Name: ATAC-seq ensaio com DNA mitocondrial baixa contaminação de primária humana CD4 linfócitos T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprenda o protocolo ATAC-seq modificado para linfócitos T CD4+ humanos com novo tampão de lise que reduz a contaminação de DNA mitocondrial de 50% para menos de 3%. Este método diminui os custos de sequenciamento em 50% e foi validado em múltiplos tipos celulares.

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Agradecemos Atsede Siba para suporte técnico. C.S.C é suportado pelo NIH grant 1R61DA047032.

Este protocolo melhorado fornece instruções passo a passo para a realização de ATAC-seq de linfócitos CD4 +, de matérias-primas de sangue total por meio de análise de dados (Figura 1).
1. isolamento de células de CD4 + T do sangue inteiro
Nota: A matéria-prima para este protocolo é de 15 mL de sangue total fresco coletado usando procedimentos padrão, permitindo que a origem da matéria-prima a ser selecionado com base nos requisitos de pesquisa. Escala do protocolo conforme necessário. Pré-aquecer salina tamponada fosfato (PBS) + soro fetal bezerro de 2% (FCS) à temperatura ambiente (RT) e ajustar a centrífuga para RT antes de iniciar o processo de enriquecimento de célula CD4 + T.
<ol><li>Adicionar 15 mL de sangue em um tubo cónico de 50 mL 750 µ l de humana CD4 + células T enriquecimento cocktail e misture suavemente por inversão. Incube a RT por 20 min. Quando a incubação é completa, adicionar 15 mL de PBS + 2% FCS para o tubo e misture suavemente por inversão.</li>
	<li>Prepare um tubo cónico fresco 50 mL com 15 mL de meio de densidade. Cuidadosamente a amostra de sangue diluído até o topo do meio de densidade, certificando-se para não perturbar a interface médio/sangue de densidade que forma da camada. Centrifugar por 20 min em 1.200 x g e RT com aceleração definida como 1 e o travão descendente fora. Nota: É fundamental para definir a aceleração para 1 e decrescente freio fora no centrifugador para evitar o rompimento da camada de células em meio de densidade.</li>
	<li>Colete as células T CD4 + enriquecidas através da interface de médio/plasma densidade utilizando uma pipeta de transferência tronco estreito. Transferi as células coletadas para um tubo de cónico de 50 mL. Centrifugar as células T CD4 + coletadas durante 8 min em 423 x g e RT Nota: Certifique-se de retornar a aceleração centrífuga para freio 9 e decrescente para ON para etapa 1.3 e todas as etapas seguintes.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e lavar o centrifugado duas vezes com 50 mL de PBS + 2% FCS, centrifugação durante 8 min em 423 x g e RT. descartar o sobrenadante final Lave e suspender o centrifugado lavados em 2 mL de PBS + 2% FCS.</li>
	<li>Contar as células usando um hemocytometer. Para continuar com ATAC-seq, siga para o passo 2.3. Para congelar células para mais tarde processar, prossiga para o passo 1.6.</li>
	<li>Adicione 1 mL de meio fresco congelação (FCS 90% + 10% Dimetilsulfóxido) por 1 milhão de células. Alíquotas de 1ml de células no congelamento médio em tubos criogênicos de seguros. Coloque os tubos a-80 ° C durante a noite em um recipiente de congelamento lento. No dia seguinte, transferir os tubos para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. Nota: 1 milhão de células de CD4 + T será isolado por 2 mL de volume original de sangue. Congele a 500.000 células em alíquotas de 1 mL de meio de congelação. Faça meio gelado fresco em cada utilização.</li>
</ol>2. ativar e purificar as células T CD4 +
Nota: Este protocolo rápido para ativar e purificar as células T CD4 + só requer 48 h e resultados em 95% viável, ativadas as células T CD4 +. Legal o centrifugador a 4 ° C antes de iniciar o protocolo.
<ol><li>Descongele 1 frasco (500.000) de células T CD4 + em banho maria a 37 ° C até que o gelo derreteu-se só. Gentilmente transferi células para um tubo cônico de 15 mL, contendo 9 mL de pré-aquecido mídia Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), suplementada com 10% FCS, doravante referida como RPMI completa. Nota: Não deixe células descongelar completamente para evitar exposição a DMSO.</li>
	<li>Centrífuga para 6 min a 1500 x g e 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e suavemente, suspender o sedimento em 2 mL de RPMI completa. Repita o spin para baixo, desprezar o sobrenadante e suavemente suspender as células em 0,5 mL de RPMI completa.</li>
	<li>Conte as células usando um hemocytometer. Ajuste a densidade da suspensão celular com RPMI completa para 50.000 células em 200 µ l por alvéolo de uma placa de fundo redondo de 96 poços da placa. Nota: De um tubo congelado de células T CD4 + de 500K, poços da placa 10 de 50.000 células T CD4 + em 200 µ l por bem.</li>
	<li>
Prepare-se grânulos magnéticos conjugados com anticorpos humanos T-ativador anti-CD3 e anti-CD28.
	<ol>
<li>Alíquota de 12,5 µ l de grânulos de ativador T CD3/CD28 humanos por ATAC-seq amostra para um tubo de 1,5 mL. Lave os grânulos com 1 mL de 1X PBS e colocar o tubo em um ímã para 1 min.</li>
