novel+highly+efficient+starch+producers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microalgae - Novel highly efficient starch producers.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).</li>
<li>Chalima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+Volatile+Fatty+Acids+from+Microalgae+for+the+Production+of+High+Added+Value+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Fermentation%22%5BJournal%5D)">Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds.</a> Fermentation. 3 (4), (2017).</li>
<li>Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocess+engineering+of+microalgae+to+produce+a+variety+of+consumer+products%5BTitle%5D)+AND+%22Renewable+and+Sustainable+Energy+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+method+for+genetic+transformation+of+the+green+alga+Chlorella+ellipsoidea%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea.</a> Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutate+Chlorella+sp.+by+nuclear+irradiation+to+fix+high+concentrations+of+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2.</a> Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).</li>
<li>Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techno-economic+analysis+of+autotrophic+microalgae+for+fuel+production%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Energy%22%5BJournal%5D)">Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production.</a> Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).</li>
<li>Sales, C. M., Au, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Scale+in+a+Photosynthetic+Reactor+System+for+Algal+Remediation+of+Wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55256(2017).</li>
<li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+symbiosis+for+enhanced+algal+growth%2C+biofuel+production%2C+and+wastewater+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research%22%5BJournal%5D)">Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment.</a> Algal Research. 17, 308-315 (2016).</li>
<li>Higgins, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal-bacterial+synergy+in+treatment+of+winery+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clean+Water%22%5BJournal%5D)">Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater.</a> Nature Clean Water. 1 (6), (2017).</li>
<li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+thiamine+metabolites+and+spent+medium+from+Chlorella+sorokiniana+on+metabolism+in+the+green+algae+Auxenochlorella+prototheciodes%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes.</a> Algal Research. 33, 197-208 (2018).</li>
<li>Lépinay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+insight+on+interactions+between+bacteria+and+the+marine+diatom+Haslea+ostrearia%3A+Algal+growth+and+metabolomic+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research%22%5BJournal%5D)">First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting.</a> Algal Research. 31, 395-405 (2018).</li>
<li>Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+three+microalgae+strains+and+nutrient+removal+from+an+agro-zootechnical+digestate%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate.</a> Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).</li>
<li>Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azospirillum+brasilense+Increases+CO2+Fixation+on+Microalgae+Scenedesmus+obliquus%2C+Chlorella+vulgaris%2C+and+Chlamydomonas+reinhardtii+Cultured+on+High+CO2+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations.</a> Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).</li>
<li>Higgins, B., VanderGheynst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Escherichia+coli+on+mixotrophic+growth+of+Chlorella+minutissima+and+production+of+biofuel+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors.</a> PLoS One. 9 (5), e96807(2014).</li>
<li>Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+assay+for+quantitation+of+neutral+lipids+in+extracts+from+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae.</a> Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).</li>
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<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informatics+for+improved+algal+taxonomic+classification+and+research%3A+A+case+study+of+UTEX+2341%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research%22%5BJournal%5D)">Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341.</a> Algal Research. 12, 545-549 (2015).</li>
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<li>de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -P., Bashan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorella+sorokiniana+UTEX+2805%2C+a+heat+and+intense%2C+sunlight-tolerant+microalga+with+potential+for+removing+ammonium+from+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater.</a> Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A consideração mais importante quando o cultivo de algas é uma compreensão das necessidades específicas do organismo ou grupo de organismos. As algas, sistema de cultivo descrito aqui pode ser usado para a cultura de uma grande variedade de algas, mas os específicos fatores abióticos (temperatura, mídia, pH, intensidade de luz, nível de CO2 , a taxa de aeração) precisam ser ajustado às necessidades do organismo. Observe os parâmetros descritos aqui foram usados para o cultivo de Chlorella e Auxeno...

