Name: Construção e utilização de uma câmara de estimulação elétrica para reforçar a diferenciação osteogênica em células estromais/tronco mesenquimais em Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprenda a construir uma câmara de estimulação elétrica de baixo custo para reforçar a diferenciação osteogênica em células-tronco mesenquimais. Este método reutilizável auxilia pesquisadores em engenharia de tecidos ósseos.

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Este trabalho foi financiado em parte por uma concessão de start-up AO Foundation (S-14-03 H) e a Fundação Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) com sede em Frankfurt am Main, Alemanha.

1. construção da câmara de cultura de células de estimulação elétrica
<ol><li>Para construir a câmara EStim, coletar duas tampas das placas de cultura padrão 6-poços de célula; fio de 99,99% de platina, 60 cm de comprimento com um diâmetro de 0,5 a 1 mm; fio de cobre revestido de prata, 70 cm de comprimento com um diâmetro de 0,6 mm; alicate de corte; kit de ferro de soldar; um tubo de cola supercondutor; conector de bloco de terminais de um fio, seis pequenos 2,2 V diodos emissores de luz (opcional); um tubo de adesivo de silicone não corrosivo do revestimento (opcional); um rolo de fita de isolamento eléctrico preto; padrão, flexível, isolado cobre fio elétrico (0,14 mm2), 2 m de comprimento (tabela de materiais).</li>
	<li>Em uma tampa de 6 placa, marca e em seguida faça dois furos (com um diâmetro de ~ 1 mm), 25 mm separado, perto da borda externa de cada um dos seis poços (12 furos no total), como mostrado na figura 1A, B.</li>
	<li>Corte 12 comprimentos de 5 cm de fio de platina com alicate de corte. Dobre cada um dos fios manualmente em uma L-forma, deixando uma ponta de 3 cm de comprimento e os outros 2 cm. cortar o fio de prata-revestido em dois comprimentos de 35 cm.</li>
	<li>Inserir a extremidade (3 cm) mais em de um fio de platina (de dentro para fora) em cada furo, deixando 1-2 mm salientes do lado de fora da tampa, dobrá-lo usando fórceps. Prenda os fios de platina nos furos da tampa com cola supercondutor e deixe-o secar por cerca de 6 h.</li>
	<li>Solde as pontas de todos os seis fios de platina (que mais tarde vai servir como catodos, ver figura 1A) salientes das tampas para um dos fios prata-revestido. Repita o mesmo procedimento, soldar os fios de platina seis restantes (que mais tarde servirá como ânodos) para o outro fio prata-revestido.<ol>
<li>Adicione LEDs no circuito entre cada um dos seis pares de eletrodo de platina de ânodo-cátodo, para confirmar a funcionalidade durante os experimentos (opcionais). Coloque um pedaço de fita de isolamento preto no âmbito de cada LED para evitar expor as células nas placas de cultura para o diodo emissor de luz (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>O conector de bloco terminal do fio para o canto superior esquerdo da tampa 6 placa de cola e conecte os dois fios de prata-revestido para os terminais de entrada, como mostrado na Figura 1.</li>
	<li>Corte uma seção de 20 x 20 mm do canto superior esquerdo de uma segunda tampa de 6 placa (figura 1B, tampa Nr. 2) para acomodar o conector de bloco terminal da tampa primeiro. Cubra a tampa primeira, equipada com os eléctrodos, com a segunda tampa e gravá-los em conjunto com fita adesiva.<ol>
<li>Para melhorar a ligação das duas tampas, use adesivo de silicone, revestimento (opcional). Para fazer isso, cobrir a tampa com os eletrodos de prata com uma camada de 3 a 5 mm de adesivo de silicone e cubra com a outra tampa, permitindo 12 h para a cola secar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conecte uma extremidade das dois fios de cobre isolados padrão para os terminais de saída do conector de fio e outras extremidades com conectores machos de banana (4 mm). Nota: O comprimento destes fios depende da distância da prateleira na incubadora, onde as células serão mantidas, a fonte de alimentação, fora da incubadora (Figura 1).</li>
	<li>Ajustar a dosagem (tensão) e regime de EStim entregue para as células, regulando a alimentação de DC.<ol>
<li>Ligue o fornecimento de energia, pressionando o botão ON/OFF no painel frontal. Ative o canal 1, pressionando o botão 1.</li>
		<li>Pressione o botão Nr. 4 (V-set) para definir a tensão. Pressione botões 2, . e 5 para definir a saída de carga de 2,5 V. Pressione Enter.</li>
		<li>Certifique-se de que a saída de carga de 2,5 V (2.500 mV) corresponde a uma EStim de 100 mV/mm, de acordo com a equação seguinte, simplificada. V EStim = <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59127/59127eq1.jpg"> ; ou V = VEStim × d Aqui, V = tensão de alimentação de saída em milivolts; d = distância entre os eléctrodos em milímetros; V EStim = a tensão de estimulação em milivolts por milímetro. Nota: Esta simplificação aplica-se somente em caso de tensão DC constante. A resistência entre o meio e as células é insignificante como eletrodos não estão em contacto directo com as células; em vez disso, EStim é entregue para as células através do meio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. mesenquimais de células estaminais cultura osteogênica médio