		<li>Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante claro, retire o tubo do ímã e suspender os grânulos em 13 µ l completar RPMI por amostra ATAC-seq. Nota: Calcule a quantidade de contas necessárias com base no número de amostras de ATAC-seq sendo processada. Este protocolo requer 12,5 µ l de CD3/CD28 grânulos por 500.000 células, que constitui um exemplo de ATAC-seq.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ative as células T CD4 +. Coletar 500.000 células em 2,1 mL de meio RPMI completo em um tubo cônico de 15 mL e adicionar 12,5 µ l de grânulos de T-ativador humanos pre-lavados. Misture suavemente por inversão do tubo.</li>
	<li>Delicadamente, transferi as células com grânulos para um estéril reservatório e prato 200 µ l de células com grânulos por poço da placa de 96 poços de fundo redondo com uma pipeta multicanal. Incube durante 48 h a 37 ° C, 5% CO2 incubadora.</li>
	<li>Pós-incubação, centrifugar a placa de 96 poços para 8 min em 423 x g e RT. remover 100 µ l de meio por poço da placa de 96 poços, recolhendo-o para um tubo cônico antes de descartar para não garantir nenhuma perda de talão. Resuspenda o pellet de células nos restantes 100 µ l e coletar tudo em um tubo de 1,5 mL. Nota: 10 poços de células T ativadas serão coletados em um volume de 1 mL.</li>
	<li>Realize isolamento de CD4 +. Adicione 50 µ l de grânulos de CD4 conjugados pre-lavados para 500.000 células em 1 mL de RPMI completa. Combine os grânulos e células com uma pipeta. Incube durante 20 min a 4 ° C, na geladeira. Agite a mistura de célula cada 6 min e grânulos. Nota: Este protocolo é para ser usado para obter um exemplo de 500.000 células. Ajuste como necessário para duas ou mais amostras de 500.000.</li>
	<li>Quando a incubação estiver concluída, coloque o tubo sobre o ímã para 2 min. remover e descartar o sobrenadante quando clara. Lave as células grânulo-limite por retirar o tubo do ímã, suspendendo as células grânulo-limite em 1 mL de PBS + 2% FCS, substituir o tubo sobre o ímã para 1 min e descartar o sobrenadante claro. Repita este processo para um total de 3 lavagens. Nota: Tenha cuidado para não descartar qualquer grânulos durante lavagens.</li>
	<li>Após a lavagem final, coloque o tubo no ímã para 1 min. remover e descartar o sobrenadante e a pelota no gelo. Prossiga para a seção 3 (ATAC-seq).</li>
</ol>3. ATAC-seq
Nota: Nesta etapa, os núcleos estão isolados de células T CD4 + ativadas para ATAC-Seq A Lise utilizado neste protocolo foi melhorada para ser mais suave sobre os núcleos, resultando em uma digestão mais eficiente e resultados de qualidade superiores. Todas as etapas de centrifugação na secção 3 são executadas com uma centrífuga de ângulo fixo, mantida a 4 ° C. Legal da centrífuga antes de iniciar o protocolo.
<ol><li>Realize isolamento núcleos. Resuspenda grânulos e células com tampão de Lise fria (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM de NaCl, MgCl2, 0,03% polissorbato 20 de 3 mM). Centrifugar imediatamente a 500 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Remover e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Realize a reação de transposase. Suspenda o sedimento de núcleos isolados com 50 µ l de mistura de transposase Tn5 (tabela 1). Incube em um thermocycler por 30 min a 37 ° C, com uma tampa de 40 ° C, mantendo a 4 ° C, quando completa.</li>
	<li>Após thermocycling, imediatamente realizar uma rotação de centrífuga de bancada rápido para baixo e colocar o tubo sobre o ímã para 1 min remover os grânulos do produto.</li>
	<li>Transferi o sobrenadante claro do tubo sobre o ímã para uma coluna de purificação de DNA. Lave a coluna com 250 µ l de Buffer PB e duas vezes com 750 µ l de tampão de PE. Eluir a amostra em 10 µ l de tampão de eluição. Siga directamente para o passo 3.5. Nota: Esta etapa amplifica os fragmentos de DNA com os adaptadores ligados, aqui referidos como a biblioteca de ATAC-seq. A fim de multiplexar várias bibliotecas ATAC-seq para ser executado em uma pista NGS, use não indexadas 1 Primer para todas as amostras e um 2 diferente de Primer indexado para amostras individuais (tabela 2). As primeiras demão são usadas em concentrações de 1,25 µM a trabalhar.</li>
	<li>Configurar a reação de amplificação do PCR inicial em um tubo PCR livre de nuclease, combinando os componentes na ordem e volume especificado no tabela 3. Coloque o tubo de PCR para o thermocycler e executar o programa de amplificação do PCR com condições ciclismo conforme especificado na tabela 4.</li>
	<li>
Monitore a reação por qPCR. Configure a reação de qPCR em um tubo PCR livre de nuclease, combinando os componentes na ordem e quantidade especificada na tabela 5. Na máquina de qPCR e ciclo como especificado na tabela 6.
	<ol>
<li>Para determinar que o número ideal de amplificação adicional ciclos para a reação de 45 µ l restantes, crie uma trama com número de ciclo sobre o eixo x e a fluorescência relativa (RFU) no eixo y. O número ideal de ciclos de amplificação adicional é um terço do número de ciclos que leva para a reação de qPCR alcançar o planalto. Nota: A reação de monitoramento por qPCR permite para determinação do número ideal de ciclos PCR desejado para obter amplificação de fragmento biblioteca ideal, minimizando o conteúdo GC e viés de tamanho.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Complete a final amplificação por PCR dos restantes µ 45 l de reação de PCR. Coloque o tubo de PCR com a reação de amplificação da etapa 3.5 no thermocycler e execute o programa conforme descrito na tabela 7. Nota: Para amostras processadas conforme descrito no presente protocolo, o número total ideal de ciclos de amplificação da PCR estava determinado a ser 12.</li>
