Name: Uso da tecnologia de MHC única cadeia para investigar Co-Genealogia na ativação de células T humanas CD8 + (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Aprenda a usar complexos MHC de cadeia única para investigar co-agonismo na ativação de células T CD8+ humanas. Este método utiliza células CHO e clones CTL para estudar respostas imunes contra hepatite B.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo National Medical Research Council do Ministério da saúde a Singapore sob seu CBRG/0064/2014 para N.R.J.G., por criar sob seu R571-002-012-592 ao P.A.M., National Research Foundation Investigatorship R571-000-272-281 para P.A.M . e por um prêmio de investigador de pesquisa translacional (estrela) Singapura (NMRC/STaR/013/2012) de A.B. Nós estamos gratos ao Dr. Paul Hutchinson e Sr. Teo Guo Hui de instalação de núcleo de fluxo de programa NUS imunologia para a classificação de célula especializada. Nós estamos gratos ao Elijah Chen para uma leitura crítica do manuscrito.

Nota: Todas as etapas que envolvem o uso de células vivas, não fixa deve ser executado em uma capa de biossegurança, e quaisquer resíduos biológicos perigosos devem ser descartados de acordo com os regulamentos locais de saúde e segurança.
1. CHO Cell Transfection e geração de linhas de células CHO estável
<ol><li>
Transfecção de células CHO Nota: esta seção descreve a transfecção de células CHO usando o polyethylenimine (PEI). No entanto, os métodos alternativos podem ser usados, como células CHO são relativamente fáceis de transfect usando reagentes de transfecção de lipídios disponíveis comercialmente.<ol>
<li>Células de cultura CHO em F12 completa (cF12, F12 suplementado com 5% FBS, 100 penicilina U/mL, 100 μg/mL Estreptomicina e blasticidin de 10 µ g/mL para manter a expressão do repressor a tetraciclina). Passagem de células a cada 3-4 dias em um 01:10 proporção.</li>
		<li>Um dia antes de transfeccao, prepare a suspensão de células CHO. Células CHO lavar o balão com PBS (10 mL de PBS para um balão de T75, 5 mL de PBS para um frasco T25). Adicionar 0,05% Trypsin/0.02% EDTA em PBS (2 mL para um balão de T75, 1 mL para um balão de T25) ao balão e incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente (RT). Usando um microscópio de luz, verificar que as células têm destacado e parem tripsinização adicionando cF12 no balão (8 mL para um balão de T75, 4 mL para um balão de T25).</li>
		<li>Transferir a suspensão de células CHO para um tubo de 15 mL e centrifugação a 300-400 x g por 5 min a 4 ° C ou RT. Remove sobrenadante, re-suspender em cF12 (10 mL para um balão de T75, 5 mL para um balão de T25) e contar usando um hemocytometer.</li>
		<li>Ajuste a concentração de células CHO de 60.000-100.000 células/ml. Adicione 5 mL de suspensão de células CHO (células CHO de 300.000-500.000) por bem em um prato bem 6. Incube durante uma noite a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>No dia do transfection, adicione 400 μL de soro livre F12 mídia ou mídia de baixo soro a um tubo de 1,5 mL. Adicione 3 μg de plasmídeo de 400 μL de mídia. Misture por pipetagem. Adicionar 6 μg de PEI (6 μL de solução de 1 mg/mL PEI) à mistura de mídia/DNA, e o vórtice imediatamente por 10 s.</li>
		<li>Incube o mix de mídia/DNA/PEI em RT para 10-15 min. Durante esta incubação, substitua a mídia de células CHO no prato bem 6 com 5 mL de mídia cF12 fresco.</li>
		<li>Adicione a solução de mídia/DNA/PEI às células CHO. Adicione a solução gota a gota e uniformente sobre o poço. Incube durante uma noite a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Geração de linhas de células CHO estáveis
	<ol>
<li>Um dia depois de transfeccao, remova a mídia dos poços e adicionar 5 mL de cF12 contendo antibióticos seleção apropriada para cada poço. Use hptII de 0,3 mg/mL para plasmídeos baseada em pcDNA5TO e geneticin de 1 mg/mL para plasmídeos pcDNA3-baseado.</li>
		<li>Se as células de alcance mais de confluência de 90% em 24 h postar transfeccao, trypsinize as células.</li>
		<li>Lavar os poços com 1 mL de PBS por alvéolo, adicionar 1 mL de 0.05% trypsin/0.02% EDTA em PBS e incubar durante 5-10 min a RT. usando um microscópio de luz, verificar que as células têm destacado e parem tripsinização adicionando 3-4 mL de cF12 por bem.</li>
		<li>Transferir a suspensão de células CHO para um tubo de 15 mL e centrifugar a 300-400 x g por 5 min a 4 ° C ou RT. remover o sobrenadante e ressuspender em 10 mL de cF12. Adicione 5 mL de suspensão de células por poço em 6 placa bem. Use dois poços para maximizar o rendimento das células transfectadas.</li>
		<li>Incube as placas bem 6 a 37 ° C, 5% de CO2. Monitorar a morte celular e o crescimento de colônias resistentes, usando um microscópio de luz. Remova a mídia e substituí-lo com mídia fresca contendo os antibióticos adequados após 4-5 dias, ou quando a morte celular significativo é observado.</li>
		<li>Uma vez que as células resistentes ao alcance mais de 70% confluência, trypsinize as células conforme descrito na etapa 1.2.2 e transferir para um balão de T25 para expansão. A seleção de antibióticos leva 1-2 semanas.</li>
		<li>Uma vez que as células CHO resistentes aos antibióticos no frasco T25 alcança a confluência de 70-80%, realize a mancha do anticorpo para verificar a expressão de superfície celular das construções de interesse. Um dia antes mancha do anticorpo, trypsinize as células conforme descrito na etapa 1.2.2 e ajustar a concentração de células para 200.000 cels/mL e adicionar 1 mL de suspensão de células para 12 placa bem. Para o teste das construções de tetraciclina-inducible, adicione 50-60 ng/mL de tetraciclina. Incube durante uma noite a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>Use o raspador de célula para desanexar células CHO do fundo do poço. Este método é preferível a tripsinização, que reduz o risco de danos de epítopo devido à clivagem proteolítica.</li>
		<li>Transferi a 1 mL de mídia que contém as células CHO para um tubo de FACS. Spin para baixo a 300-400 x g, 4 ° C por 5 min. Ressuspender em 100 μL do anticorpo anti-HLA diluído em FWB. Incube 30 min a 4 ° C no gelo. Executar esta mancha com anticorpo anti-A2 para detectar níveis de expressão de superfície de célula A2 totais e TCR-como anticorpo específico para A2 em complexo com E183 peptídeo para detectar agonista pMHC-níveis de expressão de superfície de célula.</li>
