Preparo tecidual e imunocoloração de tecidos craniofaciais do camundongo e osso não-descalcificado

Aqui, apresentamos nosso protocolo simples para detecção de imunofluorescência em proteínas em materiais seccionados. Este método não requer recuperação de antígenos. Usaremos cabeças de rato, incluindo tecidos duros não decalcificados.

A principal vantagem desta técnica é pular a recuperação de antígenos e a decalcificação de tecidos duros. Isso leva a uma boa qualidade de resultados imunossusítuis. Este método também economiza tempo e trabalho.

Este método também é aplicável a outros tecidos com modificações adequadas. Para fazer seções agradáveis de tecidos não decalcificados, disseca seu tecido alvo ainda mais para aparar tecidos circundantes, e se necessário tratar as amostras com 10% EDTA a quatro graus Celsius durante dois dias antes da crioproteção. A demonstração visual fornece uma explicação detalhada e clara do procedimento deste método.

Para começar, prepare um prato de 10 centímetros e vários pratos de 3,5 centímetros contendo PBS e uma placa de cultura de 12 poços contendo dois mililitros de 4% PFA em PBS em cada poço para cada rato grávida, e coloque todos eles no gelo. Para dissecar embriões de camundongos gestantes, pegue a pele abaixo do centro da barriga de um rato eutanizado com fórceps, corte apenas a pele e, em seguida, puxe suavemente a pele para separá-la da parede muscular abdominal subjacente. Seguindo a mesma linha da incisão da pele, corte na cavidade abdominal.

Remova o útero contendo uma sequência de embriões. Em seguida, remova os embriões cortando suavemente a parede uterina, que removerá os tecidos extraembrínicos, como o saco de gema e amnion. Corte e isole a cabeça de cada embrião, e com fórceps transfira cada cabeça para um poço separado de uma placa de 12 poços contendo 4%PFA.

Incubar a quatro graus Celsius por quatro horas para consertar. Enxágüe as cabeças na PBS a quatro graus Celsius com agitação suave por 12 horas. Para crioprotetor as cabeças, transfira-as usando fórceps para uma nova placa de 12 poços contendo dois mililitros de 30% de sacarose na PBS.

Incubar com agitação suave a quatro graus Celsius até as cabeças afundarem até o fundo do prato. Para incorporar as cabeças crioprotegidas, transfira-as para um molde contendo o composto de temperatura de corte ideal e equilibre por vários minutos. Usando fórceps, ajuste a localização e a direção das amostras para que o lado aparado das amostras fique de frente para a parte inferior do molde de incorporação.

Em seguida, coloque o molde no gelo seco para congelar, e armazene em um saco plástico a menos 80 graus Celsius até estar pronto para a crioseção. Para tecido pós-natal, depois de remover os tecidos de pele e adiposos de um rato eutanizado, de três semanas a três meses de idade, corte e isole a cabeça e remova a mandíbula. Em seguida, conserte e crioproteta a cabeça como feito com cabeças de embrião.

Incorpore em 8% de gelatina de forma semelhante à cabeça de embrião em OUTUBRO, e mantenha os Cryomolds em um saco plástico a menos 80 graus Celsius até a crioseção. Defina a temperatura do criostat apropriado. Coloque as amostras na câmara criostat por cerca de 30 minutos para equilibrar a temperatura criostat.

Remova o bloco com a amostra do Cryomold, e monte-o com uma gota de OCT sobre o mandril do espécime e congele-o, certificando-se de manter o lado aparado da amostra mais distante do mandril e de frente para o operador. Carregue o mandril montado no bloco no suporte do objeto criostat. Ajuste o suporte da lâmina de modo que o ângulo da lâmina seja de três a cinco graus em relação à amostra.

Colete seções de 10 micrômetros em lâminas de microscópio revestidas. Deixe as seções em temperatura ambiente até secar completamente, e depois armazene-as a menos 80 graus Celsius. Para começar com a coloração, retire slides de menos 80 graus Celsius, e mantenha-os em temperatura ambiente por uma hora para secar as seções.

Enxágüe os slides em 0,1%PBST três vezes por cinco minutos cada para lavar o OCT e permeabiliizar as seções. Adicione 200 microliters de solução de bloqueio a cada slide e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, remova a solução de bloqueio sem enxaguar o slide.

Adicione 100 microliters de anticorpo primário diluído em solução de bloqueio a cada slide, e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Enxágüe os slides com PBS três vezes por 10 minutos cada um em temperatura ambiente. Adicione 100 microliters de anticorpos secundários diluídos em solução de bloqueio e incubar por uma hora à temperatura ambiente, protegido da luz.

Enxágüe em PBS três vezes por 10 minutos cada um à temperatura ambiente, ainda protegido da luz. Para montar os slides, adicione duas gotas de meio anti-fade com DAPI em cada slide, cubra com um deslizamento de tampa e armazene a quatro graus Celsius até estar pronto para a imagem. Os ossos frontais dos embriões de controle foram positivos para pSmad1/5/9, fatores de sinalização BMP a jusante, e Ki67, um marcador de proliferação celular.

Em embriões mutantes BMPR1A resistentes constitutivamente, no entanto, os níveis de pSmad1/5/9 foram aumentados enquanto os níveis de Ki67 foram reduzidos. Além disso, mais células apoptóticas foram observadas nos ossos frontais dos embriões mutantes do que as dos embriões de controle. As crioseções coronais de cabeças embutidas em gelatina mostram claramente o sinal GFP e o sinal RFP de uma fita tdTomato nos ossos nasais e tecidos nasais, demonstrando que a gelatina não interfere com sinais fluorescentes.

Quando essas seções foram imunos detidas para SOX9 ou Osterix e E11/Podoplanin, seções de boa qualidade foram obtidas da maioria dos tecidos duros de três semanas. Por outro lado, com amostras de três meses de idade, seções de boa qualidade só foram obtidas em alguns dos tecidos duros, incluindo os compartimentos trabeculares do fêmur, tecidos nasais e crânio, incluindo a sutura nasal-premaxilla e os ossos circundantes da cabeça. As células sox9 positivas foram detectadas especificamente nos condrócitos da placa de crescimento e na articulação do fêmur e do septo nasal.

No incisivo de três semanas, SOX9 foi detectado nas células mesenquimais. Os resultados de coloração dupla de Osterix e E11 mostram que Osterix foi detectado em osteoblastos, enquanto O11 foi detectado em osteocitos de ossos do fêmur e da cabeça. No incisivo de três semanas, Osterix foi positivo em odontoblastos, enquanto O11 foi positivo em células mesenquimais folículos.

Por favor, não afixe demais amostras com 4%PFA. Para a secção de tecidos duros não decalcificados na gelatina, a melhor temperatura é de menos 25 graus Celsius e menor. Após este procedimento, os níveis de fluorescência podem ser quantificados conforme descrito em nosso protocolo.

Essas medidas fornecerão dados informativos para mostrar a diferença do nível relativo de proteína entre diferentes grupos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para a coloração dupla ou tripla para obter padrões de co-expressão de diferentes proteínas. 4% PFA é perigoso.

Pode causar alergias à pele, danos graves nos olhos, danos nos órgãos ou câncer. Por favor, use equipamentos de proteção individual e lave bem a pele após o manuseio.