Name: Análise de absorção endocítica e transporte retrógrado à rede Trans-Golgi usando funcionalizados Nanobodies em culturas de células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Aprenda a analisar o transporte retrógrado de proteínas até a rede Trans-Golgi usando nanobodies funcionalizados em células HeLa. Este método permite estudar a homeostase de membranas e processos endocíticos em biologia celular.

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Este trabalho foi apoiado por Grant 31003A-162643 pela Fundação de ciência nacional suíço. Agradecemos a Nicole Beuret e o Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) pelo apoio.

Os autores não têm nada para divulgar.

Nanobodies representam uma classe emergente de andaimes de proteína ligante com muitas vantagens sobre anticorpos convencionais: eles são pequenos, estável, monomérico, podem ser selecionados para alta afinidade e falta dissulfeto títulos33,35, 44 , 45. são usados em muitas aplicações, tais como nos sistemas de cultura de células e organismos em biologia do desenvolvimento46</...

Trânsito retrógrado de proteínas e lipídios de superfície celular para vários compartimentos intracelulares é crucial para a manutenção da homeostase de membrana para contrabalançar a secreção e reciclar componentes de anterógrada transporte machineries1 , 2. após internalização através de endocitose dependente de Clatrina ou - independente, carga de proteínas e lipídios primeiro preencher cedo endossomos de onde eles são mais Redirecionado ou ao longo do sistema endo-lisossomal, reciclado para a membrana plasmática, ou direcionados à rede trans-Golgi (TGN). Reciclagem de endossomos e/ou a superfície da célula para o TGN é parte do ciclo funcional de um número de receptores de carga do transmembrane anterógrada, tais como os receptores de manose-6-fosfato de cação-dependente e independente de cátion (CDMPR e CIMPR) entregando recém sintetizado hidrolases lisossômicas do TGN para tarde endossomos lisossomos3,4,5, sortilin e SorLA6,7e Wntless (WLS) transportando Wnt ligantes à superfície da célula 8 , 9 , 10 , 11. outras proteínas obtidas para o TGN são TGN46 e suas isoformas relacionados12,13,14, SNAREs (solúvel em N- proteÃ sensíveis à fusão fator acessório receptores) 15 , 16 , 17, precursora amiloide (APP) de proteína18,19, anquilose progressiva (ANK) proteína20transportadores metálicos tais como ATP7A/B ou DMT121,22e do transmembrane processamento de enzimas, incluindo a carboxipeptidase D, furina ou BACE123,24,25. Para além destas proteínas endógenas, toxinas bacterianas e vegetais (por exemplo, toxina Shiga e cólera, ricina e abrin) sequestrar máquinas de transporte retrógrado para alcançar a ER para retrotranslocation para o citosol26,27, 28,29.
A fim de analisar diretamente trânsito retrógrado, anteriormente desenvolvemos um conjunto de ferramentas baseadas em nanobody para rotular e siga proteínas de carga de superfície celular para compartimentos intracelulares30. Nanobodies representam uma nova família de proteínas ligantes derivados de homodimeric cadeia pesada-somente anticorpos (hcAbs) que ocorrem naturalmente em camelídeos e peixes cartilagíneos31,32. Eles constituem o domínio variável de cadeia pesada (VHH) de hcAbs e têm muitas vantagens sobre anticorpos convencionais (por exemplo, IgGs): eles são monoméricos, pequeno (~ 15 kDa), altamente solúvel, desprovida de ligações de bissulfeto, pode ser bacteriana expressos e selecionado para ligação de alta afinidade33,34,35,36. Para tornar a nossa ferramenta de nanobody versátil e amplamente aplicável, utilizamos funcionalizados anti-GFP nanobodies às proteínas de superfície-rótulo e faixa com GFP no seu domínio extracelular/lumenal. Por functionalization de nanobodies com mCherry, peroxidase de ascorbato 2 (APEX2)37, ou sequências de sulfatação (TS) de tirosina, transporte retrógrado de proteínas transmembranares carga de bonafide pode ser analisado por qualquer fixo e vive de imagem latente da pilha, por microscopia eletrônica de varredura, ou bioquimicamente. Desde sulfatação tirosina mediada por sulfotransferases tyrosylprotein (TPST1 e TPST2) é uma modificação pós-traducional restringida para o trans-Golgi/TGN, podemos diretamente estudar transporte e cinética de proteínas de interesse da superfície da pilha para isso intracelulares Golgi compartimento38,39,40.
Neste artigo de métodos, descrevemos a facilidade de produção de nanobodies funcionalizados (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry e derivados) adequado para uma série de aplicativos para analisar o transporte retrógrado em células de mamíferos,30. Focamos principalmente o uso de TS site-modificado nanobody para análise de tráfego intracelular de superfície celular para o compartimento de sulfatação.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-GFP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>O produto é distribuído pela Sigma-Aldrich, mas fabricado pela Roche</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-His6</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-actina</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rato HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>dissolvido em 1x PBS/1%BSA</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Applichem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>D-biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>dissolvido em ácido estéril 500 mM NaH2PO4 ou DMSO</td></tr><tr><td>5-aminolevuilnic (dALA) cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>dissolvido em água estéril</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td><td>dissolvido em água estéril</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>Produto é distribuído pela Sigma-Aldrich, mas fabricado pela Roche</td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5936</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Bioconcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Applichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td></td></tr><tr><td>Enxofre-35 como sulfato de sódio</td><td>Hartmann Analytics</td><td>ARS0105</td><td>O produto contém 5 mCi</td></tr><tr><td>Sais balanceados Earle's</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6267</td><td></td></tr><tr><td>MEM solução de aminoácidos (50x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>MEM solução vitamínica (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, coquetel inibidor de Mini Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>O produto é distribuído pela Sigma-Aldrich, mas fabricado pela Roche</td></tr><tr><td>Isopropil-&beta;-D-tiogalactopiranoside (IPTG)</td><td>Applichem</td><td>A1008</td><td>dissolvido em água estéril, o estoque é 1 M</td></tr><tr><td>Sal dissódico de carbenicilina</td><td>Applichem</td><td>A1491</td><td>dissolvido em água estéril, o estoque é de 100 mg/mL</td></tr><tr><td>de sulfato de canamicina</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>dissolvido em água estéril, o estoque é de 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Coomassie-R (Azul Brilhante)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Applichem</td><td>A3813</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Ni Sepharose High Performance</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5268-01</td><td></td></tr><tr><td>Suas colunas GraviTrap</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0033-99</td><td></td></tr><tr><td>Seu kit tampão</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0034-00</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de dessalinização PD10 descartáveis</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX gels, 4-20%,</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco de 15 poços s solução salina tamponada com fosfato (DPBS) sem Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>pratos de 35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 poços</td><td>TPP</td><td>92406</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro (N.º 1.5H)</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>Aplicação</td><td>A0999.0025</td><td>dissolvido em 40% DMSO 60% isopropanol, estoque em 500 mM</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>dissolvido em água estéril, o estoque é de 1 M</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Merck Millipore</td><td>102382</td><td>dissolvido em água estéril, o estoque é de 1 M</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td>dissolvido em água estéril, o estoque é de 5 M</td></tr></tbody></table>

