Name: Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Aprenda a realizar hibridização in situ em embriões de Astyanax mexicanus com mínimo fundo de coloração. Este protocolo simplificado facilita a visualização da expressão gênica em peixes cavernícolas.

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Os autores desejam agradecer membros do laboratório Gross para comentários úteis sobre este manuscrito. Gostaríamos de reconhecer quatro estudantes do ensino médio que utilizaram este protocolo durante os estágios de verão em 2017 e 2018, incluindo David Nwankwo, Michael Warden, Aki Li e Christine Cao. HL foi apoiado por uma bolsa UC biologia tronco durante o verão de 2017. Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional da ciência (DEB-1457630 de JBG) e institutos nacionais de dentária e Craniofacial Research (NIH; DE025033 de JBG).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da University of Cincinnati (protocolo #10-01-01-21).
1. fixação
<ol><li>Isolar o número desejado de Astyanax mexicanus embriões de um tanque de reprodução e corrigir ~ 50 embriões de cada vez. Se os embriões são grandes e antigos, pode ser necessário fixar 25 ao mesmo tempo para garantir a fixação do mesmo.</li>
	<li>Dependendo da idade do embrião, utilize o método aprovado IACUC de anestesia. Para os mais antigos embriões com um funcionamento do sistema nervoso, sacrifica embriões através de overdose de anestésico. Nesse sentido, coloca embriões em uma solução de ~ 1% metanosulfonato (tamponada de pH 7,4) para minimizar a dor e desconforto para o organismo.</li>
	<li>Uma vez que os embriões não respondem ao toque, sistema de água contendo tricaina e adicionar ~ 1 mL de 1x tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4).</li>
	<li>Remover a solução de PBS e adicionar 1 mL de paraformaldeído 4% (PFA). Fixar os embriões durante a noite a 4 ° C. Atenção: PFA é perigosa (ou seja, é inflamável e é uma pele e irritantes do pulmão), manuseie com cuidado.</li>
</ol>2. desidratação
<ol><li>Para desidratar os embriões, retire a fixador solução e enxágue com 1 mL de PBS. Coloque os frascos contendo embriões em um ângulo (entre 30° e 45°), num agitador de plataforma durante o enxágue. Continue a lavar os embriões duas vezes, 5 min por lavagem.</li>
	<li>Se os embriões ainda têm um córion, coloque todos os 50 embriões em uma 100 x 25 mm placa de Petri e cuidadosamente, isolá-los dos chorions usando dois conjuntos de pinças de relojoeiro (por exemplo, #5 pinças) sob um microscópio. Nota: Durante as etapas descritas abaixo e para o restante do protocolo, cuidadosamente retire todo o líquido do passo anterior usando limpa, pipetas de Pasteur de vidro antes de adicionar a seguinte solução</li>
	<li>Desidrata-se os embriões em uma série de lavagens cada vez mais concentradas de metanol (MeOH) descrito abaixo. As diluições são baseadas em um volume total de 1 mL com 500 µ l de solução em cada frasco de vidro de 4 mL. Execute todas as etapas de desidratação em temperatura ambiente (RT) agitador de plataforma.<ol>
<li>Remova cuidadosamente a solução de PBS. Adicione uma solução de MeOH de 25% (250 µ l de MeOH) + 750 µ l de PBS. Agite suavemente num agitador de plataforma por 5 min.</li>
		<li>Remova cuidadosamente a solução de MeOH 25%. Adicione uma solução de 50% MeOH (500 µ l de MeOH) + 500 µ l de PBS. Agite suavemente num agitador de plataforma por 5 min.</li>
		<li>Remova cuidadosamente a solução de MeOH 50%. Adicione uma solução de MeOH 75% (750 µ l de MeOH) + 250 µ l de PBS. Agite suavemente num agitador de plataforma por 5 minutos.</li>
		<li>Remova cuidadosamente a solução de MeOH 75%. Adicione uma solução de MeOH 100% (1 mL de MeOH). Agite suavemente num agitador de plataforma 5 min. Repita este passo 3 vezes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Neste ponto, armazene embriões desidratados, conforme necessário, em seus frascos de vidro a-20 ° C (longo prazo). Alternativamente, vá direto ao dia 1 do protocolo.</li>