	<li>Após a amplificação, purifica as bibliotecas usando um kit de limpeza PCR seguindo o protocolo do fabricante, de eluição em 25 µ l de tampão de eluição. Nota: Bibliotecas amplificadas podem ser armazenadas a 4 ° C por até 48 h ou congeladas a-20 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
</ol>4. análise da qualidade ATAC-seq biblioteca
Nota: É importante validar a qualidade e a quantidade de bibliotecas ATAC-seq antes da próxima geração de sequenciamento. A qualidade e a quantidade das bibliotecas devem ser avaliados usando kits comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais).
<ol><li>Avalie a qualidade e quantidade das bibliotecas ATAC-seq usando uma plataforma baseada em microfluídica para dimensionamento, quantificação e controle de qualidade do DNA. Consulte a Figura 2 para resultados de avaliação de qualidade de representante. Nota: A concentração das bibliotecas ATAC-seq deve ser > 1 ng / µ l para obter resultados de sequenciamento de qualidade. Em média, 30 nM em 25 µ l foi obtido.</li>
</ol>5. sequenciamento e análise de dados
Nota: Esse pipeline de análise permite aos usuários controlar a qualidade das leituras procedimento de mapeamento, ajustar as coordenadas para o projeto experimental e chamar picos para análise a jusante. A seguir estão as linhas de comandos e a explicação da execução. O pacote de análise de dados está disponível em (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
<ol><li>Sequencie as bibliotecas preparadas em um sequenciador de geração próxima a uma profundidade média de leitura de 42 milhões de leituras por amostra.</li>
	<li>Estime a qualidade de leituras de sequenciamento, verificando arquivos gerados pelo pacote de software de12 FastQC usando o comando: fastqc -o < output_directory >< fastq_file ></li>
	<li>Aparar as bases de leituras por software de13 Trimmomatic, se necessário, conforme determinado pela verificação de qualidade da FastQC, usando o comando (para par-ended): Java-jar < caminho para o arquivo jar do trimmomatic > PE < input1 >< input2 >< emparelhados Saída1 >< desirmanada Saída1 >< emparelhados output2 >< output2 não pareado > HEADCROP: < bases de culturas ></li>
	<li>Alinhe leituras ao genoma humano referência (hg38) pelo software de14 Bowtie2: bowtie2 - x < genoma de referência > -1 < entrada par 1 >< < arquivo de saída SAM > entrada par 2 > -S Nota: O argumento - x é para o nome de base do índice para o genoma de referência, e -S é para a saída do formato de SAM.</li>
	<li>Verificar a qualidade das leituras mapeadas usando o pacote de flagstat de15 Samtools: samtools flagstat < arquivo BAM ></li>
	<li>Classificar o arquivo mapeado leituras e remover duplicatas usando a ferramenta de16 de Picard: Java-jar picard.jar entrada SortSam = < nome do arquivo SAM entrada > saída = < nome do arquivo de saída classificada BAM > SORT_ORDER = coordenada "e" java-jar picard.jar MarkDuplicates entrada = < classificada BAM arquivo > saída = < arquivo BAM de saída sem duplicatas > REMOVE_DUPLICATES = TRUE</li>
	<li>Arquivo de índice BAM, aparar o cromossomo não utilizados lê e mudar as coordenadas para a razão experimental da ATAC-seq17: Java-jar picard.jar entrada BuildBamIndex = < BAM arquivo > samtools idxstats < arquivo entrada BAM > | corte -f 1 | grep - v chrY | grep - v chrM | grep - v Crespo | xargs samtools Ver os -b < arquivo entrada BAM >>< saída aparadas arquivo BAM > bedtools bamtobed -i < Input aparadas arquivo BAM >>< saída aparadas arquivo cama > awk ' começar {OFS = "\t"}; {se ($6 = = "+") imprimir $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6; imprimir mais US $1, $2-5, r $3-5, $4, $5, $6}' < Input aparadas arquivo cama >< aparado deslocado arquivo cama ></li>
	<li>Exclua as leituras que são deslocadas para coordenação negativa: awk '{se ($2 > 0) imprimir $1 "\t" $2 "\t" $3 "\t" $4 "\t" $5 "\t" $6}' < arquivo entrada cama >< arquivo de cama de coordenação não-negativo de saída >.</li>
	<li>Converta o arquivo de cama para arquivo BAM para análise de18 seguinte DiffBind: bedtools bedtobam -i < arquivo entrada cama > -g < genoma de referência >< arquivo de saída BAM ></li>
	<li>Realizar chamada de pico pelo pacote de software DiffBind18 : macs2 callpeak -t < arquivo entrada BAM > -f BAM -g Sh - nomodel - nolambda..--Mantenha-dup todos..--chamada-cúpulas - outdir < caminho do diretório de saída > - n < nome de saída > -B - q 0,01 - bdg..--turno -100 - extsize 200 Nota: Após a filtragem, espere uma mediana de 37 milhões de leituras por amostra. Contaminação de DNA mitocondrial variam de 0,30% – 5.39% (1,96% em média). Haverá uma baixa taxa de leituras multiplicar mapeadas (6,7% e 56%, 19% em média) e uma percentagem relativamente elevada de utilizável nuclear lê (60%-92%, 79% em média).</li>
</ol>