O aplicativo de microalgas em engenharia e biotecnologia tem atraído grande interesse nos últimos anos. Microalgas estão sendo estudados para uso em águas residuais tratamento1,2,3,4, biocombustível produção5,6,7,8e o produção de nutracêuticos e outros produtos de alto valor9,10. As algas são também sendo geneticamente modificadas em taxas maiores em um esforço para melhorar a sua aptidão para específicas aplicações engenharia11,12. Consequentemente, há grande interesse na experimentação com organismos relevantes industrialmente em ambientes controlados. A finalidade desse método é comunicar uma abordagem eficaz para cultura de microalgas em um ambiente controlado de laboratório e para medir o crescimento e o conteúdo de lipídios neutros de que algas. Melhorar o crescimento conteúdo de lipídios neutros de microalgas e taxas foram identificados como dois principais gargalos em direção a comercialização de biocombustíveis de algas13.
Uma ampla gama de abordagens tem sido usado para algas cultura para fins experimentais. Em geral, estas abordagens podem ser divididas entre cultivo ao ar livre em grande escala e cultivo indoor em pequena escala. Cultivo ao ar livre em fotobiorreatores e lagoas abertas é apropriado para a experimentação vista ampliação de processos que já tenham sido comprovados em escala de laboratório (por exemplo, para testar a aumentar de uma nova linhagem de alta-lipídios das algas)14. No entanto, cultivo indoor de pequena escala é apropriado durante o desenvolvimento de cepas de algas novos ou melhorados ou realizando experiências visa compreender os mecanismos biológicos. Nestes últimos casos, um alto grau de controle experimental é necessário para destrinchar mudanças sutis no comportamento biológico. Para esse fim, axénica culturas são muitas vezes necessárias para minimizar os fatores bióticos complexos associados com outros organismos (por exemplo, bactérias, outras algas) que inevitavelmente crescem em sistemas de grande escala ao ar livre. Mesmo quando estuda as interações entre as algas e outros organismos, encontramos que o uso das condições experimentais altamente controlado é útil aquando da análise molecular intercâmbio entre organismos15,16,17.
Dentro da categoria de cultivo de algas indoor em pequena escala, uma variedade de abordagens têm sido utilizados. Talvez a abordagem mais comum é a crescer algas em Erlenmeyers numa mesa de abanador sob uma luz banco18,19. Troca de oxigênio e CO2 ocorre por difusão passiva através de um plug de espuma no topo do balão. Alguns pesquisadores têm melhorado este set-up através de aeração ativa dos frascos20. Outra abordagem é a cultivar algas em garrafas, mixadas por barra de agitação e aeração ativa. Apesar de sua simplicidade, achamos que o uso de frascos e garrafas, muitas vezes, leva a resultados inconsistentes entre repetições biológicas. Presumivelmente devido aos efeitos de posição - diferentes posições recebem quantidades diferentes de luz, que também afetam as temperaturas internas do reator. Rotação diária dos reactores para novas posições pode ajudar, mas não é aliviar o problema porque determinados estágios de crescimento de algas (por exemplo, cedo exponencial) são mais sensíveis aos efeitos posicionais que outros (por exemplo, fase de registro).
No lado oposto do espectro da sofisticação tecnológica são totalmente controlado comercial fotobiorreatores. Estes sistemas de continuamente monitorar e ajustar as condições no reator para otimizar o crescimento de algas. Eles têm iluminação programável, controle de temperatura em tempo real e controle do pH. Infelizmente, eles são caros e normalmente custam milhares de dólares por reator. Mais revistas científicas e de engenharia exigem replicação biológica dos resultados, exigindo a compra de vários biorreatores. Apresentamos aqui um sistema de reator de coluna de bolhas que o fosso entre o simples (balão) e sofisticada (totalmente controlado bioreator) aproxima-se para o cultivo de algas de laboratório-escala de pontes. Colunas de bolha usam levantando bolhas de gás para facilitar a troca gasosa e misturar o reator. Essa abordagem fornece algum grau de controle sobre a iluminação e a temperatura, mas fá-lo de uma forma que é rentável. Além disso, encontramos este sistema produz resultados altamente consistentes entre réplicas biológicas, reduzindo o número necessário de repetições biológicos necessários para obter resultados estatisticamente significativos quando comparado com a abordagem de frasco ou garrafa. Também usamos este sistema para cultivar com sucesso as misturas de algas e bactérias21. Além do cultivo de algas, descrevem um procedimento para medir o teor de lipídios neutros nas algas cultivadas. O último método tem sido publicado em outro lugar22, mas incluímos aqui o procedimento para fornecer instruções passo a passo de como empregá-lo com sucesso.