</ol>3. dia 1: reidratação
<ol><li>Obter embriões desidratados do congelador-20 ° C (ou proceder directamente da etapa 2.5).</li>
	<li>Classificar os embriões com uma pipeta Pasteur. Um pode classificar com base no Morfotipo (i.e., caverna e/ou superfície), e o número de genes avaliados em cada experimento. Há normalmente não mais que 12 embriões por frasco uma vez classificados. Para manter a organização, use fita colorida laboratório para designar os frascos e pipetas para cada gene. Os embriões vão ficar no mesmo frasco em todo o protocolo inteiro. Nota: Lugar a ponta da pipeta Pasteur em 100% EtOH para esterilizar entre usa.</li>
	<li>Defina um tremendo banho de água a 70 ° C, para ser usado em uma etapa posterior. Cuidadosamente, retire o MeOH em frascos de embriões classificados e substituir com 500 µ l de novo 100% MeOH. Lavagem brevemente (~ 1 min) agitador de plataforma.</li>
	<li>Reidratar embriões em uma concentração crescente de 1X PBS com Tween 20 (PBT, veja abaixo), agitador de plataforma. As diluições são baseadas em um volume de diluição final de 1 mL com 500 µ l em cada frasco.<ol>
<li>Adicione uma solução PBT de 25% (250 µ l de PBT, 750 µ l de MeOH). Agite suavemente num agitador de plataforma por 5 min.</li>
		<li>Remova cuidadosamente a solução PBT de 25%. Adicione uma solução PBT de 50% (500 µ l de PBT, 500 µ l de MeOH). Agite suavemente num agitador de plataforma por 5 min.</li>
		<li>Remova cuidadosamente a solução PBT de 50%. Adicione uma solução PBT de 75% (750 µ l de PBT, 250 µ l de MeOH). Agite suavemente num agitador de plataforma por 5 min.</li>
		<li>Remova cuidadosamente a solução PBT de 75%. Adicione uma solução PBT de 100% (1 mL de PBT). Agite suavemente num agitador de plataforma 5 min. Repita este passo 3 vezes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. dia 1: Digestão e fixação
<ol><li>Prepare uma solução de K (PK) de proteinase adicionando 1 µ l de PK (20 mg/mL) a 2 mL de PBT.</li>
	<li>Em antecipação de etapas subsequentes, obter alíquotas congeladas de buffers de hibridação (Hyb - e Hyb +; ver suplementar arquivo 2 e 3 de arquivo suplementar) e PFA de armazenamento-20 ° C.<ol>
<li>Permitir que o PFA descongelar no RT</li>
		<li>Colocar alíquotas de Hyb - e Hyb + num banho rotativo-70 ° C. Coloque todos os reagentes e os frascos dentro de um pequeno "junta" com um fundo de malha, no interior do aparelho de banho de água flutuante. Isso permite que a simples adição e remoção de tubos e frascos do banho-maria a 70 ° C rotativa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Delicadamente, adicione solução de PK para o conj de embriões, garantindo a todos os tecidos são completamente cobertos com solução. Digerir embriões para ~ 12 min em solução de trabalho PK o agitador de plataforma. Nota: O comprimento da digestão pode ser variado pelo investigador para garantir melhores resultados.</li>
	<li>Delicadamente, retirar a solução PK e brevemente inundar o frasco com PBT para diluir qualquer restante PK</li>
	<li>Retirar a solução PBT e substituir com 500 µ l de PBT de novo. Permitir que a solução enxaguar o agitador de plataforma por 5 min.</li>
	<li>Trasfegar PBT e substituir com 500 µ l de descongelado 4% PFA. Permitir que os embriões incubar por 20 min o agitador de plataforma no RT</li>
	<li>Retirar os 4% PFA e brevemente inundar o frasco com PBT para diluir qualquer restante PFA. Trasfegar o PBT e substitua com 500 µ l de PBT fresco. Permitir que os embriões enxaguar durante 5 min o agitador de plataforma. Repita esta etapa 4 vezes mais.</li>
</ol>5. dia 1: Prehybridization