		<li>Depois de verificar a expressão de MHC, FACS-classificar as células positivas e manter as células classificadas em meios com antibióticos para reduzir a perda de transgene. Para células CHO expressando agonista pMHC, única célula de triagem, para garantir recomenda agonista comparável pMHC expressão com e sem supertransfection com agonista co pMHC. 2-3 semanas são necessárias para o crescimento de células CHO, seguindo a classificação de célula única.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. HBV-específicas CTL cultura
<ol><li>
Preparação de PBMC como alimentadores para re-estimulação da CTL específicas HBV humana Nota: para o clone CTL A2-E183-específico, re-estimulação com PBMC recentemente isolada, ao invés de PBMC descongelado, dá os melhores resultados. Atenção: Obter todas as aprovações éticas necessárias antes de recrutar voluntários para a doação de sangue. Para efeitos deste trabalho, PBMC foram coletados de voluntários saudáveis, sob o protocolo aprovado pelo IRB NUS. Foi obtido o consentimento de todos os doadores. Siga todas as precauções necessárias quando se trabalha com sangue humano para reduzir o risco de transmissão de doenças de sangue.<ol>
<li>Antes de iniciar, defina a temperatura de centrifugação em 19-20 ° C e pré-aquecer o gradiente de densidade (por exemplo, Ficoll) para RT</li>
		<li>Adicione 15 mL de gradiente de densidade de temperatura para tubo de 50 mL. Centrifugar a 400 x g por 5 min em 19-20 ° C. Isso é para garantir que não há nenhum gradiente de densidade na parte lateral do tubo.</li>
		<li>Recolha 20 mL de sangue de um doador voluntário saudável através de punção venosa. Adicione 15 mL de PBS a 20 mL de sangue em um tubo de 50 mL. Misture pipetando para cima e para baixo.</li>
		<li>Lentamente, adicione a 35 mL de sangue diluído em PBS em cima a 15 mL de gradiente de densidade da etapa 2.1.2. Certifique-se de que o sangue e o gradiente de densidade não se misturam. Centrifuga os tubos a 19 ° C, 1.200 x g por 20 min com os freios fora.</li>
		<li>Remova aproximadamente 70% da camada de plasma. Aspire cuidadosamente com a camada que contém o PBMC (o nublado layer acima da layer de gradiente de densidade clara) usando uma Pasteur pipeta e colocá-lo em um novo tubo de 50 mL.</li>
		<li>Adicione PBS PBMCs para obter um volume total de 50 mL. Centrifugar o tubo a 4 ° C, 300-400 x g por 10 min. Retire com cuidado o sobrenadante usando o aspirador de vácuo e vidro estéril pipeta Pasteur, ou por decantação.</li>
		<li>Ressuspender as células em 50 mL de PBS. Centrifugar o tubo a 4 ° C, 300 x g por 10 min. Retire com cuidado o sobrenadante usando o aspirador de vácuo e vidro estéril pipeta Pasteur, ou por decantação.</li>
		<li>Ressuspender as células em 2 mL de célula T humana completa mídia (meios livres de soro suplementados com 2% de soro humano). Conte as células usando hemocytometer. Este protocolo dá em média 1-2 x 106 PBMC por 1 mL de sangue utilizado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Re-estimulação CTL usando PBMCs como células do alimentador
	<ol>
<li>Irradiar PBMCs em 30 Gy para inibir a proliferação em resposta à estimulação subsequente. Atenção: Certifique-se de formação adequada e o cumprimento do laboratório requisitos de segurança ao usar o irradiador.</li>
		<li>Ressuspender os PBMCs irradiados em mídia de célula T humana completa em 2 x 106 células/mL. Adicione citocinas e lectina de Phaseolus vulgaris (PHA) para a re-estimulação de CTL na concentração de x 2 para a suspensão PBMC. O cytokine final e concentrações de PHA são: 20 U/mL recombinante humano Il-2, 10 recombinante ng/mL IL-7, 10 ng/mL recombinante humano IL-15 e 1,5 mg/mL PHA.</li>
		<li>Descongele o frasco CTL congelado em banho maria a 37 ° C. Transferi as células descongeladas em um tubo de 15 mL com 10ml de mídia de célula T humana completa. Spin para baixo a 300-400 x g a 4 ° C por 5 min. Retire com cuidado o sobrenadante usando o aspirador de vácuo e vidro estéril pipeta Pasteur, ou por decantação.</li>
		<li>Re-suspenda CTLs em 2 mL de mídia de célula T humana completa. Conte as células usando hemocytometer. Adicione mídia de célula T humana completa, para obter a concentração de células de 106 células/mL.</li>
		<li>Em um prato bem 24, adicionar 0,5 mL de PBMC irradiado (106 células) com 2 x cytokines PHA (etapa 2.2.2) e 0,5 mL de listas de certificados confiáveis (0,5 x 106 células) por poço. O número de poços utilizado depende do número total de listas de certificados confiáveis ou PBMCs disponíveis. Incube a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>Depois de 4-5 dias, quando explosões CTL são visíveis e os meios de comunicação torna-se amarelo, transferir as culturas para 6 placas bem e completar o volume inicial de 1 mL com 4 mL de mídia de célula T humana completa com 20 U/mL IL-2, IL-7 de 10 ng/mL e 10 ng/mL (não PHA) IL-15.</li>
		<li>Após 2-3 dias, as culturas de transferência para um balão de T75, adicionar 40 mL de mídia de célula T humana completa com citocinas (etapa 2.2.2, não PHA) e cultura em uma posição ereta.</li>
		<li>Manter CTLs na concentração de 1-2 x 106 células/mL adicionando mídia fresca suplementada com citocinas (etapa 2.2.2, não PHA) em um volume igual do volume de cultura existente em todos os outros dias. Listas de certificados confiáveis podem ser usadas para experimentos 7-14 dias após re-estimulação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. células T experimentos de ativação
Nota: Um experimento típico requer várias linhas diferentes de T-RExCHO: untransfected T-REx CHO células (controle negativo), T-REx CHO células expressando não-estimulatórios pMHC apenas (scA2-GAG; controlo negativo), T-REx CHO células expressando quantidades baixas de agonista pMHC-eu ( scA2-ENV sem tetraciclina, amostra experimental), T-REx CHO células expressando quantidades baixas de agonista pMHC e quantidades elevadas de pMHC não-estimulatórios agonista co (scA2-ENV e scA2-GAG, sem tetraciclina, amostra experimental), e as células T-REx CHO expressar quantidades elevadas de agonista pMHC-eu scA2-ENV com tetraciclina, controle positivo), conforme mostrado na Figura 1D.