<ol><li>Comprar e armazenar MSCs rato comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais) em nitrogênio líquido, até o dia do experimento. Alternativamente, MSCs de isolado de outros animais de acordo com protocolos publicados noutro local7,8 , em conformidade com os regulamentos institucionais locais para o uso de animais experimentais.</li>
	<li>No dia do experimento, remover (1 x 106 células), um frasco de MSCs do armazenamento de nitrogênio líquido e rapidamente (dentro de 1 min) descongelar as células em um banho de água pré-aquecida a 37 ° C.<ol>
<li>Sob condições estéreis de um capuz de fluxo laminar, pipetar o conteúdo do frasco para um tubo falcon de 50ml e adicionar 9 mL do meio normal (NM) pré-aquecido a 37 ° C, constituído por meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM; 1 x) com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e 1% solução de penicilina/estreptomicina. Granule as células por 5 min por centrifugação a 300 x g.</li>
		<li>Em uma capa de fluxo laminar, remover o sobrenadante e cuidadosamente Ressuspender as células em 12 mL de NM pré-aquecido a 37 ° C. Transferi as células ressuspensa para um frasco de cultura de células T-75.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultura de células em 37 ° C, 5% de CO2, 5% O2 até atingirem uma confluência de 80%-90% (aproximadamente após 3-5 dias).</li>
	<li>Passagem das células. Nota: Realizar todas as operações exceto centrifugação e incubação em condições estéreis de um capuz de fluxo laminar.<ol>
<li>Depois de atingir uma confluência de 80%-90%, recupere as células com solução de desprendimento de células. Aspire o meio de cultura celular, lave 2 x com 1 x fosfato salino (PBS), adicionar 5 mL de 1 x solução de desprendimento de célula e retornar as células para a incubadora por 5 min.</li>
		<li>Uma vez que as células são desanexadas, adicione uma quantidade igual de meio de cultura para inactivar a solução de desprendimento. Coletar as células em um tubo falcon de 50ml e girá-los a 300 x g por 5 min.</li>
		<li>Descartar o meio e ressuspender as células em 1 mL de meio fresco normal. Avalie o número de células viáveis com mancha azul trypan.</li>
		<li>Semente de 1 x 106 células em balão T-75 novo com 12 mL de NM escaldada. Cultura de células em 37 ° C, 5% de CO2, 5% O2 até atingirem uma confluência de 80%-90%. Nota: Célula passagem (etapas 2.4.1–2.4.4) pode ser repetido várias vezes até o número necessário de células é obtido. Não use mais de passagem 8 células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Semente 9 x 104 células em 3 mL de NM (10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino, 1% penicilina/estreptomicina, DMEM) em cada poço de uma placa de cultura de 6-poços. Incube as celulas para 1 dia em 37 ° C, 5% de CO2, 5% O2.</li>
	<li>No dia seguinte, Aspire o meio de cultura e aplicar 3 mL de meio de diferenciação osteogênica (OM; normal suplementado com 10-7 M dexametasona, β-glicerofosfato de 10 mM e 0,05 mM de ácido ascórbico-2-fosfato).</li>
	<li>Coloque a placa de 6 com células na incubadora e incubar a 37 ° C, 5% de CO2, 5% O2 durante a noite.</li>
</ol>3. tratamento de MSCs com EStim
<ol><li>No dia em que as células são tratadas com EStim, esterilizar os eletrodos em solução de etanol 70% por 30 min; em seguida, seque-os à luz numa câmara de segurança para um adicional 30 min UV.</li>
	<li>Em uma capa de fluxo laminar, cobrir a placa de 6 contendo os MSCs cultivadas com a tampa equipada com os eléctrodos, certificando-se de que os eléctrodos estão completamente submersos no meio (se necessário, adicione médio). Transferir a placa 6-poços coberta (EStim câmara) com as células para a incubadora e conectar seus arames para fonte de alimentação.</li>
	<li>Definir a fonte de alimentação para saída de carga 2,5 V e tratar as células com EStim para 1h3,9.</li>
	<li>Após a estimulação, desconecte a fonte de alimentação e remova a câmara de EStim da incubadora. Sob condições estéreis, troca a tampa equipada com eléctrodos com uma tampa da placa padrão 6.</li>
	<li>Retorno das células para a incubadora e deixá-los durante a noite. Limpe os eléctrodos, primeiro com PBS e, em seguida, com solução de etanol a 70%. Limpe os produtos de corrosão acumulada da superfície do eletrodo com uma lixa fina.</li>
	<li>Repita as etapas 3.1-3.5 para 6 dias consecutivos. No dia 4, antes da aplicação EStim e sob condições estéreis, mudar o meio de cultura por 1,5 mL de meio de aspiração e substitui-lo com 1,5 mL de OM fresca escaldada</li>
	<li>Depois de aplicar EStim durante 7 dias consecutivos, manter as células em cultura por mais 7 dias, trocando a média a cada 3-4 dias.</li>
</ol>4. medições de diferenciação osteogênica
<ol><li>Analise as alterações de morfologia celular sob um microscópio.</li>
	<li>Para avaliar o efeito de EStim na diferenciação osteogênica MSC, medida deposição de cálcio, atividade da fosfatase alcalina e expressão de gene marcador osteogênica, como descrito em outra parte3,9.</li>
</ol>