<ol><li>Lugar de 500 µ l de pré-aquecido Hyb-solução dentro do frasco. Cuidadosamente coloque o frasco na 70 ° C água banho (dentro de gaxetas) sem tremer, por 5 min.</li>
	<li>Trasfegar a Hyb-solução e inundar o frasco com 500 µ l de solução Hyb + previamente aquecida. Coloque o frasco volta em banho de água a 70 ° C com agitação (40 rpm). Incubar durante qualquer 4 h, ou uma noite. Nota: Uma incubação de 4h renderá um protocolo in-situ completo que irá durar por 4 dias no total. Aqui, esta etapa é apresentada como uma incubação durante a noite, que renderá um protocolo durou 5 dias no total.</li>
</ol>6. dia 2: hibridização
<ol><li>Coloque uma parte alíquota do Hyb + do congelador-20 ° C para o tremendo banho de água quente por 5 min.</li>
	<li>Trasfegar o Hyb + do frasco e substituir com 500 µ l de pré-aquecido Hyb +. Para esta solução, cuidadosamente adicione 2 µ l de sonda RNA a cada frasco. Agite suavemente o frasco para assegurar uma distribuição uniforme da sonda.</li>
	<li>Incube a solução Hyb + (com sonda adicionada) em banho de água quente a 70 ° C durante a noite, agitando a 40 rpm. Nota: Um pode re-utilizar solução Hyb + (com sonda). Para isso, ter Hyb + com sonda da primeira execução do congelador-20 ° C e coloque num banho de água quente durante 5 min. Replace Hyb + desde o dia 1 protocolo com Hyb + com sonda e permitir a incubação durante a noite no banho de água quente.</li>
</ol>7. dia 3: Preparação de solução
<ol><li>Prepare tubos microcentrifuga rotulados Hyb + com a sonda de RNA "gene de interesse". Prepare a série de diluições que serão usadas durante o dia 3.<ol>
<li>Usando 6 tubos separados, preparar a seguinte série de diluições do Hyb - e citrato de sódio salino (CCD, 0 a 100%) em um volume de 1 mL e lugá-los na 70 ° C a tremer água de banho: 1 = 100% de tubo Hyb-(1 mL de Hyb-): tubo 2 = 25% 2 x SSC (250 µ l de 2 x SSC, 750 µ l de Hyb-); Tubo 3 = 50% 2 x SSC (500 µ l de 2 x SSC, 500 µ l do Hyb-); Tubo 4 = 75% 2 x SSC (750 µ l de 2 x SSC, 250 µ l de Hyb-); Tubo de CCD de 2 x 5 = 100% (1 mL de 2 x SSC); Tubo de 6 = 100% x 0.2 SSC (2 mL de 0,2 x SSC). Nota: Ser vigilante da concentração do SSC, como muda de 2x para 0.2 x.</li>
		<li>Usando 4 separar os tubos, preparar a seguinte série de diluições de PBT e CCD em um volume de 1 mL e coloque no RT: tubo 1 = 25% PBT (250 µ l de PBT, 750 µ l de 0.2 x SSC); Tubo 2 = 50% PBT (500 µ l de PBT, 500 µ l de 0,2 x SSC); Tubo 3 = 75% PBT (750 µ l de PBT, 250 µ l de 0,2 x SSC); Tubo de PBT 4 = 100% (1mL de PBT).</li>
		<li>Prepare um tubo com 2 mL de tampão de ácido maleico, contendo solução de trabalho de Tween 20 (MABT).</li>
		<li>Prepare dois tubos cónico de 15 mL de solução de bloqueio. Em cada tubo, adicionar 0,2 g de reagente de bloqueio para 10 mL de MABT (ver 4 de arquivo suplementar). Coloque os dois tubos um misturador de oscilador (ou agitador de plataforma) até completamente dissolvido em solução (até 3 h).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. dia 3: Remoção de sonda
<ol><li>Trasfegar Hyb + (com sonda) solução com uma pipeta Pasteur de vidro e coloque-o em uma estéril, rotulado microcentrifuga tubo. Manter este tubo no congelador-20 ° C para uso futuro (se sonda-rotulagem é bem sucedida).</li>
	<li>Cuidadosamente, adicione 500 µ l das SSC quentes/Hyb-diluições (indicado abaixo). Incube em cada uma das seguintes soluções por 10 min em banho de água agitando a 70 ° C.<ol>
<li>Incubar em sequência com 100% Hyb-(1ml de Hyb-), 25% 2 x SSC (250 µ l de 2 x SSC, 750 µ l de Hyb-), 50% 2 x SSC (500 µ l de 2 x SSC, 500 µ l do Hyb-), 75% 2 x SSC (750 µ l de 2 x SSC, 250 µ l de Hyb-), 100% 2 x SSC (1ml de 2 x SSC) , 100% 0.2 x SSC (2 mL de 0.2 x SSC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a última etapa, incubar em cada uma das seguintes soluções para 10 min cada. Todos a incubação do seguintes ocorrem em RT o agitador de plataforma: 25% PBT (250 µ l de PBT, 750 µ l de 0.2 x SSC), 50% PBT (500 µ l de PBT, 500 µ l de 0.2 x SSC), 75% PBT (750 µ l de PBT, 250 µ l de 0.2 x SSC) , 100% PBT (1 mL de PBT).</li>