<ol><li>
Chapeamento de células CHO como células de apresentação de antígeno
	<ol>
<li>Células de cultura CHO T75 balão, conforme descrito na etapa 1.1.1. Use células na confluência de 70-90% para obter melhores resultados. Experimentar um dia antes da ativação de células T, trypsinize as células conforme descrito na seção 1.1.2. Após tripsinização, transferir a suspensão de células para um tubo de 15 mL, centrifugar 400 x g por 5 min a 4 ° C ou RT, remover o sobrenadante por pipetagem ou decantação.</li>
		<li>Ressuspender o sedimento celular em 5 mL de cF12. Contar as células CHO usando um hemocytometer.</li>
		<li>Ajuste a concentração de células de 2 x 105/mL usando cF12. Adicionar 50-60 ng/mL de tetraciclina para o agonista apenas amostras para induzir quantidades elevadas de agonista pMHC-eu expressão como controle positivo (Figura 1). Células CHO vão acalmar em tubos de 15 mL, então certifique-se de misturá-los a pipetagem ou num Vortex antes do chapeamento.</li>
		<li>Para o ensaio da ativação de células T, adicionar 100 μL da suspensão de células de CHO por bem a placa bem fundo U 96 e usar triplica por linhagem de células CHO. Para CHO celular anti-MHC de coloração, adicionar 1 mL de suspensão de células para 12 placa bem e usar triplica por linha celular. Incube durante uma noite a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensaio de ativação de células t Nota: este ensaio de ativação de célula T permite a quantificação simultânea de degranulação de célula T (coloração de CD107a, uma medida de citotoxicidade de células T) e produção de citocinas.<ol>
<li>O dia antes do experimento, centrifugue CTLs células a 400 x g a 4 ° C por 5 min, contar usando hemocytometer e ressuspender as células em 106 células/mL em meios de célula T humana completa sem citocinas ou PHA. Incube a 37 ° C, 5% de CO2. A finalidade desta etapa de resto é a reduzir a sensibilidade do CTL, como temos observado máxima ativação em resposta a pequenas quantidades de antigénio sem esta etapa.</li>
		<li>No dia do experimento, centrífuga T células a 400 x g a 4 ° C por 5 min, retire o sobrenadante por decantação ou pipetagem e ressuspender as células em meios de soro livre completa 2 mL (sem citocinas ou PHA). Contar as células de T ao vivo usando um hemocytometer e ajustar a concentração de células T a 106 ao vivo células/mL usando a mídia de célula T humana completa (sem citocinas ou PHA).</li>
		<li>Adicione o anticorpo de CD107a anti-humano a uma diluição de 1: 100 (concentração final de 2,5 μg/mL), adicione brefeldin A uma diluição de 1: 1000 (concentração final de 1 μg/mL).</li>
		<li>Remova a mídia de células CHO em placa de 96 bem por aspiração com uma pipeta Pasteur de vidro ou por agredir a chapa. Por bem, acrescentar 200 μL de células T suspensão (0,2 x 106 células) contendo anti-CD107a e brefeldin A. co-cultura T células com células CHO para 3-4 h.</li>
		<li>No final da cultura co, realize a coloração de antigénio de superfície de células T. Spin para baixo a placa bem a 300-400 x g96, 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante por aspiração ou passar rapidamente. Adicione 2,5 μL de CD3 e 2,5 μL de anticorpos CD8 em 50 μL de BSA de 0,5% em PBS (tampão de lavagem do fluxo, FWB) por alvéolo para coloracao de antígeno de superfície celular. Incube as amostras no gelo por 30 min no escuro.</li>
		<li>Lave as amostras adicionando 150 μL de FWB por bem. Spin para baixo a placa bem a 300-400 x g96, 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante por aspiração ou passar rapidamente.</li>
		<li>Execute as etapas de fixação/permeabilização usando um kit de fixação/permeabilização. Adicione 100 µ l de solução de permeabilização/fixação (do kit de fixação/permeabilização) por alvéolo, misture pipetando. Incube no gelo por 20 min.</li>
		<li>Centrifugação a 300-400 x g e 4 ° C por 5 min e remover o sobrenadante por aspiração ou passar rapidamente. Adicionar 200 μL de tampão de lavagem de perm/1x (diluir o 10x buffer de estoque perm/lavagem do antes kit da utilização) por poço. Repita este passo.</li>
		<li>Ressuspender o sedimento celular em 50 μL de tampão de perm/lavagem x 1 contendo anticorpos anti-IFN-γ em 0,3 μg/mL. Incube no gelo por 30 min no escuro.</li>
		<li>Adicione 150 μL de tampão de perm/lavagem 1X. Centrifugar a 300-400 x g durante a 4 ° C por 5 min e remover o sobrenadante por aspiração ou passar rapidamente. Adicione 200 μL de tampão de lavagem/perm, 1x centrifugar 300-400 x g durante a 4 ° C por 5 min e retire o sobrenadante por aspiração ou passar rapidamente.</li>
		<li>Re-suspenda cada amostra em 200 μL de FWB. Prosseguir com a análise do fluxo cytometric.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CHO células MHC classe I de coloração Nota: é fundamental para verificar scMHC-eu celular níveis de superfície em células utilizadas em cada experimento, como linhas de células podem perder a expressão do transgene. Ao preparar o prato bem 96 para a estimulação de células T, configurar placa bem 12 para coloração de células CHO, conforme descrito na seção 3.1.4.<ol>
<li>Use um raspador de célula para desanexar células CHO do fundo do poço. Este método é preferível a tripsinização, que reduz o risco de danos de epítopo devido à clivagem proteolítica.</li>
		<li>Transferi a 1 mL de mídia contendo as células CHO ao tubo de FACS. Spin para baixo a 300-400 x g a 4 ° C por 5 min. Ressuspender em 100 μL do anticorpo anti-HLA diluído em FWB. Incube durante 30 min a 4 ° C no gelo.<ol>
<li>Executar esta mancha com anticorpo anti-A2 para detectar níveis de expressão de superfície de célula A2 totais e TCR-como anticorpo específico para A2 em complexo com E183 peptídeo32 para detectar agonista pMHC-níveis de expressão de superfície de célula.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adicionar 1 mL de FWB para cada amostra CHO, spin para baixo a 300-400 x g, 4 ° C, 5 min e então re-suspender a amostra em 0,3 mL de FWB. Prosseguir com a análise de citometria de fluxo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores declaram não interesses concorrentes.

O protocolo apresentado fornece uma ferramenta robusta para a investigação de interações moleculares durante a ativação de células T CD8 + humana. Um passo crítico para a investigação de co-genealogia durante a ativação de células T humanas é o controle sobre a expressão superficial de agonista pMHC célula para garantir igual agonista pMHC apresentação sobre as APCs com ou sem expressão de agonista co pMHC. Em nosso sistema experimental, isto é conseguido usando um clone de célula única expressando quantidades baixas de agonista pMHC, seguido de supertransfection com um agonista co pMHC construção e agonista pMHC quantificação usando anticorpo TCR-como10, 32. como expressão de pMHC sc agonista pode mudar ao longo do tempo, é fundamental para quantificar agonista pMHC superfície expressão APCs usados em cada experimento usando TCR-como anticorpos. Se nenhum anticorpo específico de TCR-como está disponível, agonista scMHC-podem ser expressas como fusão de proteína fluorescente, e sua expressão de superfície de célula pode ser quantificada em seguida, usando um método de microscopia sensíveis, tais como a microscopia de fluorescência de reflexão interna total 35 , 36. Além disso, a expressão de superfície celular de agonista co pMHC diminui ao longo do tempo, devido a dependente de metilação e - independente de silenciamento da CMV promotor37e deve ser monitorado usando anticorpo manchando e fluxo cytometry análise, com repetidos FACS-classificação quando necessário. Nós ter cultivado células CHO por até 5 semanas com perda relativamente limitada da expressão de pMHC sc. É altamente recomendável congelando as células CHO logo após seleção/triagem para garantir um estoque confiável de células com expressão de MHC sc conhecido.
As várias etapas dos protocolos apresentados podem ser modificadas, dependendo da disponibilidade de equipamentos, ou dependendo dos objectivos específicos de investigação. Por exemplo, PBMC proliferação potencial pode ser inibido (passo 3.2.1) usando métodos alternativos que não exigem uma gama (ou X) difusora, tais como tratamento com mitomicina C38. Buffers de dissociação uma célula não enzimáticos contendo metal quelantes39 podem ser usado em vez de célula raspagem na etapa 3.3.1. Além disso, as apresentadoras de sistema podem ser modificada para torná-lo mais adequado para clones humanos CTL, expressando diferentes TCRs. CHO células expressa hamster MHC classe I moléculas, e embora estas são irrelevantes para a linha CTL estudou aqui (Figura 2A e Figura 3A, observamos sem respostas de células T para untransfected células CHO), existe a possibilidade de que outros TCRs humanos podem mostrar alguns xenoreactivity. Em que caso, hamster MHC classe I expressão pode ser reduzida ao nocautear hamster β2-microglubulin ou toque usando CRISPR/Cas9; ou uma linha APC humana pode ser usada depois de β2-microglubulin CRISPR/Cas9-mediada ou torneira nocautear.