<ol><li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine%3A+What+Is+the+Evidence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li>
<li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications%3A+Current+Status+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li>
<li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821(2017).</li>
<li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1(2018).</li>
<li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li>
<li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Translation%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC%2FEPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li>
<li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959(2018).</li>
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<li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61(2010).</li>
<li>Wang, L., Li, Z. -y, Wang, Y. -p, Wu, Z. -h, Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Sciences+Journal+%28Chung-kuo+i+hsueh+k%27o+hsueh+tsa+chih%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li>
<li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy%3A+biomedical+implications+for+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), Oxford, UK. 747-753 (2007).</li>
<li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077(2018).</li>
<li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Burns+%26+Trauma%22%5BJournal%5D)">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns & Trauma. 6, 20(2018).</li>
<li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li>
<li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li>
<li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+%26+Engineering.+C%2C+Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li>
<li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9(2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui descrevemos a construção de uma câmara e um método para o tratamento de células-tronco mesenquimais com EStim que resulta em maior diferenciação osteogênica.
A configuração de EStim apresentada não requer equipamentos especial/conhecimento e pode ser realizada em um laboratório de biologia/bioquímica de células-tronco padrão por pesquisadores Júnior. No entanto, quando compilando e usando a câmara EStim, especial deve ter cuidado em algumas etapas críticas. Ao manusear os eléctrodos de pl...