<table><tbody><tr><td>Suprimentos para configuração de fotobiorreator airlift</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L Garrafas Pyrex</td><td>Corning</td><td>16157-191</td><td>Para reatores de garrafas, umidificadores</td></tr><tr><td>1/2" braçadeira de mangueira</td><td>Home Depot</td><td>UC953A</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>1/4" fêmea luer para farpa</td><td>Nordson biomedical</td><td>Nordson FTLL360-6005</td><td>1/4" ID, PP</td></tr><tr><td>Tubulação de PVC autoclavável de 1/4" ID, 3/8" OD</td><td>Thermo-Nalgene</td><td>63013-244</td><td>50'1</td></tr><tr><td>/4" em O-rings</td><td>Grainger</td><td>1REC5</td><td>#010 Anel de Vedação de Silicone Duro Médio, 0.239" I.D., 0.379"O.D.</td></tr><tr><td>Luer fêmea de 1/8" para farpa</td><td>Nordson biomedical</td><td>FTLL230-6005</td><td></td></tr><tr><td>1/8" ID, tubulação de PVC autoclavável de 1/4" OD</td><td>Thermo-Nalgene</td><td>63013-608</td><td>250'1</td></tr><tr><td>/8" luer giratório macho para farpa</td><td>Nordson biomedical</td><td>MLRL013-6005</td><td></td></tr><tr><td>1/8" farpa multiportas</td><td>Nordson biomedical</td><td>4PLL230-6005</td><td>1/8" farpa</td></tr> <tr>multiportas<td>1/8" NPT para barb</td><td>Nordson biomedical</td><td>18230-6005</td><td>1/8" 200 series barb</td></tr><tr><td>1/8" montagem em painel luer</td><td>Nordson biomedical</td><td>Nordson MLRLB230-6005</td><td>1/8", PP</td></tr><tr><td>10 galão tanque de peixes</td><td>Walmart</td><td>802262</td><td>Pode conter até 8 biorreatores dependendo do layout</td></tr><tr><td>Medidor de fluxo de 100-1000 ccm</td><td>Dwyer</td><td>RMA-13-SSV</td><td>Para reatores de garrafa</td></tr><tr><td>2 pés banco de luz fluorescente</td><td>Agrobrite</td><td>FLT24 T5</td><td></td></tr><tr><td>medidor de vazão de 200-2500 ccm</td><td>Dwyer</td><td>RMA-14-SSV</td><td>Para regulação do ar a montante do umidificador</td></tr><tr><td>garrafas de pirex de 250 mL</td><td>Corning</td><td>16157-136</td><td>Para mistura de gás após umidificador</td></tr><tr><td>medidor de vazão de 50-500 ccm</td><td>Dwyer</td><td>RMA-12-SSV</td><td>Para reatores de tubo de hibridização</td></tr><tr><td>medidor de vazão de 5-50 ccm</td><td>Dwyer</td><td>RMA-151-SSV</td><td>Para controle de vazão de CO2</td></tr><tr><td>Filtros de ar 0,2 &micro; m</td><td>Whatman/ Fisher</td><td>09-745-1A</td><td>Polyvent, 28 mm, 0.2 &micro; m, PTFE, pacote de 50</td></tr><tr><td>Válvulas de retenção</td><td>VWR</td><td>89094-714</td><td></td></tr><tr><td>Tampas Corning para garrafas de pirex</td><td>VWR</td><td>89000-233</td><td>10 tampas GL45</td></tr><tr><td>Tampa luer fêmea</td><td>Nordson biomedical</td><td>Nordson FTLLP-6005</td> Tubos de hibridização <td>PP estáveis fêmea</td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>32645-030</td><td>35x300 mm, pacote de 2</td></tr><tr><td>temporizadores de luz</td><td>Walmart</td><td>556393626</td><td></td></tr><tr><td>Contraporcas</td><td>Nordson biomedical</td><td>Nordson LNS-3</td><td>1/4", nylon vermelho</td></tr><tr><td>Agitador magnético de baixo perfil</td><td>VWR</td><td>10153-690</td><td>Agitador magnético de baixo perfil</td></tr><tr><td>Tampa de extremidade luer macho</td><td>Nordson biomedical Nordson</td><td>LP4-6005</td><td>Plugue macho PP</td></tr><tr><td>Anel de bloqueio luer giratório</td><td>Nordson biomedical</td><td>Nordson FSLLR-6005</td><td></td></tr><tr><td>Barras de agitação - VWR longo</td><td></td><td>58949-040</td><td>38,1 mm, para reatores de garrafas</td></tr><tr><td>Barras de agitação - médio</td><td>VWR</td><td>58949-034</td><td>25 mm, para tubos de hiridização</td></tr><tr><td>Suprimentos e reagentes para cultura de algas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 &micro; m filtros</td><td>VWR</td><td>28145-491</td><td>13 