O sistema experimental apresentado aqui permite um controle preciso do TCR e CD8 interações com moléculas de MHC apresentam peptídeos pré-definidos. Por exemplo, anteriormente mostramos que mutações abolindo CD8 vinculação40 a coagonist pMHC eliminada do realce de ativação mediada por coagonist em murino e humano T CD8 + células9,10, Considerando que revoga a TCR interação com agonista co pMHC não teve efeito sobre ativação mediada por coagonist realce10. No entanto, o uso de construções de cadeia única MHC tem várias limitações. Por exemplo, é tempo e trabalho-consumindo para testar vários peptídeo agonista co sequências usando este sistema experimental, como isso envolve a geração de múltiplos plasmídeos codificação sc MHC com peptídeos diferentes e posteriores transfections e classificação de célula. Anteriormente, usamos a linha de celular deficiente torneira murino RMA-S para testar vários péptidos de agonista co mouse ativação de célula T8,9, mas esta abordagem não foi bem sucedida com a TAP-deficiente humana T2 célula linha10, mais provável devido a uma apresentação de peptídeos de torneira independente41. Outra limitação do nosso sistema experimental é que não fornece um método rápido para alterar a quantidade de moléculas de pMHC co agonista com vista a determinar a quantidade crítica de agonista co pMHC necessário para acionar a ativação de células T. Além disso, o sistema tetraciclina-inducible usado não permite titulação de agonista pMHC quantidade no nível da célula única, alterando a concentração de tetraciclina, como concentração variando de tetraciclina altera a proporção de células positivas de HLA-A2, ao invés de níveis de HLA-A2 per célula base. Uma abordagem alternativa que estamos atualmente investigando é usar com suporte lipídico bilayers42, anteriormente usado para investigar co-genealogia durante murino T CD4 + ativação de célula4 ou grânulos apresenta quantidade fixa de agonista pMHC na presença de quantidades variáveis de agonista co pMHC. Quando usado em conjunto com UV-cleavable peptídeo tecnologia4,43, estes sistemas experimentais alternativos devem permitir testes rápido de múltiplas sequências de peptídeo agonista co, bem como diferentes quantidades de agonista co pMHC .
A tecnologia de MHC sc pode ser também aplicável à investigação de co-genealogia em células T CD4 humanas ou murino como única cadeia MHC moléculas de classe II apresentam predeterminados peptídeos com êxito foram expressas em células de mamíferos superfícies44. Além disso, o uso da tecnologia de sc MHC pode ser estendido para investigação de moléculas de MHC não-clássica como HLA-E. SC HLA-E tem sido descrita antes, e sua expressão foi mostrado para inibir a ativação de células T humanas45. Uma outra molécula de MHC não-clássica de interesse é o CD1, que apresenta lipídios em vez de peptídeos46. Construções de SC consistindo de cadeia pesada CD1 e β2-microglobulina foram mostradas para ser expressa na superfície das células e para vincular lipídico relevantes ligantes47. Cadeia única tecnologia de MHC tem um grande potencial como ferramenta de pesquisa para investigar interações moleculares durante a ativação de células T e NK.

MHC de classe I (MHC-eu) moléculas apresentam peptídeos curtos (8-10 aminoácidos), derivados de proteínas sintetizadas por cada célula. MHC-eu moléculas em células saudáveis apresentam auto peptídeos derivados de proteínas endógenas. Infecção viral leva à apresentação de peptídeos vírus derivados do não-auto na MHC-eu, mas células infectadas mesmo presente não-auto peptídeos na presença de grandes quantidades de peptídeo-MHC auto (pMHC). MHC-é reconhecido pelo receptor de células T (TCR) e o CD8 co do receptor de células T. Afinidade de ligação TCR para pMHC peptídeo é altamente dependente da sequência de peptídeos apresentados, considerando CD8 ligação é independente de peptídeo. Vinculação de TCR para agonista não-auto pMHC complexo leva para funções de ativação e efetoras células T. PMHC auto non-estimulatórios complexos não induzem funções de ativação e efetoras células T, mas podem melhorar respostas de célula T a agonista pMHC, através de um processo denominado co-genealogia1,2,3. Co-genealogia tem sido observado em rato T CD4 + células4,5,6 , bem como no mouse e humana T CD8 + células7,8,9,10, 11 , 12 , 13. sob condições fisiológicas, as células T precisam reconhecer quantidades limitadas de agonista pMHC em células (APCs) co apresentando níveis elevados de pMHC não-estimulatórios complexos, sugerindo que co-genealogia contribui para T ideal apresentadoras respostas de células in vivo. Classe de MHC superfície total de célula os níveis são frequentemente ativador durante infecções virais14 e em tumores15. Esta estratégia de evasão imune diminui a apresentação de agonista pMHC, mas também reduz a quantidade de co agonista pMHC eu disponível para aumento de ativação de células T. Além disso, os níveis de expressão de superfície celular alta do MHC classe I molécula HLA-C têm sido mostrados para correlacionar com melhorado HIV controle16, sugerindo um papel crucial para a classe de MHC total eu expressão na ativação de células T. Apesar da importância fisiológica de co-genealogia, seu mecanismo molecular é compreendido ainda incompleta. Isto é principalmente devido a desafios técnicos experimentalmente, controlando a quantidade de pMHC apresentado agonista co mantendo agonista pMHC constante.
Desenvolvemos um experimental sistema para investigar co-genealogia durante a ativação de células T CD8 + humana expressando humana MHC classe I moléculas apresentando predeterminados peptídeos como único polipeptídeo (única cadeia MHC-I, figura 1A) em uma célula xenogénica linha9,10. PMHC de agonista de cadeia única (sc) manifestou-se sob controle do promotor tetraciclina-inducible na linha hamster-derivado T-REx CHO células expressando repressor de tetraciclina; Isso permite que a baixíssima expressão "vazamento" de sc agonista pMHC na ausência de tetraciclina e expressão de pMHC de agonista alta sc após adição de tetraciclina (figura 1BC). As pilhas de T-REx CHO pMHC-expressando sc agonista foram então supertransfected com não-estimulatórios, agonista co sc pMHC-eu sob controle de um promotor constitutivamente ativo (figura 1BC). Utilização deste sistema experimental nos permitiu comparar CD8 + células T respostas ao agonista pMHC na presença ou ausência de níveis elevados de pMHC não-estimulatório. Criticamente, desde do peptide e MHC-eu cadeia pesada estão covalentemente ligados na scMHC-Formatar, isso permite que as apresentações de mutações em moléculas de MHC apresentando predeterminados peptídeos. Uso de scMHC-eu assim tecnologia permitiu-nos especificamente modulam TCR ou CD8-ligação Propriedades de agonista, ou agonista co pMHC.