<ol><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li>
<li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase-seq%3A+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li>
<li>Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq%3A+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li>
<li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAIRE+%28Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements%29+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li>
<li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li>
<li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41(2017).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo modificado de ATAC-seq apresentado neste artigo fornece resultados reprodutíveis com contaminação mínima de DNA mitocondrial. O protocolo tem sido usado para com êxito caracterizam a arquitetura da cromatina de humano primário PBMCs10, humanos monócitos, células dendríticas de rato (não publicadas), e11linhas de células de melanoma culta. Nós antecipamos essa lise melhorada condição tem o potencial de trabalho para outros tipos de células também. Prevê-se também...

O ensaio para transposase-acessível da cromatina sequenciamento (ATAC-seq) rapidamente se tornou o principal método para interrogar a arquitetura da cromatina. ATAC-seq pode identificar regiões da cromatina acessível através do processo de tagmentation, a fragmentação e marcação de DNA pela mesma enzima, para produzir as bibliotecas com o qual sequenciamento pode determinar a acessibilidade de cromatina através de um genoma inteiro. Este processo de tagmentation é mediado pelo transposase Tn5 hiperativo, o que só corta regiões abertas da cromatina devido nucleosomic estérico. Como corta, o transposase Tn5 insere também adaptadores de sequenciamento que permitem a construção de biblioteca rápida por PCR e a próxima geração sequenciamento de genoma-larga acessível cromatina1,2.
ATAC-seq tornou-se o método preferido para determinar as regiões de acessibilidade de cromatina, devido ao protocolo relativamente simples e rápido, qualidade e variedade de informações que podem ser determinadas a partir de seus resultados e a pequena quantidade de material necessário começar. Em comparação com DNase-seq3 (que também mede a acessibilidade de todo o genoma de cromatina), MNase-seq4 (que determina posições nucleossoma em regiões do genoma aberto), e a mediada por formaldeído FAIRE-seq5, ATAC-seq é mais rápido, mais barato e mais reprodutíveis1. Também é mais sensível, trabalhando com material de tão poucos como 500 núcleos, em comparação com os núcleos 50 milhões necessários para DNase-seq3começar. ATAC-seq também tem a capacidade de fornecer mais informações sobre a arquitetura da cromatina que outros métodos, incluindo regiões de ligação do fator de transcrição nucleossoma posicionamento e regiões de cromatina aberta1. Eficazes, single-cell ATAC-seq protocolos validados, fornecendo informações sobre a arquitetura da cromatina na célula única nível6,7.
ATAC-seq tem sido usado para caracterizar a arquitetura da cromatina através de um amplo espectro de tipos de pesquisa e de células, incluindo plantas8humanos9e muitos outros organismos. Também tem sido fundamental na identificação de regulação epigenética da doença Estados7. No entanto, o mais amplamente utilizado ATAC-seq protocolo inclui a grande desvantagem de contaminação leituras de sequenciamento do DNA mitocondrial. Em alguns conjuntos de dados, este nível de contaminação pode ser tão alto quanto 60% de resultados1de sequenciamento. Há um esforço concertado no campo para reduzir essas leituras mitocondriais contaminantes para permitir a aplicação mais eficiente da ATAC-seq7,10,11. Aqui nós apresentamos um protocolo melhorado da ATAC-seq que reduz a taxa de contaminação de DNA mitocondrial de apenas 3%, permitindo a redução de cerca de 50% em custos de sequenciamento10. Isto é feito possível por um processo simplificado de isolamento de linfócitos CD4 + e ativação e um tampão de Lise melhorada que é crítico em minimizar a contaminação de DNA mitocondrial.
Este protocolo modifiedATAC-seq foi validado com uma grande variedade de células primárias, incluindo humano primário do sangue periférico (PBMC) de células mononucleares10humanos primários monócitos e células dendríticas de rato (não publicadas). Ele também tem sido usado com sucesso para interrogar linhas de células de melanoma em uma tela de regularmente intercaladas curta palíndromo repetições (CRISPR) em cluster de elementos não-codificantes11. Além disso, o pacote de análise de dados descritos no presente protocolo e fornecido no GitHub fornece novos e experientes pesquisadores com ferramentas para analisar dados de ATAC-seq. ATAC-seq é o ensaio mais eficaz para mapear a acessibilidade de cromatina através de um genoma inteiro, e modificações no protocolo existente que são introduzidas aqui permitirá que pesquisadores produzir dados de alta qualidade com baixa contaminação de DNA mitocondrial, redução de custos de sequenciamento e melhorar o throughput de ATAC-seq.