mm, PTFE, para filtrar meios usados de amostras de culturas diárias</td></tr><tr><td>Seringas de 1 mL</td><td>Air-tite</td><td>89215-216</td><td>Para filtrar meios usados de amostras de culturas diárias</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>Pipetas serológicas estéreis (ou equivalente)</td></tr><tr><td>10 mL Greiner</td><td>Bio-One</td><td>82050-482</td><td>Estéril (ou equivalente)</td></tr><tr><td>100 mm placas</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>Placas de Petri empilháveis de 100x15 mm, tubos estéreis</td></tr><tr>de<td>15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-276</td><td>Estéril (ou equivalente), polipropileno</td></tr><tr><td>2 mL Ponteiras de pipeta serológicas</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82051-584</td><td>Estéril (ou equivalente)</td></tr><tr><td>Tubos de 2 mL</td><td>VWR</td><td>87003-298</td><td>Estéril (ou equivalente)</td></tr><tr><td>Tubos de 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-348</td><td>Microplaca de polipropileno estéril (ou equivalente)</td></tr><tr><td>de 96 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89089-578</td><td>Poliestireno com tampa, fundo plano</td></tr><tr><td>Alças inocculantes</td><td>VWR</td><td>80094-478</td><td>Estéril (ou equivalente)</td></tr><tr><td>Tanque e regulador de dióxido de carbono líquido</td><td>Airgas</td><td>CD-50</td><td></td></tr><tr><td>Suprimentos e reagentes para extração de lipídios e ensaio de lipídios neutros</ tubos de contas strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL</td><td>VWR</td><td>10158-556</td><td>Tubo de polipropileno com tampa</td></tr><tr><td>Microplacas de 96 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-774</td><td>Polipropileno, fundo plano</td></tr><tr><td>Alvejante</td><td>Walmart</td><td>550646751</td><td>Use apenas alvejante regular, não alvejante de limpeza</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>BDH</td><td>BDH1109-4LG</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>BDH</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>BDH</td><td>BDH1133-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>BDH</td><td>BDH20864.400</td><td></td></tr><tr><td>Vermelho do Nilo</td><td>VWR</td><td>TCN0659-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta Pasteur</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>BDH</td><td>BDH9286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Óleo vegetal</td><td>Walmart</td><td>9276383</td><td>Qualquer óleo vegetal deve funcionar desde que seja fresco</td></tr><tr><td>Zircônia / esferas de sílica (0,5 mm de diâmetro)</td> <td>Produtos Biospec</td><td>11079105z</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>Mettler-Toledo</td><td>XS205DU</td><td>Capaz de pelo menos 4 decimais de precisão</td></tr><tr><td>Homogeneizador de contas</td><td>Omni</td><td>19-040E</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de bancada</td><td>Thermo</td><td>Heraeus Fresco 21 com 24x2</td><td>Incluindo rotor capaz de manusear tubos de 1,5 e 2 mL</td></tr><tr><td>Aquecedor de bloco seco</td><td>VWR</td><td>75838-282</td><td>Incluindo bloco seco para um secador de microplacas</td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Labconco</td><td>7670520</td><td>2,5L Sistema de liofilização</td></tr><tr><td>grande Thermo</td><td></td><td>Heraeus Megafuge 16R Tissue</td><td>Incluindo rotores capazes de lidar com garrafas de 400 mL, tubos de 50 mL e tubos de 15 mL Leitor</td></tr><tr>de<td>microplacas</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>SpectraMax M2</td><td>Capaz de ler absorbância e fluorescência</td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivo de microalgas verdes em fotobiorreatores coluna de bolha e um ensaio para lípidos neutros