Co-Genealogia na ativação de células T CD8 + tem sido observado usando purificada MHC-eu complexos apresentando agonista e agonista co peptídeos sob a forma de heterodímeros11,17 ou apresentado na quântica pontos12,13. Primeiros trabalhos em co-Genealogia na ativação de células T CD8 + no contexto do reconhecimento de pMHC agonista na APC usado linhas de células deficientes em TAP2 como APCs. TAP é necessária para o transporte de peptídeo do citoplasma para o retículo endoplasmático, e TAP-deficiência reduz severamente a piscina de péptidos de-ligação disponíveis MHC classe. Na ausência de peptídeos, o complexo nascente do MHC classe I cadeia pesada e β2- microglobulina é instável, resultando em baixíssimo MHC-eu expressão de superfície de célula. Inicialmente, comparação de células T estimuladas com antígeno carregado na torneira- e - rato deficiente RMA e suficientes RMA-S linhas de célula, respectivamente, como APCs, não revelaram qualquer evidência para co-genealogia durante rato de ativação de célula T18. No entanto, a utilização deste sistema experimental não permitia um controle preciso sobre a quantidade de agonista pMHC apresentado independentemente não-estimulatórios auto pMHC. Além disso, estas linhas de duas células também podem diferir na expressão de outras moléculas que modulam a ativação de células T, tais como ligantes para receptores de célula T co-estimulatória ou inibitórios, ou moléculas de adesão.
Posteriormente, foi desenvolvido um protocolo para células deficientes em TAP2 RMA-S com peptídeos exógenas para permitir a apresentação de uma quantia fixa de agonista pMHC na presença ou ausência de pMHC não-estimulatório de carga. Isto foi conseguido através do seguinte: incubação de deficientes em TAP2 RMA-S células a baixas temperaturas (28 ° C, em vez do habitual 37 ° C) para estabilizar o vazio MHC classe I cadeia pesada/β2 microglobulina complexos19; incubação a 28 ° C, com peptídeo agonista exógeno; incubação a 28 ° C, na presença ou ausência de peptídeos não-estimulatórios exógenos; e incubação a 37 ° C para reduzir a expressão de superfície celular de vazio MHC classe I complexos8,9. Uso desta montagem experimental revelou que a presença de pMHC não-estimulatórios reforçada ativação de timócitos rato, células CD8 + T periféricas de ingênuo e CTLs8. Mecanicamente, a presença de pMHC não-estimulatórios pode induzir CD8 recrutamento para sinapse imunológica celular: APC T mesmo na ausência do agonista pMHC, e pMHC não-estimulatórios pode melhorar a interação de TCR com CD8 co-receptor7,8. No entanto, este sistema experimental não permite testar as contribuições relativas de TCR e CD8 vinculação co-receptor de agonista e agonista co pMHC na mediação o realce de ativação, como modificações, alterando a ligação TCR ou CD8 de MHC-classe que ia afetam todas as moléculas de MHC, independentemente do peptide apresentado. Portanto, usamos o MHC-classe eu única tecnologia de cadeia para superar esse problema.
A classe de MHC de cadeia única (sc) eu formato tiver sido utilizada para melhorar a apresentação antigênica pMHC para estratégias terapêuticas e para responder a perguntas fundamentais sobre os mecanismos de ativação de receptores TCR e NK células e função20,21 . scMHC-consiste de peptídeo, β2- microglobulina e MHC-eu cadeia pesada juntaram-se dois linkers de serina e glicina-rich flexíveis (figura 1A), várias sequências de vinculador diferentes têm sido desenvolvidos e testados22. scMHC-posso dobrar independentemente da torneira complexa e acompanhar as proteínas necessárias para pMHC convencional montagem complexa20. scMHC-foram mostrado para dobrar corretamente, conforme determinado usando anticorpo específico de conformação, coloração22 e resolvendo estrutura sc com cristalografia de raios x23. A scMHC básica-projeto foi modificado para melhorar a ligação de baixa afinidade peptídeos24,25.
Este protocolo descreve o uso de scMHC humana-eu investigar co-genealogia durante CTL humano clone ativação. O protocolo foi otimizado para clone humano CTL específico para um epítopo do vírus da hepatite B (HBV). VHB é um fardo de saúde grave em todo o mundo, pois há 350 milhões pessoas infectadas com VHB e infecção crônica pelo VHB podem levar ao desenvolvimento de carcinoma hepatocelular (HCC). HCC células resultantes de infecção pelo VHB podem geralmente apresentam epitopos HBV-derivado e podem ser reconhecidas por células T humanas específicas. HBV e HCC autorização depende as respostas de células T humanas26, mas pacientes do HCC muitas vezes sofrem de exaustão de células T e redução de células T respostas27. Introdução de HBV específicas TCR em pilhas de T do HBV foi tentada como uma potencial estratégia de imunoterapia para eliminar de infecção crônica pelo VHB28. No entanto, não se sabe se esse método será eficaz em um ambiente clínico, devido aos baixos níveis de superfície MHC-I em hepatócitos humanos29. Portanto, compreender o mecanismo de coagonism pode prever perspectivas alternativas imunoterapia do HBV, possivelmente por melhorar a apresentação de pMHC endógeno para induzir respostas co genealogia-mediada por células de T. O protocolo abrange todas as medidas necessárias para a investigação sobre co-genealogia humana: transfecção de células CHO T-REx com agonista e agonista co sc pMHC, geração de linhas de células T-REx CHO estáveis, cultura da linhagem de células CTL CD8 + T humana HBV-específicos e ativação do CTL experimentos de quantificar a produção de citocinas e degranulação em resposta a células CHO T-REx. Embora focamos usando o sc MHC classe I tecnologia para investigar co-genealogia durante a ativação de célula T HBV, deve-se notar que os métodos apresentados podem ser facilmente adaptados para pesquisa sobre outros aspectos da ativação de células T em sistemas de células T humanas com conhecidos pMHC-eu especificidade.
Este protocolo utiliza um humano CD8 + CTL linha específico para o peptídeo derivado de HBV E183-91 (FLLTRILTI: "E183")30 apresentado na HLA-A2. moléculas HLA de SC que consiste de uma sequência de sinal da β2-microglobulina humana, um peptídeo de vinculação de HLA-A2 de interesse, um vinculador de glicina/serina, um humano β2-microglobulina, um vinculador de glicina/serina e uma A2 cadeia pesada pode ser comercialmente sintetizados (figura 1A ). Plasmídeos codificação scA2 construções com peptídeo de E183 agonista, ou peptídeos de31 coagonist HIV mordaça (SLYNTVATL) estão disponíveis a partir dos autores mediante pedido. A sequência do peptídeo pode ser alterada usando local-mutagenesis dirigido. Um vetor de tetraciclina-inducible pcDNA5/TO foi usado para expressar a cadeia única de agonista HLA-A2 com E183 peptídeo (sc E183-HLA-A2). Na presença de repressor de tetraciclina, o pcDNA5/a do plasmídeo permite apenas muito baixo, "furado" a expressão da proteína de interesse; alta expressão pode ser induzida pela adição de tetraciclina (figura 1BC). Utilização de um sistema de expressão tetraciclina-inducible permite o controle sobre a quantidade de células superficiais agonista pMHC expressão. Um pcDNA3.1 de plasmídeo de expressão constitutiva foi usado para expressar coagonist scA2 com mordaça peptídeo (sc GAG-HLA-A2). A expressão de tetraciclina-regulado linha de celular (T-REx) CHO (linha de células de hamster, não MHC humano endógeno) foi usada para expressar o agonista e agonista co sc-HLA-A2 construções. Este sistema experimental permite um controle preciso sobre a apresentação de pMHC (Figura 1): nenhuma apresentação de pMHC (untransfected T-REx), uma quantidade elevada de apresentação de pMHC co agonista (constitutiva sc expressão GAG-HLA-A2), uma baixa quantidade de agonista pMHC apresentação (sc E183-HLA-A2 na ausência de tetraciclina), uma quantidade elevada de apresentação de pMHC de agonista (sc E183-HLA-A2 na presença de tetraciclina), uma baixa quantidade de agonista pMHC apresentação e expressão elevada do agonista co pMHC (sc E183-HLA-A2 na ausência de tetraciclina e constitutiva sc expressão GAG-HLA-A2). Utilização deste sistema experimental permite um controle preciso dos montantes de superfície celular de agonista e coagonist pMHC.