	<li>Após uma incubação de 10 min, retire o 100% PBT e adicione 500 µ l de MABT em cada frasco. Repita duas vezes por 5 min.</li>
</ol>9. dia 3: bloqueio
<ol><li>Remova MABT de cada frasco e inundação com pré-misturado solução bloqueio de um dos tubos (preparados na etapa 7.1.4). Coloque o frasco em um misturador de oscilador para ~ 4 h no RT</li>
	<li>Adicionar 2 µ l de DIG-AP-Fab fragmentos no segundo frasco de 10 mL de solução (preparada na etapa 7.1.4) e brevemente o vórtice de bloqueio.</li>
	<li>Encha cada frasco quase completamente com bloqueio (~ 5 mL) de solução e coloque no misturador de oscilador durante a noite no frigorífico a 4 ° C.</li>
</ol>10. dia 4: MABT lavagens
<ol><li>Preparar um frasco estoque de 10% de soro de cabra normal (NGS) em MABT (adicionar 100 µ l de NGS para 900 µ l de MABT).</li>
	<li>Retirar a solução de bloqueio em cada frasco e adicione 500 µ l de mistura NGS/MABT em cada frasco. Permitir que os embriões incubar durante 25 min no RT o agitador de plataforma.</li>
	<li>Substituir a mistura NGS/MABT com 500 µ l de 100% MABT. Incube durante 30 min à RT o agitador de plataforma. Execute este enxaguamento 11 vezes mais ao longo do dia cada 30 min.</li>
	<li>Encha o frasco com 100% MABT e coloque em um misturador de oscilador durante a noite em uma câmara de geladeira ou frigorífico a 4 ° C.</li>
</ol>11. dia 5: Visualização da ponta de prova
<ol><li>Prepare-se uma alíquota de 50 mL de tampão de fosfatase alcalina (AP) (ver 5 de arquivo suplementar). Combinar o seguinte em um tubo cônico de 50 mL, embrulhado em papel de alumínio para limitar a exposição à luz: 5 mL de 1 M Tris (pH 9,5), 5 mL de 50mm MgCl2, 5ml de 1% Tween 20, 5ml de 1 M NaCl, 30 mL de ddH2O.</li>
	<li>Remover MABT e substitua por 1 mL de tampão de AP (tubo envolvido em papel alumínio). Deixe lavar por 5 min. Fazer isso duas vezes para assegurar a remoção completa dos MABT.</li>
	<li>Retire o tampão do AP e substituir com 1 mL de tampão de AP com 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate 3.5 μL (BCIP) e 4.5 μL de nitro-azul de tetrazólio (NBT). Substitua com AP recentemente preparada amortecedor/NBT/BCIP uma vez a cada hora até a reação é completa. Acompanhar de perto, verificando a cada 15 minutos, para permitir que a reação de coloração ser feita até o nível desejado de coloração foi alcançado. Se o precipitado começa a se formar, substitua a solução mais cedo.</li>
	<li>Pare a reação de coloração enxaguando os embriões no buffer de AP 100% fresco (sem NBT/BCIP) por 5 min. Continue lavagens em PBT até que sejam alcançados os níveis ideais de sinal (com quantidades mínimas de coloração de fundo). Continue enxaguando espécimes com crescentes diluições de PBT no Buffer de AP da seguinte forma: 25% PBT (250 μL de PBT, 750 μL de tampão, AP), enxaguar por 5 min; 50% PBT (500 μL de PBT, 500 μL de tampão, AP), enxaguar por 5 min; 75% PBT (750 μL de PBT, 250 μL de tampão, AP), enxaguar por 5 min.</li>
	<li>Enxágue os embriões em ~ 5 mL de 100% PBT no oscilador misturador até desejada de coloração de fundo mínimo é alcançado. Alternar com PBT fresco várias vezes. Isto pode demorar até vários dias.</li>
	<li>Quando é uma lavagem completos, lavagem de embriões em 500 µ l de PBS estéril num agitador de plataforma. Execute este enxaguar duas vezes por 5 min. Depois lava-PBS, fixar os espécimes em 500 μL de 4% PFA por 1h no RT num agitador de plataforma. Alternativamente, consertar a noite em 1 mL de 4% PFA na geladeira a 4 ° C.</li>
	<li>Substitua o fixador fresco, PBS estéril. Executar este enxágue pelo menos duas vezes por 5 min. do lugar os embriões em ~ 4 mL de PBS estéril de 100% e armazenar a longo prazo a 4 ° C.</li>
