Construção e utilização de uma câmara de estimulação elétrica para reforçar a diferenciação osteogênica em células estromais/tronco mesenquimais em Vitro

Aqui, mostramos como construir uma câmara de estimulação elétrica usando seis placas comuns de cultura de parede, e como usá-la para estimular a diferenciação osteogênica em células-tronco mesenquimais. Esta câmara é fácil e não é cara de construir, e pode ser reutilizada em múltiplos experimentos. Depois de serem pré-tratadas com estimulação elétrica em nossa câmara, as células-tronco mesenquimais podem ser usadas para melhorar os resultados em tratamentos de engenharia de tecidos ósseos.

Esta câmara também pode ser usada para investigar outros tipos de células e comportamentos celulares eletro-sensíveis, como migração, proliferação, alterações no potencial da membrana, apoptose e apego cuidadoso. Em uma tampa de placa de seis poços, marque e, em seguida, faça dois furos de um milímetro de diâmetro, 25 milímetros de distância, perto da borda externa de cada um dos seis poços. Em seguida, corte um fio de platina em seções de 12 centímetros de comprimento.

Dobre manualmente cada seção de cinco centímetros em uma forma L, deixando uma extremidade de três centímetros de comprimento, e a outra de dois centímetros de comprimento. Em seguida, corte o fio revestido de prata em dois comprimentos de 35 centímetros. Insira a extremidade mais longa e dobrada de um fio de platina no orifício perfurado, deixando de um a dois milímetros salientes do lado de fora da tampa.

Dobre-o usando fórceps. Depois, fixe os fios de platina nos orifícios da tampa com cola super condutora e deixe-os secar por aproximadamente seis horas. Para preparar os cátodos, solde as pontas de todos os seis fios de platina que se projetam da tampa para um dos fios revestidos de prata.

Para preparar os ânodos, solde os seis fios de platina restantes para outros fios revestidos de prata. Posteriormente, adicione LEDs no circuito entre cada um dos seis pares de eletrodos de platina de ânodo-cátodo para confirmar a funcionalidade. Coloque um pedaço de fita de isolamento preto sob cada LED para evitar expor as células nas placas de cultura à luz LED.

Em seguida, cole o conector do bloco do terminal de arame no canto superior esquerdo da tampa da placa de seis poços, e conecte ambos os fios revestidos de prata aos terminais de entrada. Em seguida, corte uma seção quadrada de 20 milímetros por 20 milímetros do canto superior esquerdo de uma segunda tampa de placa de seis poços, para acomodar o conector do bloco terminal na primeira tampa. Cubra a primeira tampa, equipada com os eletrodos, com a segunda tampa, e tape-as junto com fita adesiva.

Conecte uma extremidade dos dois fios de cobre isolados padrão aos terminais de saída do conector do fio, e a outra extremidades aos conectores machos de banana. Ligue a fonte de alimentação pressionando o botão ON-OFF no painel frontal. Ative o canal um pressionando o botão um.

Depois, pressione o botão quatro para definir a tensão. Defina a saída de carga em 2,5 volts. Em seguida, pressione Enter.

No dia em que as células são tratadas com haste E, esterilizar os eletrodos em solução de 70% de etanol por 30 minutos. Em seguida, seque-os sob luz UV em um gabinete de segurança por mais 30 minutos. Em uma capa de fluxo laminar, cubra a placa de seis poços contendo os MSCs cultivados com a tampa equipada com os eletrodos, certificando-se de que os eletrodos estão completamente submersos no meio.

Em seguida, transfira a placa coberta de seis poços com células para a incubadora e conecte seus fios à fonte de alimentação. Em seguida, defina a fonte de alimentação para a saída de carga de 2,5 volts e trate as células com haste E por uma hora. Após a estimulação, desconecte a fonte de alimentação e remova a câmara de haste E da incubadora.

Em condições estéreis, substitua a tampa, equipada com eletrodos, por uma tampa de placa padrão de seis poços. Posteriormente, devolva as células à incubadora e deixe-as durante a noite. Limpe os eletrodos, primeiro com PBS, e depois com solução de 70% de etanol.

Em seguida, limpe os produtos de corrosão acumulados da superfície do eletrodo com lixa fina. Repita o tratamento de haste E por seis dias consecutivos. No quarto dia, antes de aplicar estimulação elétrica, e em condições estéreis, mude o meio de cultura aspirando 1,5 mililitros de médio e substituindo-o por 1,5 mililitros de meio de diferenciação osteogênica pré-aquecido e fresco.

Após a aplicação de estimulação elétrica por sete dias consecutivos, mantenha as células na cultura por mais sete dias, trocando o meio a cada três ou quatro dias. Quando o tratamento for concluído, analise as alterações da morfologia celular sob um microscópio. Para avaliar o efeito da estimulação elétrica na diferenciação osteogênica do MSC, meça a deposição de cálcio, a atividade alcalina de fosfattase e a expressão genética do marcador osteogênico, como descrito em outros lugares.

Para avaliar o efeito de 100 milivolts por milímetro de estimulação elétrica na diferenciação osteogênica do MSC, as células tratadas com estimulação elétrica durante três, sete e 14 dias e células não tratadas foram analisadas no dia 14 da cultura, avaliando alterações morfológicas e deposição de cálcio. Mudanças significativas na morfologia celular e depósitos de cálcio foram visíveis em células tratadas com estimulação elétrica durante sete e 14 dias. Uma análise detalhada das alterações de expressão genética do marcador osteogênico foi realizada nos dias três, sete e 14 da cultura.

No sétimo dia de cultura, a expressão RunX2 foi significativamente maior em células tratadas com estimulação elétrica durante sete dias. Considerando que a expressão colla1 foi significativamente maior nas células tratadas durante sete dias, medida no dia 14 da cultura. A expressão da osteopontina aumentou significativamente em células eletricamente estimuladas nos dias três, sete e 14 da cultura.

A expressão otérix estava ausente nas células de controle em todos os pontos de tempo, e era vista apenas aos sete e 14 dias de cultura em células expostas à estimulação elétrica. A câmara de estimulação elétrica é relativamente fácil de construir. No entanto, deve-se tomar cuidado especial ao manusear os fios de platina, e também ao limpar e esterilizar os eletrodos.

Células pré-tratadas com eletricidade em nossa câmara, sozinhas ou sentadas em um material de andaime, poderiam ser implantadas em modelos animais, para estudar como o efeito positivo da estimulação elétrica persiste in vitro. Esta técnica fornece uma ferramenta simples, mas poderosa, para estudar o mecanismo pelo qual a estimulação elétrica regula as funções celulares. Esse conhecimento pode estar disponível em células medicinais regenerativas.