Um aumento no trauma e/ou defeitos ósseos induzida por doença estão sendo tratados usando diferentes combinações de terapia celular e tecnologias de medicina regenerativa. MSCs são a célula de escolha em tais tratamentos, devido à sua relativamente alta atividade osteogênica, isolamento e expansão de eficiência e segurança1. Para maximizar sua atividade osteogênica e, assim, otimizar sua eficácia terapêutica, foram introduzidos vários métodos para manipular MSCs antes da sua utilização nestes tratamentos (como comentado por Mauney et al.2). Um tal método é EStim, que foi mostrado para aumentar a diferenciação osteogênica do MSC em vitro3 e promover a consolidação em vivo4. Apesar do crescente número de estudos com foco em tratamento MSCs com EStim, um regime ideal para maximizar o efeito de pro-osteogênica do EStim ainda tem de ser definido.
Outros métodos in vitro usando EStim utilizam sal pontes submergidas em meio de cultura, que separa as células dos eletrodos metálicos5. A vantagem desta é que entregar EStim através de pontes de sal elimina a introdução de subprodutos químicos (por exemplo, corrosão dos eletrodos metálicos) que podem ser citotóxicos. Apesar desta vantagem, pontes de sal são complicados para trabalhar com, e entregam a EStim difere que entregue em modelos in vivo, tornando difícil correlacionar os resultados obtidos ao utilizar os dois sistemas. Configurações que entregam EStim via eletrodos metálicos ou carbono fixados dentro dos poços de cultura celular (como revisto por Hronik-Tupaj e Kaplan6) melhor simulam dispositivos utilizados no vivo; no entanto, esses dispositivos são difíceis de limpar/esterilizar entre usos e o número de células que podem ser estudadas por experiência é limitado. Nós projetamos a câmara EStim apresentada aqui especificamente para resolver as limitações destas outras configurações. Enquanto a maioria da nossa experiência usando esta câmara EStim foi com 2D e 3D culturas contendo medula óssea e adiposo tecido-derivada de MSCs3,4, a principal vantagem desta câmara é que é versátil e, com menor relativamente alterações, pode ser adaptado para outros tipos de células sob uma variedade de diferentes condições de estudar.
Aqui descrevemos a construção de uma câmara de cultura de células de EStim; Então, vamos demonstrar a sua utilização por tratados MSCs com diferentes regimes de EStim e medir o efeito resultante na diferenciação osteogênica. Diferenciação osteogênica MSC é avaliada através de deposição de cálcio, atividade da fosfatase alcalina e expressão de gene marcador osteogênica. Importante, no passado experiências que usou esta configuração, observou-se que estes efeitos pro-osteogênica persistirem muito tempo depois foi descontinuado o tratamento de EStim.

<table><tbody><tr><td><forte>Fabricação de Estim</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conector de banana/adaptador de Jack</td><td>Poppstars</td><td>1008554</td><td>2 partes</td></tr><tr><td>Alicate de corte</td><td>Knipex</td><td>78 03 125</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação DC (0-30V/0-3A)</td><td>B& K Precision</td><td>Modelo 9130B</td><td>Qualquer modelo simular pode ser usado</td></tr><tr><td>Fios flexíveis isolados (0,14 mm2)</td><td>Conrad Electronic International</td><td>604794, 604093</td><td>2 peças</td></tr><tr><td>Borracha de silicone não corrosiva</td><td>Dow Corning</td><td>3140 RTV</td><td>*pode ser comprada por muitas lojas</td></tr><tr><td>Fio de platina (999,5/1000; 1mm &oslash;)</td><td>Junker Edelmetalle</td><td>00D-3010</td><td>0,6 m necessário para 1 câmara Estim</td></tr><tr><td>Solução de etanol a 70%</td><td>qualquer</td><td></td><td>Esterilização da câmara Estim</td></tr><tr><td>Fio de cobre revestido de prata (0,6 mm &oslash;)</td><td>Conrad Electronic International</td><td>409334 - 62</td><td>&asymp; 70 cm necessários para 1 dispositivo Estim</td></tr><tr><td>Conjunto de ferro de solda</td><td>Conrad Electronic International</td><td>1611410 - 62</td><td>Qualquer modelo simular pode ser usado</td></tr><tr><td>TPP Tampa de placa de 6 poços</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td><td>2 tampas para câmara Estim</td></tr><tr><td>2.2V LEDs circulares com fio</td><td>Conrad Electronic International</td><td>599525 - 62</td><td>6 peças</td></tr><tr><td>UHU Super cola</td><td>UHU GmbH & Co. KG</td><td>n/a</td><td>* pode ser comprado por muitas lojas</td></tr><tr><td><cultura forte>MSC< / forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glicerofosfato sal dissódico hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td>cultura de células osteogênicas</td></tr><tr><td>DMEM, baixa glicose, suplemento GlutaMAX, piruvato</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>21885025</td><td>cultura de células</td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>Thermo-Fischer Cultura</td><td>de</td><td>células</td>14190144 científica</tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>cultura de células osteogênicas</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Thermo-Fischer Cultura</td><td>de células 10500064</td><td></td>científicas</tr><tr><td>50 ml Tubo de falcão</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td>cultura de células</td></tr><tr><td>ácido L-ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>cultura</td></tr> <tr>de células osteogênicas<td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>15140122</td><td>cultura de células</td></tr><tr><td>células-tronco mesenquimais de rato Sprague-Dawley (SD), origem da medula óssea</td><td>Cyagen</td><td>RASMX-01001</td><td>cultura de células</td></tr><tr><td>Solução de descolamento de células</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>A1110501</td><td>cultura de células, descolamento de células</td></tr><tr><td>TC Flask, T75</td><td>Sarstedt</td><td>833911302</td><td>cultura de células</td></tr><tr><td>Placas TPP de 6 poços</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td><td>cultura de células</td></tr><tr><td>Corante azul de tripano, solução a 0,4%</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>contagem de células</td></tr></tbody></table>