<table><tbody><tr><td>Aim-V (meio livre de soro)</td><td>Gibco</td><td>12055091</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>Gibco</td><td>R21001</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm (kit de fixação/permealibização)</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>10131035</tr><tr><td>GolgiPlug (Brefeldin A)</td> <td>BD</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Soro humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4522</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Lectina de Phaseolus vulgaris (PHA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L4144</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (baixa mídia de soro)</td> <td>Bibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Vivantis</td><td>PB0344 - 1L</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenonimina (PEI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>IL2 humana recombinante</td><td>R & D Systems</td><td>202-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL7 humano recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>207-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL15 humano recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>247-ILB</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>T-REx CHO linha celular</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R71807</td><td></td></tr><tr><td>10 x Tripsina/EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>347347</td><td>Clone SK7, RRID:AB_400287</td></tr><tr><td>CD8&alpha;</td><td>Clone</td><td>BD 563795</td><td>RPA-T8, RRID: AB_2722501</td></tr><tr><td>CD107a</td><td>Clone</td><td>566261</td> BD <td>H4A3, RRID: AB_2739639</td></tr><tr><td>HLA-A2</td><td>eBioscience</td><td>17-9876-41</td><td>Clone BB7.2, RRID: AB_11151522</td></tr><tr><td>IFN -&gama;</td><td>eBioscience</td><td>12-7319-41</td><td>Clone 4S. B3, RRID:AB_1311250</td></tr></tbody></table>

uso da tecnologia de mhc única cadeia para investigar co-genealogia na ativação de células t humanas cd8 +

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Complexos de MHC (pMHC) non-estimulatórios do peptide auto não induzem funções de ativação e efetoras células T, mas podem melhorar respostas de célula T a agonista pMHC, através de um processo denominado co-genealogia. Este protocolo descreve um experimental sistema para investigar co-genealogia durante a ativação de células T CD8 + humana expressando humana MHC classe I moléculas apresentando predeterminados peptídeos como único polipeptídeos (única cadeia MHC) em uma linha xenogénica celular. Manifestámos a única cadeia MHCs sob condições onde os baixos níveis de complexos de p-MHC de cadeia única de agonista e altos níveis de complexos de cadeia simples não-estimulatórios p-MHC foram expressos. Utilização deste sistema experimental nos permitiu comparar CD8 + células T respostas ao agonista pMHC na presença ou ausência de pMHC não-estimulatório. O protocolo descreve o transfection de linha celular com construções de cadeia única MHC, geração de célula estável linhas, cultura de células T CD8 + hepatite B vírus específicos de e ativação de células T dos experimentos de produção simultaneamente quantificação de citocinas e degranulação. Os métodos apresentados podem ser usados para a pesquisa sobre diferentes aspectos da ativação de células T CD8 + em sistemas de células T humanas com especificidade de peptídeo conhecido MHC.

O sc MHC classe I tecnologia utilizada aqui permite o controle preciso da expressão de superfície celular de MHC-classe I com peptídeos conhecidos, covalentemente ligados, para induzir a ativação de células T. Nós têm gerado um engenharia xenogénica APC sistema (figura 1A, B, C) que permite a apresentação de níveis baixos de agonista pMHC na presença ou ausência do agonista co pMHC (Figura 1, E). Criticamente, nós usamos um TCR-como anticorpo específico para HLA-A2 apresentando E183 peptide para mostrar que a apresentação do agonista sc que e183-HLA-A2 não é alterada pela expressão co de agonista co sc GAG-HLA-A2 (Figura 1E). No entanto, deve-se notar que o anticorpo específico de TCR-como o E183-HLA-A2 mostra alguma ligação ao peptídeo de mordaça apresentando HLA-A2 (Figura 1E). Sistemas de célula de apresentadoras engenharia semelhante podem ser construída usando diferentes peptídeos ou moléculas de MHC para investigar moleculares requisitos para interações TCR e/ou co-receptor em células T humanas com especificidades diferentes.
Usamos estas APCs projetados para estimular um E183 HLA-A2-específicos CD8 + células T clone humano. Foram utilizados três controles negativos: T células única, untransfected CHO T-REx, e ativação de células células CHO T-REx expressando quantidades elevadas de agonista co sc GAG-HLA-A2 para testar potencial T por todas as moléculas expressadas em células CHO T-REx (T-REx untransfected CHO células em comparação com apenas a célula T) e para a ativação de células T por sc-GAG-HLA-A2 (células T-REx CHO expressando altos níveis de sc-GAG-HLA-A2, em comparação com untransfected células CHO T-REx). Untransfected nas células CHO T-REx ou T-REx CHO expressando sc-GAG-HLA-A2 não induz ativação do clone E183 HLA-A2-específicos CD8 + CTL, conforme determinado por quantificar a produção de IFN-γ e expressão do marcador degranulação CD107a como uma medida de célula T citotoxicidade (Figura 2AB). Expressão de níveis elevados de agonista sc E183-HLA-A2, usado como controle positivo, induzido muito eficiente produção de IFN-γ e degranulação (Figura 2AB), demonstrando que a construção de HLA-A2 do sc pode ser reconhecida por um TCR específico para ativar Funções de células t efetoras. Expressão de baixos níveis de sc E183-HLA-A2 induzida por baixos níveis de produção de IFN-γ e degranulação, e este foi reforçada pela presença de agonista co sc GAG-HLA-A2 (Figura 2AB). Deve-se notar que muito altas porcentagens de células CD107a + T foram observadas mesmo em resposta a baixos níveis de antigênica pMHC (Figura 2B), consistente com relatórios anteriores de requisitos relativamente baixos para a quantidade de pMHC de agonista para indução de células T citotoxicidade33. O IFM CD107a, indicando a quantidade de degranulação em uma base única célula, proporciona uma melhor faixa dinâmica (Figura 2B). O ensaio de ativação de célula T utilizado permite a quantificação simultânea de duas funções efetoras principais: citocina produção e citotoxicidade e fornece a leitura muito sensível com boa faixa dinâmica.