<table><tbody><tr><td>1x PBS, Gibco Estéril</td><td></td><td>10010023</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr><tr><td>5810/5810&nbsp; R Balde Oscilante Centrífuga Refrigerada com Baldes de Tubo de 50 mL, 15 mL e 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr><tr><td>96 Placa de Fundo Redonda de Poço</td><td>Thermo Scientific</td><td>163320</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr><tr><td>Sistema de estação de fita Agilent 4200</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>Sugerido para avaliação de qualidade.</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>374081</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11131D</td><td>Componente Crítico</td></tr><tr><td>Dynabeads Kit de Células T CD4 Humanas Intocadas</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11346D</td><td>Componente Crítico</td></tr><tr><td>Dynamagnet</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>12321D</td><td>Componente Crítico</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-500</td><td>Pode usar outros comparáveis Produtos.</td></tr><tr><td>Kit de DNA de alta sensibilidade</td><td>Agilent</td><td>50674626</td><td>Sugerido para avaliação de qualidade.</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio, hexahidratado, grau de biologia molecular</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR MinElute (tampão PB, tampão PE, tampão de eluição)</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Componente crítico</td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr><tr><td>NaCl, Grau de Biologia Molecular</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr><tr><td>NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541</td><td>Componente Crítico</td></tr><tr><td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td><td>Illumina</td><td>FC1211030</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>Nuclease Free Sterile dH20</td><td>Gibco</td><td>10977015</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr><tr><td>Polissorbato 20 (Tween20)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25780</td><td>Componente Crítico</td></tr><tr><td>Precisão Banho de Água</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSGP02</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Componente crítico</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensaio</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>Q32851</td><td>Sugerido para avaliação de qualidade.</td></tr><tr><td>Qubit FlouroMeter</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>Q33226</td><td>Sugerido para avaliação de qualidade.</td></tr><tr><td>Roseta Sep Densidade Humana CD4+ Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td>Componente Crítico</td></tr><tr><td>Roseta Sep Enriquecimento Humano CD4+ Coquetel</td><td>Tecnologias de Células-Tronco</td><td>15022</td><td>Componente Crítico</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr><tr><td>Reservatório Estéril</td><td>Thermo Scientific</td><td>8096-11</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr><tr><td>Termociclador T100 com tampa aquecida</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Pode usar outros produtos comparáveis.</td></tr></tbody></table>