construção e utilização de uma câmara de estimulação elétrica para reforçar a diferenciação osteogênica em células estromais/tronco mesenquimais em vitro

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Células tronco mesenquimais/estromal (MSCs) têm sido amplamente utilizadas para promover a consolidação óssea em abordagens de engenharia de tecidos. Estimulação elétrica (EStim) tem demonstrada aumentar a diferenciação osteogênica de MSC in vitro e promover a consolidação óssea em situações clínicas. Aqui descrevemos a construção de uma câmara de cultura de células de EStim... e sua utilização no tratamento de rato osso-medula-derivado MSC para realçar a diferenciação osteogênica. Descobrimos que tratar MSCs com EStim durante 7 dias resulta em um aumento significativo na diferenciação osteogênica, e importante, este efeito pro-osteogênica persiste muito tempo depois (7 dias) EStim é descontinuado. Esta abordagem de pretreating MSCs com EStim para realçar a diferenciação osteogênica poderia ser usada para otimizar os resultados do tratamento de engenharia de tecido ósseo e, assim, ajudá-los a alcançar o seu potencial terapêutico completo. Além desta aplicação, esta câmara de cultura de células de EStim e protocolo também podem ser usados para investigar outros comportamentos de célula EStim-sensíveis, tais como a migração, proliferação, apoptose e acessório do andaime.

Para avaliar o efeito de 100 mV/mm de EStim na diferenciação osteogênica do MSCs, células tratadas com EStim para 3, 7 e 14 dias ou folhas (controle) foram analisados no dia 14 de cultivo avaliando alterações morfológicas e deposição de cálcio (Figura 2 ). Isto foi feito por imagem de células usando microscopia de campo claro (alterações de morfologia) ou pela fixação de células em solução de paraformaldeído 4%, manchando-os com solução de vermelho de alizari...

Aqui nós apresentamos um protocolo para a construção de uma câmara de cultura celular projetada para expor as células de vários tipos de estimulação elétrica e sua utilização no tratamento de células-tronco mesenquimais para realçar a diferenciação osteogênica.