análise de absorção endocítica e transporte retrógrado à rede trans-golgi usando funcionalizados nanobodies em culturas de células

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transporte de proteínas e membranas de superfície celular para o Golgi e além é essencial para a homeostase, organela identidade e fisiologia. Para estudar o tráfego de proteína retrógrada, recentemente desenvolvemos um versátil baseado em nanobody toolkit para analisar o transporte de superfície celular para o complexo de Golgi, quer por células fixas e ao vivo de imagens, por microscopia electrónica, ou bioquimicamente. Nós produzimos funcionalizados antiproteína verde fluorescente (GFP) nanobodies — ligantes pequenos, monomérico, alta afinidade da proteína — que pode ser aplicado a linha celular expressam proteínas de membrana de interesse com um moiety extracelular de GFP. Nanobodies pyrazole vinculados para os repórteres de GFP especificamente são internalizados e transportado às costas ao longo das rotas de classificação dos repórteres. Nanobodies foram acrescidas com fluorophores siga transporte retrógrado por microscopia de fluorescência e viver de imagem, com peroxidase de ascorbato 2 (APEX2) para investigar a localização ultra-estrutural do repórter-nanobody complexos por elétrons microscopia e com motivos de tirosina sulfatação (TS) para avaliar a cinética da chegada de rede (TGN) trans-Golgi. Neste artigo metodológico, descrevem o procedimento geral para o modo express e purificar nanobodies funcionalizados. Ilustramos o uso poderoso de nossa ferramenta usando o nanobodies mCherry - e TS-modificado para analisar a captação endocítica e TGN chegada de proteínas de carga.

Para investigar o transporte retrógrado proteína para vários destinos intracelulares, nós temos estabelecido recentemente uma ferramenta baseada em nanobody de anti-GFP para rotular e siga as proteínas recombinantes de fusão entre a superfície celular30. Aqui, demonstramos a produção bacteriana de tais derivatizado nanobodies e demonstrar sua aplicação para estudar endocítica absorção por microscopia de fluorescência e immunoblotting, bem como a sua utilização para...

Transporte retrógrado de proteínas de superfície celular para o Golgi é essencial para manter a homeostase de membrana. Aqui, descrevemos um método para analisar bioquimicamente transporte de superfície-para-Golgi celular de proteínas recombinantes usando funcionalizados nanobodies em células HeLa.