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Há grande interesse no estudo das microalgas para aplicações de engenharia, tais como a produção de biocombustíveis, produtos de alto valor e para o tratamento de resíduos. Como a maioria dos novos esforços de pesquisa começam em escala de laboratório, há uma necessidade de métodos de baixo custo para cultivo de microalgas de forma reproduzível. Aqui, nós nos comunicamos uma abordagem eficaz para cultura de microalgas em fotobiorreatores escala de laboratório e para medir o crescimento e o conteúdo de lipídios neutros de que algas. Também estão incluídas para instruções sobre como configurar o sistema de photobioreactor. Embora os organismos de exemplo são espécie de Chlorella e Auxenochlorella, este sistema pode ser adaptado para cultivar uma grande variedade de microalgas, incluindo co culturas de algas com espécies não-algas. Culturas-mãe primeiro são cultivadas em garrafas para produzir inóculo para o sistema de photobioreactor. Inóculo de algas é concentrado e transferido para fotobiorreatores para cultivo em modo de lote. As amostras são coletadas diariamente para as leituras da densidade óptica. No final da cultura lote, as células são colhidas por centrifugação, lavada e congelam secas para obter uma concentração final de peso seco. A concentração final de peso seco é usada para criar uma correlação entre a densidade óptica e a concentração de peso seco. Um método de Folch modificado subsequentemente é usado para extrair lipídios totais a partir da biomassa liofilizada e o extrato é analisado por seu conteúdo de lipídio neutro usando um ensaio de microplacas. Este ensaio foi publicado anteriormente, mas as etapas do protocolo foram incluídas aqui para destacar os passos críticos no procedimento onde frequentemente ocorrem erros. O sistema de biorreator descrito aqui preenche um nicho entre balão simples cultivo e biorreatores comerciais totalmente controlado. Mesmo com apenas 3-4 biológico repetições por tratamento, nossa abordagem para cultivo de algas leva a desvios-padrão apertados nos ensaios crescimento e lipídios.