Usamos a tecnologia de cadeia simples para testar se a ligação TCR para agonista co pMHC é necessária para o realce de pMHC dependente da ativação agonista co. Temos uma mutação valina na posição 152 na borda da ranhura de ligação de peptídeo de HLA-A2 (Figura 3B) de ácido glutâmico para criar V152E mutante, como esta mutação tem sido relatada para abolir a ligação TCR para HLA-A234. Em seguida, testamos se a mutação V152E pode abolir a ligação TCR para o clone E183-HLA-A2 CTL usado, introduzindo esta mutação em sc agonista E183-HLA-A2 e expressando a construção de sc agonista mutante em células CHO T-REx. Tipo selvagem, mas não V152E, sc E183-HLA-A2 induzida por ativação do clone E183 HLA-A2-específicas CTL usado (Figura 3A). Deve-se notar que qualquer mutação de TCR-ligação na classe de MHC I precisa ser testada separadamente para cada clone de célula individual TCR/T usado, como o efeito da mutação vai depender as interações moleculares precisas entre TCR e pMHC complexo, e que estas serão diferentes entre TCRs diferentes. Por exemplo, nós testamos oito mutações, também relatado anteriormente TCR-ligação mutações ou mutações previstas para interromper a ligação TCR sem que revoga a ligação peptídica em HLA-A2. Destes, V152E era a única mutação que aboliu a ativação do clone de células T específicas E183 usado10. Em seguida, apresentou a mutação V152E em sc o agonista co GAG-HLA-A2 e expressa co WT ou V152E sc GAG-HLA-A2, com níveis baixos de agonista sc E183-HLA-A2. Tanto WT e V152E sc GAG-HLA-A2 aprimorada produção de IFN-γ e degranulação (Figura 3D), sugerindo que a vinculação de TCR para agonista co pMHC não é necessária para aprimoramento de ativação agonista co pMHC-dependente T CD8 + células. Única cadeia MHC classe I tecnologia, tal como apresentada aqui, pode ser usado para modificar o TCR e/ou co-receptor vinculando a MHC-classe-eu com peptídeo conhecido para investigar os requisitos moleculares para reconhecimento do antígeno de células T e ativação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig1.jpg"> Figura 1: única corrente HLA-A2 constrói usada para investigar co agonista na ativação de células T CD8 + humana. (A) diagrama esquemático de uma construção scHLA-A2, consistindo de uma sequência de covalentemente sinal de fundido humana β2 microglobulina, peptídeo de escolha, vinculador flexível glicina-serina (GGGGSGGGGS GGGGS), β humana2 microglobulina, flexível glicina-serina vinculador e cadeia pesada do HLA-A2. (B) diagrama esquemático do plasmídeo usado para gerar engenharia apresentadoras de células para investigar co-Genealogia na ativação de células T CD8 + humana: repressor de tetraciclina, agonista sc E183-HLA-A2, sob controle do promotor tetraciclina-inducible, Não-estimulatórios agonista co sc GAG-HLA-A2, sob controle do promotor constitutivamente ativo. (C) diagrama esquemático da engenharia células apresentadoras de usado para investigar co-genealogia: células CHO T-REx (nenhuma expressão de MHC humano), as células T-REx CHO expressando constitutivamente altos níveis de sc GAG-HLA-A2 (não-estimulatórios agonista co pMHC), Pilhas de T-REx CHO expressando baixos níveis de "vazamento" de sc E183-HLA-A2, na ausência de tetraciclina (baixo nível de peptídeo agonista), células T-REx CHO expressando altos níveis de sc E183-HLA-A2, na presença de tetraciclina (alto nível de peptídeo agonista), T-REx CHO células expressando a baixos níveis de sc E183-HLA-A2 e altos níveis de sc GAG-HLA-A2 (baixo nível de peptídeo agonista) e alto nível de peptídeo agonista co. (D) célula da coloração da superfície do antígeno projetado Apresentando linhas celulares usando anticorpo anti-HLA-A2. Os números mostrados indicam valores de IFM para mancha de MHC na porta de células vivas. Dados representativos dos 5 experimentos independentes (E) célula da coloração da superfície do antígeno projetado Apresentando linhas celulares usando TCR-como anticorpos específicos contra HLA-A2 apresentando E183 peptídeo. Os números mostrados indicam valores de IFM para mancha de MHC na porta de células vivas. Dados representativos dos 5 experimentos independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3.jpg"> Figura 2: presença de agonista co pMHC reforçada a produção de citocinas e degranulação de clone humano de CD8 + CTL E183 HLA-A2-específicos. (A) intracelular IFN-γ coloração de clone humano de CD8 + CTL específicas do HLA-A2 após estimulação de 3h com o indicado engenharia células apresentadoras. Os números mostrados denotam o percentual positivo para coloração de IFN-γ. Dados representativos de 3 experimentos independentes, cada uma realizada com técnica triplica. (B) célula de superfície CD107a coloração de clone humano de CD8 + CTL específicas do HLA-A2 após estimulação de 3h com o indicado engenharia células apresentadoras. Os números mostrados denotam o percentual positivo para coloração de CD107a ou CD107a IFM para a população de células T CD8 +. Dados representativos de 3 experimentos independentes, cada uma realizada com técnica triplica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig3.jpg"> Figura 3: agonist co-realce de ativação mediada por células T não requer ligação TCR para o complexo de pMHC agonista co. (A) V152E mutação em sc E183-HLA-A2 abole a ativação do clone CD8 + CTL humana E183 HLA-A2-específicos. Células T-REx CHO expressando altos níveis (indução de tetraciclina) do WT ou V152E mutante sc E183-HLA-A2 foram usadas para estimular o clone humano de CD8 + CTL E183 HLA-A2-específicos para 3h. Ativação de células t foi quantificada utilizando coloracao intracelular de IFN-γ. Os números mostrados denotam o percentual positivo para coloração de IFN-γ. Dados representativos de 3 experimentos independentes, cada uma realizada com técnica triplica. (B) localização de mutação de V152E dentro da ranhura de ligação peptídica de HLA-A2. (C) V152E mutação na sc GAG-HLA-A2 agonista co pMHC complexo não aboliu o realce de ativação agonist-dependente. Coloracao intracelular IFN-γ do clone humano de CD8 + CTL específicas do HLA-A2 após estimulação de 4h com o indicado engenharia células apresentadoras. Os números mostrados denotam o percentual positivo para coloração de IFN-γ. Dados representativos de 3 experimentos independentes, cada uma realizada com técnica triplica. (D) V152E mutação na sc GAG-HLA-A2 agonista co pMHC complexo não aboliu o realce de ativação agonist-dependente. Célula CD107a coloração da superfície de clone humano de CD8 + CTL específicas do HLA-A2 após estimulação de 3h com o indicado engenharia células apresentadoras. Os números mostrados denotam o percentual positivo para coloração de CD107a ou CD107a IFM para a população de células T CD8 +. Dados representativos de 3 experimentos independentes, cada uma realizada com técnica triplica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve o uso da única cadeia de MHC classe I complexos para investigar interações moleculares na ativação de células T CD8 + humana: geração de engenharia apresentadoras de celulas que expressam cadeia única constrói, cultura de clone humano de células T CD8 + e experimentos de ativação de células T.