</ol>12. imaging
<ol><li>Compõem uma placa de imagem em uma placa de Petri usando 3% de agarose e tampão TAE. Nota: As quantidades dependem de quantas placas são necessárias. As placas podem ser reutilizadas várias vezes. É recomendável que um molde retangular raso é colocado na caixa de Petri, enquanto o gel está esfriando a fim de criar uma depressão por conter os embriões na placa.</li>
	<li>Coloque os embriões na chapa na PBS. Nota: Recomenda-se delicadamente despeje embriões na placa em vez de pipetagem-los porque verificou-se que eles vão ficar com o interior de pipetas de plástico.</li>
	<li>Microscopia de luz de uso para visualizar cada embrião. Use uma ponta de prova contundente para manobrar os embriões para a posição desejada.</li>
	<li>Tirar uma imagem quando o embrião está na posição desejada. Observe que é importante ter imagens de embriões dentro de algumas semanas de coloração concluído para evitar a degradação do potencial da mancha.</li>
</ol>

<ol><li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValentino%2C+KL+%22In+situ+hybridization%3A+Application+to+neurobiology%22">In situ hybridization: Application to neurobiology</a>. , Oxford University Press. Oxford. (1987).</li>
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<li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764(2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Devido à vulnerabilidade do RNA, a degradação, um dos passos mais importantes no protocolo refere-se a síntese estéril da sonda RNA. No entanto, se uma sonda com cuidado é gerada e fornece bons resultados, ele pode ser reutilizado em reações de coloração subsequentes. Um segundo passo crucial é a produção cuidadosa de todos os reagentes utilizados em todo o protocolo. Uma vez que este protocolo envolve vários dias e muitos pequenos passos, é essencial que todos os reagentes são com precisão produzidos e armazenados de fo...

Hibridação in situ é um método comum para coloração de tecidos fixos para visualizar de padrões de expressão de gene1. Esta técnica tem sido realizada há anos em outros tradicionais2 e não-tradicionais3 sistemas de modelo, para uma variedade de estudos biológicos. No entanto, várias etapas e os reagentes são necessários para executar com êxito este procedimento. Para os investigadores que nunca tenham realizado esta técnica, iniciar o processo pode ser intimidante, devido as muitas etapas envolvidas. Além disso, a natureza longa deste procedimento presta-se a erros técnicos, que podem ser um desafio para solucionar problemas.
O objetivo geral deste artigo é apresentar um método simples e direto que irá processar esta técnica de hibridização acessível a um vasto público. Para reduzir a introdução de erros, nós apresentamos uma abordagem direta que produz coloração de expressão do gene de alta qualidade e minimiza o sinal de fundo específico. Este procedimento é semelhante a outras abordagens desenvolvidas em sistemas modelo tradicional, como Danio rerio4. Aqui, pretendemos facilitar a aplicação cuidadosa de cada etapa usando uma lista de verificação para download (arquivo suplementar 1), para promover a aplicação cuidadosa do protocolo. A justificativa para fazer isto é para facilitar a organização através dos muitos passos envolvidos neste procedimento. Este artigo é apropriado para pesquisadores interessados em realizar toda a montagem hibridização in situ no desenvolvimento de embriões, mas ainda não ter realizado o procedimento. A vantagem da abordagem escolhida por pesquisadores de Astyanax é que tem sido testada e comprovada em cavefish e morfos de peixe de superfície, facilitando a análise comparativa da expressão. O método apresentado pode ser usado por pesquisadores em estudos sobre Astyanax e outros sistemas.