Este procedimento resulta em um curso de tempo dos dados de densidade óptica das algas em OD 550 nm (Figura 4A). A densidade óptica e peso seco concentração de dados podem ser correlacionados (Figura 4B). Isso é feito calculando a concentração de algas de peso seco final após a etapa de liofilização. Em seguida, a densidade óptica da diluição serial cultura (realizada no último dia de amostragem) e as concentrações do peso seco r...

Aqui, apresentamos um protocolo para construir laboratório-escala bolha coluna fotobiorreatores e usá-los para a cultura de microalgas. Ele também fornece um método para a determinação da taxa de crescimento da cultura e do conteúdo de lipídios neutros.

Cultivo de microalgas verdes em fotobiorreatores coluna de bolha e um ensaio para lípidos neutros

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Este protocolo fornece instruções para a construção e uso de um sistema fotobioreactor da Coluna bolha para cultivar microalgas, e deve ser de interesse para qualquer pessoa que estude biocombustíveis de algel, tratamento de águas residuais ou biologia algel. Encontramos o sistema de reator spire para produzir resultados altamente respeitáveis. O sistema de reator também é personalizável para um amplo alcance de algas e custa muito menos do que muitas ofertas comerciais.Demonstrando o procedimento será Qichen Wang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar a configuração dos Fotobioreatores da Coluna bolha, construa um conjunto de tampas ventiladas a partir das tampas plásticas das garrafas de vidro de um litro e tubos de hibridização, conforme descrito no protocolo de texto. Deslize um anel O de 1/4 polegada sobre as marcas de um encaixe de isca de 1/8 polegada e deslize isso para o orifício de 1/4 polegada perfurado na tampa.Deslize uma segunda polegada de 1/4 sobre os fios para que a tampa seja sanduíche entre os dois anéis O. Em seguida, coloque uma porca de bloqueio nos fios e aperte-a para fixar a isca de montagem do painel no lugar. Agora encaixe para travar anéis na isca masculina exposta, projetando-se a partir da tampa.Repita este procedimento para cada orifício na tampa. Para tampas que serão usadas na Coluna bolha e reatores de garrafas, conecte isca feminina de 1/8 polegada a encaixes de farpas a peças de 1/2 polegada de tubos de PVC de 1/8 polegadas. Anexe-os a cada um dos encaixes de isca masculino expostos na tampa.Conecte uma válvula de setenção à extremidade livre de uma das peças de 1/8 polegadas. Em seguida, conecte uma isca masculina ao encaixe de barb ao segundo pedaço de tubo de 1/8 polegada projetando-se da tampa. Clique no anel de bloqueio rotativo no lugar e aperte um filtro de ar de 0,2 mícria para isso.Montagem compleat do sistema de entrega de ar, tanques de peixe, placas de agitação e luzes como descried-lo o protocolo de texto. Concentre o estoque de microalgas assentado removendo o supernacante usando uma bomba de vácuo. Deixe menos de 100 mililitros de meio em cada garrafa, mas evite remover algas assentadas.Suspenda e transfira o chorume de algas para tubos de centrífugas de 50 mililitros. Centrifugar 1.000 vezes G por cinco minutos para concentrar ainda mais as algas. No gabinete de biossegurança, remova supernêmes suficientes para alcançar um volume total de aproximadamente 80 mililitros de concentrados de algas para 12 fotobioreatores.Evite aspirar a pelota. Transfira o concentrado de algas para um recipiente estéril. Agora, adicione seis mililitros de chorume de algas em cada fotobioreator com uma pipeta sorológica de 10 mililitros estéril.Gire os bioreatores para misturar algas no meio. Desenhe uma amostra de dois mililitros de cada bioreator usando uma pipeta sorológica e transfira para um tubo de dois mililitros. Colete uma amostra de dois mililitros a cada 24 horas para monitorar o progresso da cultura.Verifique a amostra para ph usando tiras de teste e ajuste o reator conforme necessário. Aperte as tampas do bioreator e coloque todos os bioreatores no banho de água do aquário. Ajuste a aeração, o dióxido de carbono e a iluminação aos níveis apropriados para a espécie.Gire a posição bioreaatora a cada dia após a amostragem. Aplique 200 microliters de cada amostra de cultura em triplicado a poços de uma microplacão de 96 poços. Em seguida, meça a densidade óptica em 550 nanômetros e 680 nanômetros.Meça um volume fixo de cultura de algas de cada bioreator com um cilindro de pós-graduação e transfira em garrafas centrífugas. Centrifugar a cultura 4.696 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernatent aspirando-o cuidadosamente.Transfira as pelotas para tubos de 50 mililitros rotulados. Enxágüe as garrafas centrífugas com água destilada e transfira o conteúdo para os tubos de 50 mililitros. Certifique-se de que o volume total não exceda 45 mililitros.Depois de lavar as pelotas de algas, conforme descrito no protocolo de texto, descarte o supernatent. Em seguida, adicione 7,5 mililitros de água destilada a cada tubo de 50 mililitros. Agora, vórtice os tubos de 50 mililitros e transferir as algas para tubos pré-pesados de 15 mililitros.Enxágüe os tubos de 50 mililitros com água destilada adicional