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ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq tornou-se uma metodologia amplamente utilizada no estudo da epigenética, devido à sua abordagem rápida e simples de mapear todo o genoma de cromatina acessível. Neste trabalho apresentamos um protocolo melhorado de ATAC-seq que reduz contaminando leituras de DNA mitocondriais. Enquanto o anterior ATAC-seq protocolos têm lutado com uma média de 50%, contaminando o DNA mitocondrial lê, a Lise otimizado introduzido neste protocolo reduz contaminação de DNA mitocondrial de uma média de 3%. Este protocolo ATAC-seq melhorado permite a quase 50% de redução do custo de sequenciamento. Vamos demonstrar como essas bibliotecas de ATAC-seq de alta qualidade podem ser preparadas de linfócitos CD4 + ativados, fornecendo instruções passo a passo do isolamento de linfócitos CD4 + de sangue total através da análise de dados. Este protocolo ATAC-seq melhorado foi validado em uma ampla gama de tipos de células e será de uso imediato para pesquisadores estudando acessibilidade de cromatina.

De 15 mL de sangue total fresco, este protocolo gera uma média de 1 milhão de células de CD4 + T. Estes podem ser congelados para mais tarde processar ou usados imediatamente. Viabilidade das células T CD4 +, frescas ou descongeladas, foi consistentemente &gt; 95%. Este método de isolamento de célula CD4 + T permite flexibilidade no tempo de material e a coleção de origem. Este protocolo ATAC-seq melhorado produz uma biblioteca final de mais de 1 ng / µ l para o sequenciamento. Controle d...

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar um ensaio de cromatina transposase-acessível sequenciando (ATAC-seq) em linfócitos humanos registrados CD4 +. O protocolo foi modificado para minimizar contaminando leituras de DNA mitocondriais de 50% para 3%, através da introdução de um novo buffer de Lise.