<table><tbody><tr><td>Pipeta serológica de 10 mL</td><td>VWR</td><td>89130-888</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de filtração de 1000 mL</td><td>VWR</td><td>89220-698</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica cónica de 15 mL</td><td>VWR-Greiner</td><td>82050-278</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 25 mL</td><td>VWR</td><td>89130-890</td><td></td></tr> Unidade <tr><td>de filtração de 250 mL</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 5 mL</td><td>VWR</td><td>89130-886</td><td></td></tr><tr><td>50 mL cônico</td><td>VWR-Falcon</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Unidade de filtração</td><td>VWR</td><td>89220-696</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-AP, fragmentos de Fab</td><td>Sigma-Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8503-1G</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Solução de bloqueio</td><td>Sigma-Roche</td><td>11 096 176 001</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Ácido Cítrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A104-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td><td>Tubos Sigma-Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher-Decon</td><td>04-355-223</td><td>1 Gal</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Frascos de vidro dram</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>1 Dr</td></tr><tr><td>Pipetas de Vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td><td>284000ACS</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio-cristalino</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ácido maleico</td><td>Sigma</td><td>M0375-100g</td><td>100g</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>4L</td></tr><tr><td>Água de grau molecular (sem RNase)</td><td>VWR</td><td>7732-18-5</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>de pellets de NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>NBT Substrato em pó</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34035</td><td>1 g</td></tr><tr><td>de soro de cabra normal</td>Misturador de nutorações <td>Fisher-Invitrogen</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>158127-500g</td><td>500 g</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>20L</td></tr><tr><td>Proteinase K (200mg/10ml)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>Pipetas de plástico de 10 mL</td></tr><tr><td></td><td>VWR-Samco</td><td>14670-147</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma</td><td>R2020-250mL</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Banho-maria agitado 12 L</td><td>VWR</td><td>10128-126</td><td>12 L</td></tr><tr><td>Agitador analógico padrão</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Millipore-OmniPur</td><td>9210-500GM</td><td>500 g</td></tr><tr><td>tRNA Levedura</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>15401011</td><td>25 mg</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50mL</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td><td>50-728-002</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Lítio (LiCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203637-10G</td><td>10 g</td></tr></tbody></table>

hibridização in situ de embriões inteiros de astyanax

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Nos últimos anos, foi lançado um genoma de projecto para o cego mexicano cavefish (Astyanax mexicanus), revelando as identidades de sequência para milhares de genes. Pesquisas anteriores neste sistema modelo emergente capitalizou investigações abrangentes de todo o genoma que identificaram numerosos loci de traço quantitativos (QTL) associado com vários fenótipos associados a caverna. No entanto, a capacidade de conectar os genes de interesse para a base hereditária para mudança fenotípica permanece um desafio significativo. Uma técnica que pode facilitar a compreensão mais profunda do papel do desenvolvimento na evolução troglomorphic é toda a montagem hibridação in situ. Esta técnica pode ser implementada para diretamente comparar a expressão gênica entre as formas e superfície-habitações na caverna, nomear candidato genes subjacentes QTL estabelecida, identificar os genes de interesse em estudos de sequenciamento de nova geração ou desenvolver outros abordagens de descoberta. Neste relatório, nós apresentamos um protocolo simples, apoiado por uma lista de verificação flexível, que pode ser amplamente adaptada para o uso bem além do sistema de estudo apresentado. Espera-se que este protocolo pode servir como um grande recurso para a comunidade de Astyanax e além.

Neste relatório, nós fornecemos uma abordagem simples e direta para executar a rotulagem de espécimes de Astyanax embrionárias para análise de expressão do gene de alta qualidade. Esta técnica pode ser realizada em quatro ou cinco dias, e cada etapa principal do procedimento é representada em um fluxograma com codificação de cores (Figura 1). Depois de concluído, manchada de embriões devem abrigar um rótulo cromático roxo escuro em tecidos que expres...

Este protocolo permite a visualização da expressão gênica em embrionárias Astyanax cavefish. Esta abordagem foi desenvolvida com o objetivo de maximizar o sinal de expressão do gene, minimizando a coloração de fundo específico.

Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Nosso protocolo in situ é significativo porque fornece uma maneira simples de visualizar padrões de expressão genética com coloração mínima de fundo. Esta técnica torna um protocolo complicado e demorado relativamente fácil de executar. O Benchtop configurou sugestões e listas de verificação fornecidas, tornando este protocolo ainda mais fácil de executar corretamente e reproduzir.Embora as técnicas aqui mostradas sejam específicas para o Astyanax mexicanus, ela provavelmente poderia ser adaptada a outros sistemas de indivíduos de tamanho comparativa com pequenos ajustes no protocolo. Primeiro, use fita de laboratório colorida para designar frascos e pipetas para cada gene. Usando uma pipeta Pasteur, classifique os embriões.Geralmente não há mais de 12 embriões por frasco, uma vez classificados. Em seguida, coloque um banho de água tremendo para 70 graus Celsius. Retire cuidadosamente o metanol nos frascos de embriões ordenados, e substitua-o por 500 microliters de metanol fresco 100%.Lave os embriões brevemente por cerca de um minuto em um agitador de plataforma. Depois disso, reidratar os embriões em uma concentração crescente de 1x PBS com Tween 20 em um shaker de plataforma como descrito no protocolo de texto. Para começar, coloque uma pequena junta com um fundo de malha no banho de água rotativo que foi pré-aquecido a 70 graus Celsius.Coloque alíquotas de tampão de hibridização menos e tampão de hibridização mais na junta. Adicione suavemente uma solução PK preparada aos frascos de embriões garantindo que todos os tecidos estejam completamente cobertos de solução. Transfira os frascos para um agitador de plataforma e deixe-os digerir na solução de trabalho proteinase K por aproximadamente 12 minutos.Depois disso, retire suavemente a solução PK e inunde brevemente o frasco com PBT para diluir o PK restante. Substitua a solução PBT por 500 microliters de PBT fresco e deixe a solução enxaguar no agitador da plataforma por cinco minutos. Em seguida, substitua a solução PBT por 500 microliters de 4%PFA descongelados. Deixe os embriões incubarem na plataforma agitador à temperatura ambiente por 20 minutos.Para iniciar a pré-hibridização, adicione 500 microliters de tampão de hibridização pré-armado menos solução aos frascos contendo embriões. Coloque cuidadosamente os frascos na junta no banho de água a 70 graus Celsius sem tremer por cinco minutos. Em seguida, desenhe o buffer de hibridização menos solução e inunde os frascos com 500 microliters de buffer de hibridização pré-rebocada mais solução.Coloque os frascos de volta na junta no banho de água e incubar com agitação por quatro horas ou durante a noite. Para começar a hibridização, desenhe o tampão de hibridização mais fora dos frascos e substitua-o por 500 microliters de buffer de hibridização pré-armado fresco plus. Adicione cuidadosamente dois microliters de sonda RNA a cada frasco e gire suavemente para garantir a distribuição uniforme da sonda.Incubar no banho de água a 70 graus Celsius durante a noite enquanto treme a 40 RPM. Para começar, prepare os tubos de microcentrifuuge rotulados tampão de hibridização, além do gene de interesse da sonda RNA, conforme descrito no protocolo de texto. Defina dois tubos cônicos de 15 mililitros e adicione 0,2 gramas de reagente bloqueador e 10 mililitros de MABT.Coloque ambos os tubos em uma batedeira de nozes até que o reagente esteja completamente dissolvido na solução. Usando uma pipeta pasteur de vidro, desenhe o tampão de hibridização mais e a solução da sonda e coloque-o em um tubo de microcentrifuge estéril rotulado. Armazene este tubo no congelador a menos 20 graus Celsius para uso futuro.Adicione cuidadosamente 500 microliters do fotrato de sódio salino quente e tampão de hibridização menos diluições. Incubar em soluções sequenciais por 10 minutos cada no banho de água agitada e, em seguida, à temperatura ambiente em um agitador de plataforma, conforme descrito no protocolo de texto. Após a última incubação, substitua o 100% PBT de cada frasco por 500 microliters de MABT.Repita este processo duas vezes por cinco minutos cada. Primeiro, remova o MABT de cada frasco e dilua-o com a solução de bloqueio pré-x de um dos tubos cônicos de 15 mililitros. Coloque os dois frascos na batedeira por quatro horas em temperatura ambiente.Adicione dois microliters dos fragmentos de anticorpos