Análise de absorção endocítica e transporte retrógrado à rede Trans-Golgi usando funcionalizados Nanobodies em culturas de células

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Este método permite a produção e a aplicação de nano corpos expressos e funcionalizados bacterianos para analisar o transporte de proteínas retrógradas da superfície celular para compartimentos intercelulares. Em particular a rede Trans-Golgi. A principal vantagem dessa técnica é o uso da sulfação. Uma modificação pós-tradução altamente específica, compartimentalizada e sensível para avaliar a chegada do complexo nano-corpo do repórter no compartimento DTN. Este método em combinação com outros nano-corpos derivados para imagem de células de vida e microscopia eletrônica também pode ser usado para estudar processos endociticos de receptores de superfície celular relacionados à doença. Nosso repertório de nano-corpos funcionalizados foi projetado para estudar o transporte retrógrado em células cultivadas. No entanto, essas ferramentas também podem ser aplicadas em organismos multicelulares. Para iniciar este procedimento, escolha uma colônia bacteriana contendo o vetor de interesse da placa e inocula um frasco contendo 20 mililitros de meio LB complementado com antibióticos. Incubar durante a noite aos 37

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo demonstra um método para estudar a captação e o transporte retrógrado de nanocorpos funcionalizados para entender suas vias de tráfego intracelular. Ao introduzir sulfato radiomarcado e utilizar técnicas de isolamento e detecção, este método permite o estudo da captação endocítica e da chegada da rede trans-Golgi de proteínas de carga.

Monitorando a chegada de proteínas de superfície marcadas com GFP à rede Trans-Golgi usando nanocorpos funcionalizados

O tráfego de membrana envolve o transporte de proteínas da membrana plasmática para o interior da célula (ou seja, endocitose) seguido de tráfego para lisossomos para degradação ou para a membrana plasmática para reciclagem. Os métodos descritos neste artigo são projetados para estudar endocitose e reciclagem de proteínas da membrana plasmática.

Os ensaios de proteção de L-glutationa baseados em células para estudar endocitose e reciclagem de proteínas da membrana plasmática

Descreve-se um método para marcar a proteína na superfície de neurónios vivos utilizando um anticorpo policlonal específico para epitopos extracelulares. A proteína ligada pelo anticorpo na superfície da célula e subsequentemente internalizados através de endocitose podem ser distinguidas a partir de proteína restante na, ou vendidas para, a superfície durante a incubação.

Rotulagem diferencial de superfície celular e internalizado Proteínas após Anticorpo Alimentação da Vivo Cultivadas neurônios

Este artigo descreve métodos para a síntese e marcação fluorescente de nanopartículas (PN). As NPs foram aplicados em experiências de pulse-chase para rotular o sistema de endo-lisossomal de células eucarióticas. A manipulação do sistema de endo-lisossomal por actividades do agente patogénico intracelular, Salmonella enterica foram seguidas de imagem de células vivas e quantificada.

Aplicação de nanopartículas fluorescentes para estudar Reformas do Sistema Endo-lysosomal por bactérias intracelulares

Tráfico receptor modula a sinalização celular e a capacidade de resposta a ligandos e é, em si, que respondem a condições de células, incluindo a sinalização induzida por ligando. Aqui, descrevemos uma técnica poderosa e flexível para avaliar quantitativamente o tráfico receptor induzida por drogas utilizando imunomarcação ea análise colocalizational.

Rastreando alterações induzidas pela droga em Receptor de Pós-internalização Tráfico de Análise Colocalizational

A investigação do tráfico de membranas é crucial para a compreensão das funções neuronais. Aqui, introduzimos um método para quantificar a motilidade vesicular nos neurónios. Este é um método conveniente que pode ser adaptado para a quantificação do tráfico de membrana no sistema nervoso.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

São apresentados neste relatório dois métodos baseados em biotinilação, projetados para determinar a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas expressas na membrana plasmática.

Determinando a expressão da superfície celular e a taxa endocítica de proteínas em culturas primárias de astrocitos usando a biotinilação

Descrevemos um ensaio óptico para vesícula sináptica (SV) reciclagem em neurônios cultivados. Combinar este protocolo com duplo transfeccao de expressar uma proteína de interesse e o marcador pré-sináptica nos permite localizar sites pré-sináptica, sua vesícula sináptica, capacidade de reciclagem e determinar o papel da proteína de interesse.

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

Os endosários de reciclagem fazem parte da rede tubular endosomal. Aqui apresentamos um método para quantificar a dinâmica da reciclagem de endósmos usando GFP-STX13 como marcador de organela.

O ensaio baseado em microscopia para estudar e analisar os endossomos de reciclagem usando o tráfico de SNARE

O transporte endocítico e retrógrado de proteínas da membrana plasmática para a rede trans-Golgi é essencial para manter a homeostase da membrana e regular a sinalização. Aqui, descrevemos um método para obter imagens e quantificar o transporte endocítico de proteínas de carga transmembrana por microscopia de células vivas usando nanocorpos anti-GFP derivatizados em células HeLa.

Imagem de células vivas do transporte endocítico usando nanocorpos funcionalizados em células cultivadas

Aprenda a analisar o transporte retrógrado de proteínas até a rede Trans-Golgi usando nanobodies funcionalizados em células HeLa. Este método permite estudar a homeostase de membranas e processos endocíticos em biologia celular.

Análise de absorção endocítica e transporte retrógrado à rede Trans-Golgi usando funcionalizados Nanobodies em culturas de células (Vídeo) | JoVE Journal

Análise de absorção endocítica e transporte retrógrado à rede Trans-Golgi usando funcionalizados Nanobodies em culturas de células

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