ATAC-seq ensaio com DNA mitocondrial baixa contaminação de primária humana CD4 linfócitos T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Este protocolo ATAC-seq modificado introduz um novo tampão de lise que diminui a contaminação das leituras mitocondriais de 50% para menos de 3%A diminuição da contaminação mitocondrial permitirá aos pesquisadores realizar um ATAC-seq mais eficiente com uma redução de 50% nos custos de sequenciamento. Validamos este novo protocolo ATAC-seq em PBMCs primários humanos, monócitos primários humanos, células dendríticas de camundongos e linhas celulares de melanoma. Acreditamos que será eficaz em uma ampla gama de tipos de células.Minimizar a perda de amostras durante o processo de ativação e seleção celular é fundamental para obter resultados de alta qualidade com ATAC-seq. Vamos demonstrar como lidar com um pequeno número de células de amostras preciosas usando equipamentos básicos de laboratório. Para começar, descongele um frasco de células CD4+T anteriormente isoladas em um banho de água Celsius de 37 graus até que o gelo derreta.Em seguida, transfira suavemente as células para um tubo cônico de 15 mililitros contendo nove mililitros de RPMI completo pré-aquecido. Centrifugar as células a 1.500 vezes G, e quatro graus Celsius, por seis minutos. Em seguida, descarte o supernasce e retire suavemente a pelota em dois mililitros de RPMI completo.Depois de repetir a centrifugação, descarte o supernasce e resuspenque suavemente as células em 0,5 mililitros de RPMI completo. Use um hemótmetro para contar as células. Usando RPMI completo, ajuste a densidade de suspensão celular para a placa 50,000 células CD4+em 200 microliters por poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços.Em seguida, para preparar contas magnéticas, alíquota de 12,5 microliters de contas Humanas T-Activator CD3/CD28 por amostra ATAC-seq para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de 1x PBS ao tubo, e coloque-o em um ímã por um minuto para lavar as contas. Remova e descarte cuidadosamente o supernanato claro e remova o tubo do ímã.Resuspenja as contas em 13 microliters de RPMI completo por amostra ATAC-seq. Para ativar as células CD4+T com a concentração ajustada, colete 500.000 células em 2,1 mililitros de meio RPMI completo em um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione 12,5 microliters de contas T-Activator Humanas, preparados e lavados em etapas anteriores, e misture suavemente invertendo o tubo.Em seguida, transfira suavemente as células, com contas, para um reservatório estéril. Usando uma pipeta multicanal, placa 200 microliters de células com contas por poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços, e incubar em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de CO2 por 48 horas. Após a incubação completa, centrifufique a placa a 423 vezes G, e temperatura ambiente, por oito minutos.Remova 100 microliters de meio de cada poço e colete-o em um tubo cônico antes de descartar, a fim de confirmar nenhuma perda de contas. Em seguida, resuspenja a pelota celular nos 100 microliters restantes de médio, e colete tudo em um tubo de 1,5 mililitro. Para isolar as células CD4+, adicione 50 microliters de contas conjugadas CD4 pré-lavadas a 500.000 células em um mililitro de RPMI completo, e inverta para misturar.Incubar por 20 minutos a quatro graus Celsius, enquanto aperta a mão a cada seis minutos para misturar. Coloque o tubo sobre o ímã por dois minutos, até que o supernasce esteja limpo e, em seguida, remova e descarte. Remova o tubo do ímã.Lave as células ligadas a contas reutilizando-as em um mililitro de PBS, mais 2% FCS, e coloque o tubo de volta no ímã por um minuto. Descarte o supernatante claro e repita este processo para um total de três lavagens. Após a lavagem final, coloque o tubo no ímã por um minuto.Remova-o, descarte o supernasce e coloque a pelota no gelo. Em seguida, para realizar o isolamento dos núcleos, resuspensar as contas e células em 50 microliters de tampão de lise fria, e centrífuga imediatamente a 500 G, quatro graus Celsius, por 10 minutos. Remova e descarte o supernaspe.Para realizar a reação transposase, resuspenja a pelota de núcleos isolados com 50 microliters de mistura de transposase Tn5. Incubar em um termociclador por 30 minutos a 37 graus Celsius, com a tampa definida para 40 graus Celsius, e depois manter a quatro graus Celsius quando completa. Imediatamente após o termociclismo, realize um rápido spin-down de centrífuga de bancada.Coloque o tubo sobre o ímã por um minuto para remover as contas do produto. Sem remover o tubo do ímã, transfira o supernatante claro para uma coluna de purificação de DNA. Lave a coluna uma vez com 250 microliters de tampão PB, e duas vezes com 750 microliters de tampão pe.Em seguida, adicione 10 microliters de tampão de elução para eluto da amostra. Configure a reação inicial de amplificação do PCR em um tubo PCR sem nuclease. Coloque o tubo PCR no termociclador e execute o programa de amplificação do PCR.Em seguida, complete a amplificação final do PCR dos 45 microliters restantes da reação pcr, conforme descrito no manuscrito. Coloque o tubo PCR no termociclador e execute o programa. Após a amplificação completa, purifique as bibliotecas usando um kit de limpeza PCR, seguindo o protocolo do fabricante, eluindo em 25 microliters do buffer de elução.Sequencie as bibliotecas preparadas em um sequenciador de próxima geração para uma profundidade de leitura média de 42 milhões de leituras por amostra. Este protocolo ATAC-seq melhorado produziu uma biblioteca final de mais de um nanograma por microliter para sequenciamento. O controle de qualidade mostrou fragmentos de DNA entre 200 e 1.000 pares de base, e mais sequenciamento foi realizado com essas bibliotecas de alta qualidade.As bibliotecas preparadas seguindo este protocolo mostraram apenas 3% de contaminação mitocondrial. A alta porcentagem de leituras utilizáveis é suficientemente constante em todas as réplicas biológicas. Este protocolo forneceu resultados altamente reprodutíveis através de réplicas técnicas, bem como réplicas biológicas.Além disso, este protocolo levou 48 horas, em vez de uma semana ou mais como descrito anteriormente, resultando em ativação consistente e eficiente, como demonstrado pelos resultados de sequenciamento reprodutível. Além disso, os picos atac-seq previstos foram chamados com precisão pelo pipeline de análise. A análise do resultado do sequenciamento revelou mudanças claras no estado da cromatina durante a ativação da célula T humana.Foram identificadas regiões de cromatina aberta entre seis amostras antes e 48 horas após a ativação. Certifique-se de que a reação de lise dos núcleos seja realizada com reagentes e materiais refrigerados, a fim de maximizar a recuperação de núcleos intactos. Nosso tampão de lise de núcleos modificados é mais suave nas células, e minimiza contaminar o DNA mitocondrial.Estamos ansiosos para que este tampão de lise modificado seja aplicado em núcleos únicos ATAC-seq também. Sabemos que este protocolo permitirá que os pesquisadores produzam dados ATAC-seq de maior qualidade a um custo reduzido, ajudando a encaminhar o campo epigenético. O protocolo é simples, rápido e não requer reagentes ou instrumentos perigosos, tornando-o facilmente acessível para aqueles novos para ATAC-seq.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Ensaio de cromatina Transposase-acessível, juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) é um método de todo o genoma para descobrir a cromatina acessível. Este é um protocolo de ATAC-seq passo a passo, de molecular para última análise computacional, otimizada para linfócitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo pode ser adotado por pesquisadores sem experiência prévia em métodos de sequenciamento de próxima geração.