ao segundo tubo de solução de bloqueio preparada e brevemente vórtice. Em seguida, encha cada frasco quase completamente com solução de bloqueio e coloque-os em uma batedeira de nozes durante a noite em uma geladeira a quatro graus Celsius. Para começar, prepare um frasco de estoque de 10% de NGS no MABT.Substitua a solução de bloqueio em cada frasco por 500 microliters desta solução NGS. Incubar à temperatura ambiente no agitador da plataforma por 25 minutos. Depois disso, substitua a mistura NGS por 500 microliters de 100% MABT.Incubar na plataforma shaker à temperatura ambiente por 30 minutos. Repita esta lavagem mais 11 vezes ao longo do dia, a cada 30 minutos. Em seguida, encha cada frasco com 100% MABT e coloque-os em uma batedeira durante a noite em uma geladeira a quatro graus Celsius.Primeiro, substitua o MABT em cada frasco por um mililitro de tampão AP e deixe-o lavar por cinco minutos. Repita esta lavagem duas vezes para remover completamente o MABT. Em seguida, substitua o buffer AP por um mililitro de tampão AP fresco contendo 3,5 microliters de BCIP e 4,5 microliters de MBT.Substitua-o por uma mistura fresca de tampão AP contendo o BCIP e o MBT a cada hora até que a reação esteja completa, certificando-se de monitorar a reação de perto e verificar a cada 15 minutos até que o nível desejado de coloração seja alcançado. Pare a reação de coloração enxaguando os embriões em uma concentração crescente de 1X PBT no buffer AP, conforme descrito no protocolo. Enxágüe os embriões em aproximadamente cinco mililitros de 100% PBT em uma batedeira de nozes até que a coloração mínima desejada seja atingida.Quando a lavagem estiver completa, lave os embriões em 500 microliters de PBS estéreis em um agitador de plataforma e poste as amostras conforme descrito no protocolo de texto. Depois de enxaguar os embriões, coloque-os em quatro mililitros de PBS 100% estéreis e, se necessário, armazene-os a longo prazo a quatro graus Celsius. Neste estudo, as amostras embrionárias de Astyanax são rotuladas para análise de expressão genética de alta qualidade.Este processo foi implementado com sucesso tanto em embriões de peixes-caverna pachon quanto embriões de peixes superficiais. Embriões de peixe-caverna rotulados para expressão Sox9 demonstram rotulagem clara nos arcos ramificais em desenvolvimento e na barbatana peitoral. Observe que a coloração está praticamente ausente no saco de gema ou nos somites em desenvolvimento no flanco.Da mesma forma, a expressão Tfap2a é evidente nas porções da cabeça em desenvolvimento como células de crista neural de migração precoce ao longo da região do flanco dorsal do embrião. O terceiro gene apresentado para embriões de peixe-caverna, Phf20a, é visto nas porções do mesoderm somático e da cabeça posterior que estão destinados a dar origem ao tecido ósseo. Embriões de peixes superficiais rotulados para CXCR mostram rotulagem positiva em regiões isoladas da cabeça e flanco, bem como algumas células individuais sobreocendo o saco de gema.O gene Adcyap1a é expresso em regiões do sistema nervoso central, incluindo células pituitárias. Observe a expressão altamente específica em agrupamentos bilaterais emparelhados de células no aspecto dorsal do embrião, bem como uma região maior de expressão midline. O último gene examinado para embriões de peixes-caverna, Sox10, é evidente como um marcador inicial de crista neural nos lados esquerdo e direito do embrião dorsal.Depois de completar in situ, normalmente imagem nossos resultados usando microscopia leve. É melhor fazer isso dentro de duas semanas após a conclusão, a fim de evitar a degradação da coloração.

wholemount-in-situ-hybridization-for-astyanax-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Este vídeo demonstra toda montagem imuno-histoquímica, um método pelo qual o padrão de expressão espacial e temporal de um antígeno pode ser visualizada em embriões de galinha jovens. Este método foi originalmente introduzido por Jane Dodd e Tom Jessell.

Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho

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Aprenda a realizar hibridização in situ em embriões de Astyanax mexicanus com mínimo fundo de coloração. Este protocolo simplificado facilita a visualização da expressão gênica em peixes cavernícolas.

Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax

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