Visualização fluorescente da Mango-Tagged RNA em géis de poliacrilamida através de um método de pós-coloração

A metodologia de imagem em gel marcada por manga demonstrada aqui é robusta e espera-se que seja capaz de ser simplesmente estendida em termos de sensibilidade e especificidade. Isso simplificaria ainda mais a purificação rotineira de rnas biologicamente importantes e complexos de RNA pelo simples expediente de adicionar uma mango-tag ao RNA de interesse. As RNAs estão sendo implicadas em cada vez mais doenças para este método de namoro pós-namoro é uma maneira fácil e rápida de ser capaz de rastrear e visualizar o RNA.

Cuidados extras serão necessários na transferência do gel de um lugar para outro, pois os géis são frágeis e propensos a quebrar. Para preparar um gel de desnaturação de 30 mililitros, selecione primeiro a porcentagem de poliacrilamida com o azul bromofenol apropriado, e corantes de cianol de xileno em comparação com um RNA de interesse para assegurar a alta separação de banda. Em seguida, misture as soluções A, B e C de acordo com a tabela um e adicione APS e timud.

Despeje imediatamente a solução de gel em um aparelho de fundição de gel apropriado. Insira o cone desejado e deixe o gel para polimerase por aproximadamente 30 minutos. Coma o tanque de gel usando a solução 1 XTBE e remova cuidadosamente o cone.

Levante cuidadosamente o gel e monte sobre o aparelho de gel e fixe usando clipes de aglutinante. Usando uma seringa, aspire os poços imediatamente antes do carregamento da amostra. Prepare amostras de RNA 1X adicionando solução de carregamento de gel de desnaturing 2X às amostras de interesse do RNA.

Use um termociclador para aquecer as amostras a 95 graus Celsius durante cinco minutos. Em seguida, carregue amostras resfriadas até o fundo de cada poço usando pontas de carregamento de gel. E bem, o gel à temperatura ambiente garantindo que a potência seja efetivamente baixa para não quebrar a placa de vidro do aparelho de gel.

Prepare a solução de coloração de gel 1X de acordo com o manuscrito em um recipiente de vidro limpo que é largo o suficiente para caber confortavelmente o gel. Adicione solução suficiente de coloração de gel 1X ao recipiente para que o gel esteja completamente coberto com a solução quando for colocado em um rotador orbital. Uma vez que o gel termine de funcionar, remova o gel do aparelho, corte seus poços e um canto do gel para ajudar a determinar a orientação.

Em seguida, transfira cuidadosamente o gel para a solução de coloração de gel 1X. Para realizar a imagem, decante cuidadosamente a solução de coloração e enxágue o gel rapidamente com água. Por fim, transfira cuidadosamente o gel para a bandeja a ser colocado no imager.

Enrole uma pipeta de vidro sobre o gel para remover bolhas presas e excesso de líquido. E prossiga para tirar uma imagem de gel. Os aptamers de manga um, dois, três, quatro resistiram substancialmente à desinaturação até aproximadamente uma concentração molar urea.

O tempo de coloração de 20 a 40 minutos foi suficiente para a florescence máxima do gel. O tempo mais longo não foi adequado para pequenas RNAs utilizadas neste estudo, pois começaram a difundir para fora do gel. A análise do fluorômetro mostrou que os aptamers de manga um, dois e três na presença de Ureia poderiam dobrar mais rapidamente do que o aptamer quatro.

Na ausência de Ureia, a dobra foi muito mais rápida como era esperado. A sensibilidade do método de coloração pós-coloração foi mostrada por bandas únicas correspondentes a RNAs bem dobradas para cada uma das variantes de manga em géis nativos e desnaturados com um pouco menos de sensibilidade para o posterior. A quantificação dos géis nativos foi um tronco linear sobre cerca de uma ordem de magnitude com manga um, dois, e quatro comportando-se de forma mais linear do que Manga três.

A quantificação dos géis desnaturação foram mais lineares sugerindo que a presença de Ureia no gel de desnaturação poderia fornecer uma maneira mais homogênea de dobrar os aptamers uma vez que eles são colocados na solução de coloração de biotina TO1. RNAs marcadas por manga podem ser detectadas na presença de RNA total usando coloração de biotina TO1 em comparação com a coloração de SG. Lembre-se de que o recipiente de coloração de gel é grande o suficiente para caber o gel, caso contrário, o gel pode dobrar sobre si mesmo.

As amostras de RNA serão transferidas de um lugar para outro. Semelhante aos géis de desnaturação, este método pode ser realizado para um gel nativo. Execute o gel em uma sala fria em uma wattage mais baixa para manter as condições nativas.