Mapeamento de genoma-larga acessível cromatina em linfócitos T humana primária pela ATAC-Seq

Aqui nós descrevemos um método passível de dosar simultaneamente e ribonucleotídeos mapa de todo o genoma em DNA altamente intacta na resolução de single-nucleotide, combinando a clivagem enzimática do DNA genômico com sua hidrólise alcalina e subsequente 5´-final sequenciamento.

Mapeamento simultâneo e quantificação de ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano

A adaptação metabólica é fundamental para as células T, pois dita diferenciação, persistência e citotoxicidade. Aqui, é apresentado um protocolo otimizado para monitorar a respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas ex vivo .

Monitoramento em tempo real da respiração mitocondrial em células T primárias humanas diferenciadas por citocinas

Aqui apresentamos um protocolo para medir o número absoluto de cópias mitocondriais (mt)DNA e os níveis de heteroplasmia de deleção do mtDNA em células únicas.

Medindo o Número de Cópias de DNA Mitocondrial de Célula Única e a Heteroplasmia Usando a Reação em Cadeia da Polimerase de Gotículas Digitais

ATAC-seq é um método de sequenciamento de DNA que usa a transposase mutante hiperativa, Tn5, para mapear mudanças na acessibilidade da cromatina mediadas por fatores de transcrição. O ATAC-seq permite a descoberta dos mecanismos moleculares subjacentes às alterações fenotípicas nas células cancerígenas. Este protocolo descreve procedimentos de otimização para ATAC-seq em tipos de células epiteliais, incluindo células cancerígenas.

Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer

Os ensaios de pirosequenciamento permitem a genotipagem robusta e rápida de polimorfismos de nucleotídeo único do DNA mitocondrial em células ou tecidos heteroplasmáticos.

Genotipagem de Polimorfismos de Nucleotídeo Único no Genoma Mitocondrial por Pirosequenciamento

Este protocolo descreve uma técnica para geração de cybrid a partir de células cancerosas em crescimento em suspensão como uma ferramenta para estudar o papel das mitocôndrias no processo tumorigênico.

Geração de Cybrid Transmitochondrial Usando Linhas de Células Cancerígenas

Um procedimento para estudar a dinâmica do metabolismo do DNA mitocondrial (mtDNA) em células usando um formato de placa multi-poço e imagens automatizadas de imunofluorescência para detectar e quantificar a síntese e distribuição do mtDNA é descrito. Isso pode ser usado para investigar os efeitos de vários inibidores, estresses celulares e silenciamento gênico no metabolismo do mtDNA.

Quantificação baseada em imagens de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial

A bioenergética de células T CD8 pode ser interrogada usando o Teste de Estresse Mito. Essa metodologia pode ser usada para estudar a programação metabólica aguda e crônica. Este protocolo descreve abordagens para examinar as relações entre a biologia do receptor de células T e a análise bioenergética.

Medindo a função mitocondrial de células T CD8 virgens e efetoras

Os métodos para estudar a bioenergética mitocondrial sob concentrações de substrato fisiologicamente relevantes em células imunes são limitados. Fornecemos um protocolo detalhado que usa fluorespirometria de alta resolução para avaliar as mudanças na resposta do potencial da membrana mitocondrial à demanda de energia em células T humanas, monócitos e células mononucleares periféricas.

Fluorespirometria de alta resolução para avaliar mudanças dinâmicas no potencial da membrana mitocondrial em células imunes humanas

Este manuscrito descreve um protocolo para preparar uma biblioteca ATAC-seq de neutrófilos da medula óssea murina, com o objetivo de garantir a viabilidade ideal dos neutrófilos e a alta qualidade da biblioteca. Ele oferece instruções passo a passo sobre a preparação do BMC, classificação imunomagnética e construção de bibliotecas, servindo como um guia valioso, especialmente para iniciantes no estudo de neutrófilos.

Biblioteca ATAC-Seq Preparação de neutrófilos derivados da medula óssea murina

Aprenda o protocolo ATAC-seq modificado para linfócitos T CD4+ humanos com novo tampão de lise que reduz a contaminação de DNA mitocondrial de 50% para menos de 3%. Este método diminui os custos de sequenciamento em 50% e foi validado em múltiplos tipos celulares.

ATAC-seq ensaio com DNA mitocondrial baixa contaminação de primária humana CD4 linfócitos T

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