Construção e utilização de uma câmara de estimulação elétrica para reforçar a diferenciação osteogênica em células estromais/tronco mesenquimais em Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Aqui, mostramos como construir uma câmara de estimulação elétrica usando seis placas comuns de cultura de parede, e como usá-la para estimular a diferenciação osteogênica em células-tronco mesenquimais. Esta câmara é fácil e não é cara de construir, e pode ser reutilizada em múltiplos experimentos. Depois de serem pré-tratadas com estimulação elétrica em nossa câmara, as células-tronco mesenquimais podem ser usadas para melhorar os resultados em tratamentos de engenharia de tecidos ósseos.Esta câmara também pode ser usada para investigar outros tipos de células e comportamentos celulares eletro-sensíveis, como migração, proliferação, alterações no potencial da membrana, apoptose e apego cuidadoso. Em uma tampa de placa de seis poços, marque e, em seguida, faça dois furos de um milímetro de diâmetro, 25 milímetros de distância, perto da borda externa de cada um dos seis poços. Em seguida, corte um fio de platina em seções de 12 centímetros de comprimento.Dobre manualmente cada seção de cinco centímetros em uma forma L, deixando uma extremidade de três centímetros de comprimento, e a outra de dois centímetros de comprimento. Em seguida, corte o fio revestido de prata em dois comprimentos de 35 centímetros. Insira a extremidade mais longa e dobrada de um fio de platina no orifício perfurado, deixando de um a dois milímetros salientes do lado de fora da tampa.Dobre-o usando fórceps. Depois, fixe os fios de platina nos orifícios da tampa com cola super condutora e deixe-os secar por aproximadamente seis horas. Para preparar os cátodos, solde as pontas de todos os seis fios de platina que se projetam da tampa para um dos fios revestidos de prata.Para preparar os ânodos, solde os seis fios de platina restantes para outros fios revestidos de prata. Posteriormente, adicione LEDs no circuito entre cada um dos seis pares de eletrodos de platina de ânodo-cátodo para confirmar a funcionalidade. Coloque um pedaço de fita de isolamento preto sob cada LED para evitar expor as células nas placas de cultura à luz LED.Em seguida, cole o conector do bloco do terminal de arame no canto superior esquerdo da tampa da placa de seis poços, e conecte ambos os fios revestidos de prata aos terminais de entrada. Em seguida, corte uma seção quadrada de 20 milímetros por 20 milímetros do canto superior esquerdo de uma segunda tampa de placa de seis poços, para acomodar o conector do bloco terminal na primeira tampa. Cubra a primeira tampa, equipada com os eletrodos, com a segunda tampa, e tape-as junto com fita adesiva.Conecte uma extremidade dos dois fios de cobre isolados padrão aos terminais de saída do conector do fio, e a outra extremidades aos conectores machos de banana. Ligue a fonte de alimentação pressionando o botão ON-OFF no painel frontal. Ative o canal um pressionando o botão um.Depois, pressione o botão quatro para definir a tensão. Defina a saída de carga em 2,5 volts. Em seguida, pressione Enter.No dia em que as células são tratadas com haste E, esterilizar os eletrodos em solução de 70% de etanol por 30 minutos. Em seguida, seque-os sob luz UV em um gabinete de segurança por mais 30 minutos. Em uma capa de fluxo laminar, cubra a placa de seis poços contendo os MSCs cultivados com a tampa equipada com os eletrodos, certificando-se de que os eletrodos estão completamente submersos no meio.Em seguida, transfira a placa coberta de seis poços com células para a incubadora e conecte seus fios à fonte de alimentação. Em seguida, defina a fonte de alimentação para a saída de carga de 2,5 volts e trate as células com haste E por uma hora. Após a estimulação, desconecte a fonte de alimentação e remova a câmara de haste E da incubadora.Em condições estéreis, substitua a tampa, equipada com eletrodos, por uma tampa de placa padrão de seis poços. Posteriormente, devolva as células à incubadora e deixe-as durante a noite. Limpe os eletrodos, primeiro com PBS, e depois com solução de 70% de etanol.Em seguida, limpe os produtos de corrosão acumulados da superfície do eletrodo com lixa fina. Repita o tratamento de haste E por seis dias consecutivos. No quarto dia, antes de aplicar estimulação elétrica, e em condições estéreis, mude o meio de cultura aspirando 1,5 mililitros de médio e substituindo-o por 1,5 mililitros de meio de diferenciação osteogênica pré-aquecido e fresco.Após a aplicação de estimulação elétrica por sete dias consecutivos, mantenha as células na cultura por mais sete dias, trocando o meio a cada três ou quatro dias. Quando o tratamento for concluído, analise as alterações da morfologia celular sob um microscópio. Para avaliar o efeito da estimulação elétrica na diferenciação osteogênica do MSC, meça a deposição de cálcio, a atividade alcalina de fosfattase e a expressão genética do marcador osteogênico, como descrito em outros lugares.Para avaliar o efeito de 100 milivolts por milímetro de estimulação elétrica na diferenciação osteogênica do MSC, as células tratadas com estimulação elétrica durante três, sete e 14 dias e células não tratadas foram analisadas no dia 14 da cultura, avaliando alterações morfológicas e deposição de cálcio. Mudanças significativas na morfologia celular e depósitos de cálcio foram visíveis em células tratadas com estimulação elétrica durante sete e 14 dias. Uma análise detalhada das alterações de expressão genética do marcador osteogênico foi realizada nos dias três, sete e 14 da cultura.No sétimo dia de cultura, a expressão RunX2 foi significativamente maior em células tratadas com estimulação elétrica durante sete dias. Considerando que a expressão colla1 foi significativamente maior nas células tratadas durante sete dias, medida no dia 14 da cultura. A expressão da osteopontina aumentou significativamente em células eletricamente estimuladas nos dias três, sete e 14 da cultura.A expressão otérix estava ausente nas células de controle em todos os pontos de tempo, e era vista apenas aos sete e 14 dias de cultura em células expostas à estimulação elétrica. A câmara de estimulação elétrica é relativamente fácil de construir. No entanto, deve-se tomar cuidado especial ao manusear os fios de platina, e também ao limpar e esterilizar os eletrodos.Células pré-tratadas com eletricidade em nossa câmara, sozinhas ou sentadas em um material de andaime, poderiam ser implantadas em modelos animais, para estudar como o efeito positivo da estimulação elétrica persiste in vitro. Esta técnica fornece uma ferramenta simples, mas poderosa, para estudar o mecanismo pelo qual a estimulação elétrica regula as funções celulares. Esse conhecimento pode estar disponível em células medicinais regenerativas.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