e transfira o líquido para os tubos de 15 mililitros mantendo o volume total nesses tubos para menos de 12 mililitros. Depois de centrifugar os tubos de 15 mililitros e descartar o supernacante como antes, congele os tubos com pelotas a menos 80 graus Celsius por pelo menos 30 minutos em preparação para a secagem congelante. Adicione 1,5 mililitros de solvente folch a cada tubo de dois mililitros contendo 20 miligramas de algas secas congeladas.Despeje aproximadamente 0,5 mililitros de contas de sílica de zircônia em cada tubo até que o nível líquido atinja dois mililitros. Homogeneize as amostras de algas em um moinho de contas por 20 segundos a uma velocidade de 6,5 metros por segundo. Transfira os tubos para gelos por 30 segundos para esfriar as amostras.Em seguida, repita mais cinco vezes para extrair totalmente os lipídios. Filtre o homogeneizar através de uma seringa de cinco mililitros contendo um disco de malha de aço inoxidável para escoar as contas, coletando filtrado em um tubo de 15 mililitros. Lave as contas com 1,5 mililitros de solvente folch, empurrando o líquido através da seringa conforme necessário.Repita esta lavagem mais 2 vezes e colete todos os filtrados no tubo de 15 mililitros, produzindo um volume final de aproximadamente seis mililitros. Adicione 1,2 mililitros de solução de cloreto de sódio de 0,9% ao extrato de folch no tubo de 15 mililitros e vórtice para misturar bem. Centrifugar os tubos de 15 mililitros a 6.000 vezes G durante cinco minutos.Registre o volume de fase do clorofórmio inferior para o mililitro mais próximo usando linhas na lateral do tubo de 15 mililitros. Em seguida, transfira a fase inferior para um vile de vidro usando uma pipeta de pastagem de vidro. Para realizar o ensaio lipídado neutro, diluir os extratos lipídides e o óleo vegetal padrão três vezes com metanol.Para cada diluído, a amostra adiciona 80 microliters a uma microplacão de polipropileno de 96 poços em quadruplicato. Para o solvente em branco, aplique 80 microliters de solvente de folch em quadruplicato. Para as normas, adicione 10, 30, 60, 90 e 120 microliters do padrão de óleo vegetal diluído também em quadruplicato.Coloque a microplacão no capô da fumaça em um aquecedor de bloco seco pré-aquecido a 55 graus Celsius por 20 a 30 minutos até que todo solvente tenha evaporado. Remova a microplacão do bloco de aquecimento e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Em seguida, adicione 30 microliters de álcool isopropílico a cada poço e misture por pipetação para cima e para baixo.Certifique-se de que todos os canais de pipeta estão misturando a solução e reutilizando os lipídios, produzindo um líquido verde homogêneo. Agora, adicione 200 microliters de um micrograma por mililitro uma solução vermelha do nilo para cada poço, e encosto-o para cima e para baixo 10 vezes para misturar. Após uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, adicione 20 microliters de 50% de solução de alvejante para cada poço, e encose-o cinco vezes para misturar bem.Deixe a placa para incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Após 30 minutos, leia a florescence nas amostras a cada cinco a 10 minutos a 530 nanômetros, 575 nanômetros de emissão, com cortes automáticos definidos para 570 nanômetros até que o sinal das amostras de algas estabilize. Este procedimento produz um curso de tempo de dados de densidade óptica algel em OD 550 nanômetros.Culturas de controle foram cultivadas em meio NH4 fresco. Tratamento um, é co-culturas auxenochlorella protothecoides e azospirillum brasiliense cultivados em meio NH4 inato fresco. Tratamento dois, é um azinic A.Protothecoides cultivado em nh4 médio inato suplementado com 50 miligramas por mililitro IAA, que inibiu completamente o crescimento de algas.Tratamento três, é azinic A.Protothecoides, cultivado em meio gasto a partir de A.Brasilienes. As curvas de crescimento mostram que culturas de protothecoides auxenochlorella entram em crescimento logarítmico tardio às 120 horas. Aqui são mostradas curvas de corelation entre a densidade óptica em 550 nanômetros e a concentração final de peso seco, usando um ajuste polinomial de segunda ordem.Finalmente, a coloração pode ser aplicada aos dados de densidade óptica do curso de tempo para obter uma curva de crescimento de peso seco. Os mesmos tratamentos são usados aqui, exceto que a cloroa sorokiniana é cultivada em vez de prototecoides auxenochlorella. Por cento lipídio neutro de peso seco obtido no ensaio lipídado neutro correlaciona-se bem com o teor de glicerol triose em uma placa de cromatografia de camada fina correspondente.Ao contrário dos A.Protothecoides, o tratamento iaa não inibiu o crescimento da C.Sorkiniana. Após a extração lipídica das algas, a palete celular restante pode ser analisada para seu conteúdo de amido e parede celular, fornecendo uma imagem mais detalhada dos produtos de armazenamento de energia dentro da célula. Os métodos aqui descritos permitiram novas descobertas no campo dos biocombustíveis algel e do tratamento de águas residuais.Especificamente, este sistema tem sido usado para entender melhor como as bactérias influenciam o crescimento de algel.