Uso da tecnologia de MHC única cadeia para investigar Co-Genealogia na ativação de células T humanas CD8 +

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

Os complexos de PEPTÍDEOs não otimistas NÃO ativam células T, mas podem melhorar as respostas das células T ao peptídeo agonista MHC. Este protocolo descreve um sistema experimental para investigar o co-agonismo durante a ativação de células CD8 T humanas. Expressamos moléculas de MHC como complexos uni-acorrentados com cadeia pesada covalente, beta-2-microglobulina, e peptídeo.Isso permite introduzir mutações em moléculas de MHC apresentando peptídeos predeterminados. Este protocolo usa clone ctn humano, um específico para um epítope de vírus da hepatite B. Compreender o mecanismo do co-agonismo durante as respostas das células T contra a hepatite pode contribuir para o desenvolvimento de imunotrópicos contra essa infecção viral.Os métodos apresentados podem ser utilizados em pesquisas e outros aspectos fundamentais da ativação de células T em sistemas de células T humanas com especificidade conhecida do PEPtídeo MHC. Este protocolo usa moléculas de MHC humanos de cadeia única, consistindo de sequência de sinal, peptídeo de interesse, linker, linker beta-2-microglobulina humana e cadeia pesada MHC. Peptídeo E1A3 da hepatite B é usado como peptídeo agonista.A mordaça do HIV é usada como peptídeo não estimulante. As moléculas de MHC humanos de cadeia única são expressas em uma linha celular de hamster contendo repressor de tetraciclina. O MHC de cadeia única agonista é expresso usando plasmídeo indutível de tetraciclina, resultando em níveis de expressão muito baixos na ausência de tetraciclina, e altos níveis de expressão na presença de tetraciclina.As células CHO expressas baixos níveis de peptídeo agonista MHC são transfeinadas com peptídeo não estimulante expresso constitutivamente. O uso deste sistema experimental permite comparar as respostas das células T ao peptídeo agonista MHC na presença ou ausência de peptídeo não estimulante MHC. Para iniciar este procedimento, cultive células CHO em um frasco T-75, conforme descrito no protocolo de texto.No dia anterior ao experimento de ativação da célula T, lave as células no frasco com PBS. Adicione uma solução contendo 05% de trippsina e 2% EDTA em PBS, e incubar por cinco a dez minutos à temperatura ambiente. Usando um microscópio leve, observe as células para ter certeza de que elas se separaram.Em seguida, adicione F12 completo ao frasco para parar a trippsinização. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 400G por cinco minutos e remover o supernatante por pipetação ou decantação.Suspenda a cápsula de celular em cinco mililitros de F12 completos. Use um hemótmetro para contar as células e ajustar a concentração celular para 200.000 células por mililitro em CF12. Adicione 50 a 60 nanogramas por mililitro de tetraciclina às amostras apenas agonistas para induzir altas quantidades de expressão agonista da classe I pMHC como um controle positivo.Depois disso, misture as células CHO por vórtice ou pipetação. Adicione 100 microliters da suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Um dia antes do experimento, centrífugas ctls células a 400 vezes G e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Use um hemótmetro para contar as células, e suspendê-las a uma densidade de um milhão de células por mililitro em mídia completa de células T humanas sem citocinas ou PHA. Incubar os CTLs durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.No dia seguinte, centrifugar as células T a 400 vezes G e a 4 graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernasce e suspenda as células em 2 mililitros de mídia completa sem soro. Use um hemótmetro para contar as células T, e ajustar sua densidade para um milhão de células vivas por mililitro em mídia completa de células T humanas.Adicione anticorpo CD107a anti-humano em uma diluição de 1 a 100, e Brefeldin A em uma diluição de 1 a 1000. Em seguida, recupere a placa de 96 poços contendo as células CHO. Usando uma pipeta Pasteur de vidro, aspire a mídia das células CHO.Adicione 200 microliters da suspensão da célula T a cada poço. Co-cultura as células T com células CHO a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três a quatro horas. No final da co-cultura, centrifugar a placa de 96 poços a 400 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos.Remova o supernatante aspirando ou piscando. Em seguida, adicione 2,5 microliters de anticorpos CD3 e 2,5 microliters de anticorpos CD8 em 50 microliters de 5%BSA em PBS para cada poço, para coloração de antígeno da superfície celular, e misture por pipetação. Incubar as amostras no escuro, e no gelo, por 30 minutos.Depois disso, adicione 150 microliters de tampão de lavagem a cada poço para lavar as amostras. Centrifugar as amostras a 400 vezes G e a 4 graus Celsius por cinco minutos. Remova o supernatante aspirando ou piscando.Defina um kit de fixação/permeabilização e adicione 100 microliters de solução de fixação/permeabilização a cada poço e pipeta para misturar. Incubar no gelo por 20 minutos. Em seguida, centrifugar a placa a 400 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos.Descarte o supernatante e adicione 200 microliters de 1X perm/tampão de lavagem a cada poço. Repita este processo a partir da centrifugação através da adição do amortecedor perm/lavagem uma vez. Depois disso, suspenda as células em 50 microliters de perm/wash buffer contendo anti-interferon-gama a uma concentração de 3 microgramas por mililitro.Incubar no gelo no escuro por 30 minutos. Em seguida, adicione 150 microliters de 1X perm/wash buffer. Centrífuga a 400G, 4 graus Celsius, por cinco minutos.Remova o supernatante e adicione 200 microliters de 1X perm/wash buffer. Centrifugar a placa novamente a 400 vezes G, quatro graus Celsius, por cinco minutos, e remover o supernatante aspirando ou piscando. Suspenda a amostra em 200 microliters de tampão de lavagem e proceda com análise citométrica.Um dia antes do experimento, misture as células CHO por vórtice ou pipetação. Em seguida, adicione um mililitro da suspensão celular a cada poço de uma placa de 12 poços. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.No dia do experimento, use um raspador de células para separar as células CHO do fundo de cada poço. Transfira o mililitro de mídia contendo as células de cada poço para tubos FACS. Centrifugar a 400 vezes G e a 4 graus Celsius por cinco minutos.Suspenda-se em 100 microliters de anticorpo anti-HLA diluído no tampão de lavagem. Incubar no gelo por 30 minutos. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem a cada amostra de CHO.Centrifugar a 400 vezes G e a quatro graus Celsius por cinco minutos, e descartar o supernante. Suspenda-se cada amostra em 3 mililitros de tampão de lavagem e prossiga para a análise da citometria de fluxo. Neste estudo, é apresentada uma ferramenta robusta para a investigação da interação molecular durante a ativação de células T positivas CD8 humanas.Um sistema xenogênico projetado é gerado que apresenta baixos níveis de pMHC agonista na presença ou ausência de pMHC co-agonista. Esses APCs projetados são então usados para estimular um clone de célula T t humano específico de E183. Células CHO não transtraídos e células CHO que expressam o complexo gag-MHC de cadeia única não otimista não induzem ativação.A expressão de altos níveis do complexo Agonista E183-MHC de cadeia única, que é o controle positivo, é vista para induzir uma produção interferon-gama muito eficiente, e degranulação, demonstrando que a construção E183 de cadeia única pode ser reconhecida por um TCR específico para ativar funções de efeito celular T. A expressão de baixos níveis de complexo E183-MHC de cadeia única induz níveis mais baixos de produção e degranulação interferon-gama, que foi reforçada pela presença de um complexo gag-MHC não otimista. Observe que percentuais muito altos de células CD107a+T são observados mesmo em resposta a baixos níveis de pMHC antigênico, o que é consistente com estudos anteriores.No entanto, a presença de complexo gag-MHC não otimista aumenta o CD107a MFI. Durante este procedimento, é fundamental controlar a expressão do peptídeo agonista MHC para garantir uma apresentação agonista igual com ou sem peptídeo não estimulante. É fundamental quantificar a expressão de peptídeo agonista MHC usando anticorpos semelhantes a TCR em cada experimento.Uma abordagem alternativa é usar bicamadas lipídicas suportadas, ou contas, apresentando quantidade fixa de peptídeo agonista MHC na presença de peptídeo não estimulante MHC. Esses sistemas experimentais devem permitir testes de múltiplas sequências de peptídeos não otimistas para co-agonismo. A tecnologia MHC de cadeia única pode ser usada para investigar interações moleculares na ativação de células CD4 T, bem como para investigar moléculas não clássicas de MHC.Este protocolo usa sangue humano e células humanas. Siga todas as precauções necessárias ao trabalhar com sangue humano para reduzir o risco de transmissão de doenças transmitidas pelo sangue.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Quantificação simultânea de vetor anti e Antiespecíficas do transgene CD8+ T células Via MHC tetrâmero coloração após a vacinação com um vetor Viral

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