É amplamente entendido que forças mecânicas no corpo pode influenciar a diferenciação e proliferação celular. Aqui apresentamos um protocolo de vídeo demonstrando o uso de um biorreator custom-built para a entrega de deformação de tração uniaxial cíclicos às células-tronco cultivadas em substratos flexíveis micropatterned.

A estimulação mecânica de Células-Tronco Usando Strain Uniaxial Cíclico

Este vídeo demonstra o uso de um chip microfluídico revestido com matriz extracelular para diferenciar células-tronco neurais e progenitoras ou NPCs por meio de estimulação elétrica. Após a semeadura e aderência à região revestida, os NPCs crescem e a aplicação de uma corrente contínua desencadeia sua diferenciação em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos.

Diferenciação induzida por estimulação elétrica de células-tronco neurais e progenitoras

As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm potencial de diferenciação em relação à linhagem osteoblástica quando estimuladas com fatores solúveis ou biomateriais específicos. Este trabalho apresenta uma nova opção para a entrega de MSCs a partir de membrana amniótica humana (AM-hMSCs) que emprega a matriz óssea bovina Nukbone (NKB) como um andaime.

Isolamento de mesenquimais humanas células-tronco e seu cultivo na matriz óssea Porous

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Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

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Eletricamente condutivo Andaime modular e entregar as células-tronco

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Nós desenvolvemos um teste de irritação nos olhos que utiliza um modelo de tecido tridimensional epitelial córnea-like humana reconstruída (RHCE). O teste é capaz de discriminar entre irritante ocular e materiais corrosivos (GHS Categorias 1 e 2 combinados) e aqueles que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria).

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Aprenda a construir uma câmara de estimulação elétrica de baixo custo para reforçar a diferenciação osteogênica em células-tronco mesenquimais. Este método reutilizável auxilia pesquisadores em engenharia de tecidos ósseos.

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