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Um método para a determinação do teor de ácidos gordos e composição de microalgas baseado em ruptura mecânica da célula, a extracção de lípidos à base de solvente, a transesterificação, e quantificação e identificação de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa é descrito. Uma norma interna tripentadecanoin é usado para compensar as possíveis perdas durante a extração e transesterificação incompleta.

Análise do conteúdo de ácidos graxos e composição em Microalgas

De gases de combustão das usinas é um barato CO 2 fonte para o crescimento de algas. Nós construímos "gás de combustão para cultivo de algas" protótipo sistemas e descreveu como para ampliar o processo de cultivo de algas. Demonstrámos a utilização de um modelo bio-reacção de transferência de massa para simular e conceber o funcionamento óptimo do gás de combustão para o crescimento de Chlorella sp. em algas foto-biorreatores.

Otimizar Configurações de gases de combustão para promover o crescimento de microalgas em fotobiorreatores via simulações de computador

Um protocolo simples para determinar o teor de lípidos neutros de células de algas com um procedimento de coloração com Vermelho do Nilo é descrito. Esta técnica de poupança de tempo, oferece uma alternativa aos protocolos de quantificação de lípidos tradicionais à base gravimétrica. Ele foi projetado para a aplicação específica do desempenho do monitoramento de bioprocessos.

Um simples e rápido protocolo para medir lipídios neutros em algas células usando fluorescência

A integração do cultivo de microalgas com gás de combustão industrial acabará por introduzir metais pesados e outros compostos inorgânicos no meio de crescimento. Este estudo apresenta um procedimento utilizado para determinar o destino final e o impacto de metais pesados e contaminantes inorgânicos no crescimento de Nannochloropsis salina cultivada em fotobiorreatores.

Quantificação de Metais Pesados ​​e outros contaminantes inorgânicos sobre a produtividade de Microalgas

Este artigo descreve o processo de montagem e operação de um biorreator fotossintético de bench-scale que pode ser usado, em conjunto com outros métodos, para estimar os parâmetros de crescimento cinético pertinentes. Este sistema monitora continuamente o pH, a luz e a temperatura usando sensores, uma unidade de aquisição e controle de dados e software de aquisição de dados de código aberto.

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O cultivo axenic da bancada-escala facilita a caracterização microalgal e a optimização da produtividade antes da escala subseqüente do processo-acima. Os fotobiorreatores fornecem o controle necessário para experimentos microais confiáveis e reprodutíveis e podem ser adaptados para cultivar microalgas com segurança com os gases corrosivos (CO2,SO2,NO2)das emissões de combustão municipal ou industrial.

Cultivo de microalgas e quantificação de biomassa em um fotobiorreator em escala de banco com gases corrosivos de flue

Um protocolo é descrito para utilizar o dióxido de carbono no gás de usina de gás natural para cultivar microalgas em lagoas abertas de pista. A injeção de gás de flue é controlada com um sensor de pH, e o crescimento das microalgas é monitorado com medições em tempo real da densidade óptica.

Acoplamento da captura de carbono de uma usina com lagoas abertas semi-automatizadas para cultivo de microalgas

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A poluição do ar impacta a qualidade de vida de todos os organismos. Aqui, descrevemos o uso da biotecnologia de microalgas para o tratamento de biogás (remoção simultânea de dióxido de carbono e sulfeto de hidrogênio) e a produção de biometano através de lagoas de algas semi-industriais abertas de alta taxa e subsequente análise da eficiência do tratamento, pH, oxigênio dissolvido e crescimento de microalgas.

Purificação de Biogás através do Uso de um Sistema Microalga-Bacteriano em Lagoas Semi-Industriais de Algas de Alta Taxa

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Avaliação do Efeito dos Fatores de Crescimento na Produção de Clorofilas a e b a partir de Microalgas

Aprenda a construir um fotobiorreator de coluna de bolha para cultivar microalgas verdes e avaliar o conteúdo de lípidos neutros. Este método econômico e personalizável é ideal para pesquisas em biocombustíveis e biologia algal.

Cultivo de microalgas verdes em fotobiorreatores coluna de bolha e um ensaio para lípidos neutros

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