Indução e pontuação da doença do enxerto versus hospedeiro em modelo murino Xenogeneico e quantificação de células T humanas em tecidos de camundongo utilizando PCR digital

Este protocolo descreve como induzir a doença xenoenxerto versus hospedeiro, ou xenoGVHD, e como cegar e padronizar a pontuação clínica para garantir resultados consistentes. O modelo xenoGVHD fornece um método in vivo para testar terapias imunossupressores contra células humanas e não murinas T, melhorando a tradução desses estudos para a clínica. Demonstrando o procedimento será Amara Seng, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.

Um dia antes da injeção, coloque a scid gama diabética não obesa de oito a 12 semanas de idade, ou NSG, camundongos em uma gaiola de torta esterilizada, e irradie os camundongos em uma fonte de césio-137 com uma dose total de 150 centigrays, com uma rotação lenta para garantir uma irradiação uniforme. Em seguida, coloque os ratos em gaiolas limpas em um armário de biossegurança estéril durante a noite. Na manhã seguinte, coletar sangue humano saudável suficiente para isolar 1,1 vezes 10 para as sete células mononucleares de sangue periféricos, ou PBMCs, por rato, e diluir o sangue heparinizado em um volume igual de 2% de soro bovino fetal, ou FBS, em PBS.

Sobreponha cuidadosamente até 25 mililitros do sangue diluído em 15 mililitros de gradiente de densidade de separação de linfócitos em um tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação de gradiente de densidade. No final da separação, colde o PBMC na interface, e lave as células em 10 mililitros de PBS em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Aspire o supernatante, e aperte o tubo para soltar a pelota.

Resuspense os PBMCs em 10 mililitros de PBS fresco para outra centrifugação, seguido de resuspensão em cinco mililitros de PBS fresco para contar. Em seguida, colete as células com uma centrifugação final, e resuspenque a pelota em uma vez 10 para os oito PBMCs por mililitro de concentração de PBS. Para a entrega retro-orbital do PBMC humano isolado no olho do rato, carregue uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 28 com 100 microliters de células.

Confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo e contenha suavemente o mouse com o polegar e o dedo médio. Insira a agulha lado para baixo, lateral no canthus medial, através da membrana conjuntivival até que a parte de trás do olho seja atingida. Retraia levemente a agulha e injete lentamente todo o volume das células.

Em seguida, retraia totalmente a agulha para o descarte adequado da seringa e da agulha. Feche a pálpebra e aplique uma leve pressão no local da injeção com uma esponja de gaze. Em seguida, examine o local de injeção para inchaço ou outro trauma visível, e permita que o rato recupere a consciência em uma gaiola estéril forrada com toalhas de papel e monitoramento antes de mover o animal para sua gaiola doméstica.

Para medir a pontuação GVHD, coloque a gaiola em um capô de fluxo laminar e remova a comida e a água da gaiola. Para marcar a atividade, observe o comportamento dos camundongos por cinco minutos. Para obter uma pontuação de perda de peso, pese cada rato em um copo de vidro.

Enquanto o rato ainda está no béquer, inspecione o animal em busca de postura, textura de pele e integridade da pele. Depois de colher os tecidos de juros, corte um pedaço de tecido de aproximadamente 3 por 0,5 milímetros do órgão, e pese a amostra em um equilíbrio. Transfira o tecido ponderado para um tubo estéril de 1,5 mililitro, e congele a amostra em nitrogênio líquido para armazenamento durante a noite a menos 80 graus Celsius.

Na manhã seguinte, descongele as amostras antes da lise, de acordo com as instruções de um kit de isolamento de DNA genômico. Para quantificação de células T humanas por reação em cadeia de polimerase digital, ou PCR, prepare reações digitais de PCR de acordo com o protocolo para corantes de vinculação de DNA para a máquina PCR digital que está sendo usada e usando os primers apropriados para DNA genômico de CD3 humano. Em seguida, realize a reação digital do PCR sob as condições de reação apropriadas.

Camundongos NSG de oito a 12 semanas de idade de ambos os sexos que recebem PBMC humano começam a exibir sinais clínicos de GVHD por volta do dia 10 pós-injeção em comparação com ratos de controle negativos tratados apenas com PBS. Os camundongos XenoGVHD têm uma sobrevida mediana de 23,5 dias. Usando PCR digital, as células T humanas epsilon-positivas cd3 podem ser detectadas no pulmão e amostras hepáticas de camundongos que recebem PBMCs humanos.

É fundamental que a pontuação seja realizada de forma consistente e que o pesquisador que marca os camundongos esteja cego para seu tratamento. Após este procedimento, o soro pode ser coletado de camundongos eutanizados para análise de expressão de citocina periférica, e as células imunes podem ser coletadas do baço para análise via citometria de fluxo.