Name: A longo prazo conflito sensorial em livremente, comportando-se ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprenda a criar conflito sensorial persistente em ratos de comportamento livre para estudar aprendizado de longo prazo. Este método combina abordagens in vivo e in vitro para investigar mecanismos neurais de adaptação vestibular.

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Agradecemos a Patrice Jegouzo de dispositivos de cabeça e headpost de desenvolvimento e produção. Agradecemos também P. Calvo, r. Mialot e E. Idoux por sua ajuda no desenvolvimento de versões anteriores do dispositivo e protocolo VVM.
Este trabalho foi financiado pelo Centre nacional des Etudes Spatiales, o CNRS e a Université Paris Descartes. J. C. e M. B. recebem apoio do francês ANR-13-CESA-0005-02. F. F. B. e M. B. recebem apoio do francês ANR-15-CE32-0007.

Todos os animais procedimentos seguidos os regulamentos animais da Universidade de Paris Descartes.
1. montagem do dispositivo
Nota: O dispositivo usado neste protocolo é uma estrutura de capacete fixada em crânios de ratos por meio de um headpost implantado.
<ol><li>Usando uma impressora 3D e branco opaco poli (ácido lático) (PLA) plástico, impressão usando os arquivos de projeto e especificação fornecidos aqui (veja a Tabela de materiais) para o dispositivo e headpost. Nota: As dimensões do dispositivo são mostradas na Figura 1 e dimensões do headpost mostrado na Figura 2.</li>
	<li>Um dispositivo listrado, bem como sham devem ser testadas (Figura 2A11). Para obter o modelo listrado, usando esmalte preto, desenhe grandes listras verticais de 3 mm da superfície exterior do dispositivo. A condição de Souza não requer qualquer modificação para o dispositivo impresso.</li>
</ol>2. cirurgia de implante de Headpost
Todos os materiais utilizados neste protocolo são detalhados na lista de materiais nas informações complementares. Os passos 2,7-2,9 uso os biomateriais fornecidos na implantação kit (veja a Tabela de materiais). Assegurar a utilização de instrumentos esterilizados e marcar a cirurgia e recuperação em zonas diferentes. Uma vez dominado, o procedimento de implante dura cerca de 30 min.
<ol><li>Para analgesia, 30 min antes do início da cirurgia, por via subcutânea injetar buprenorfina (0,05 mg/kg) e colocar de volta o animal em sua jaula para casa. Nota: Efeitos analgésicos do Buprenorphine duram aproximadamente 12 h, tempo após o término do procedimento. Em nossa experiência, os ratos não mostram sinais de perigo relacionados a esta intervenção, mas uma dose subsequente de 0,05 mg/kg a buprenorfina é recomendada 24 h após a cirurgia.</li>
	<li>Anestesia o animal em uma câmara com gás de isoflurano 2,5% - 3%. Espere 3 min e verifique se o mouse é devidamente anestesiado, observando a respiração e a falta de movimento no interior da câmara. Passe o mouse para um cone de nariz numa mesa cirúrgica com uma almofada de aquecimento e, beliscando interdigital, verifique se que há nenhum reflexo de retirada e abaixar o isoflurano para 1,5%.</li>
	<li>Raspe a cabeça do rato usando um barbeador elétrico. Para obter um ambiente estéril, esfregar a área depilada com solução de iodo e depois com álcool a 70%. Repita este procedimento mais duas vezes.</li>
	<li>Cloridrato de lidocaína (2%, 2 mg/kg) de injetar sob a pele da cabeça para a anestesia local e espere 5 min. para os efeitos começar. Para evitar lesões oculares devido à secura, cubra os olhos do rato com pomada tópica oftálmica vet.</li>
	<li>Com um par de pinças rombas, agarre a pele na parte de trás da cabeça e com um par de tesouras (ou bisturi), fazer uma incisão longitudinal de cerca de 1,5 cm para expor o crânio.</li>
	<li>Com a ajuda de um bisturi, arranhe o periósteo. Tenha cuidado para não arranhar muito, como a fixação do headpost pode ser comprometida se o crânio começou a sangrar um pouco.</li>
	<li>Aplique uma gota do ativador verde no meio do crânio. Isto irá melhorar a fixação do cimento por aumento da permeabilidade do osso.</li>
	<li>Preparar o cimento: Misture uma colher (fornecida no kit de implantação) de polímero com cinco gotas de monômero e uma gota de catalisador. Com a ajuda de um pincel, aplique uma quantidade generosa da mistura cimento entre os marcos de crânio lambda e bregma;</li>
	<li>Rapidamente, coloque o headpost sobre o cimento com um movimento percorrendo vai de lambda bregma. Depois que o headpost tem sido colocado, reaplique mais cimento ao redor da parte inferior para garantir que o headpost corretamente varas para o crânio. Para garantir a fixação adequada, certifique-se que o cimento é aplicado abundantemente e que seca antes de continuar para a próxima etapa. Nota: Com este procedimento de fixação, o headpost não sai e permitir testes repetidos, a longo prazo; em nossas mãos, headpost remoção é < 10%.</li>
	<li>Prepare a mistura de resina aplicando uma proporção pó-para-líquido que permite uma suave consistência da mistura. Aplique a resina onde aplicou-se o cimento, bem como em torno do headpost para proteger sua superfície.</li>
	<li>Espere 3 min para a resina secar e fechar a pele na parte de trás das orelhas com sutura de monofilamento. Com um cotonete, aplicar diluído (10% - 20%) solução de iodo para a área operada. Nota: Certifique-se que a pele não ficar preso à resina.</li>
	<li>Desligue a anestesia e colocar o animal sob uma luz vermelha quente para evitar a hipotermia. Coloque o alimento umedecido e hidrogel ou outra fonte de água, com base em gel no chão da gaiola. Não deixe o mouse sem vigilância até recobrar a consciência. Assim que o animal se recupere totalmente do procedimento (geralmente, 30 min a 1 h depois), coloque-o em uma gaiola com grupos de três ou quatro para estimular interações sociais.</li>
</ol>3. fixação de dispositivo
<ol><li>48 h após a cirurgia, fixar o dispositivo de cabeça custom-built para a headpost.<ol>
<li>Usando um par de parafusos de 1.2 mm e uma chave de fenda (hex de 1,3 mm), alinhe os orifícios no dispositivo listrado com os furos no headpost, coloque os parafusos e fixá-los. Para corrigir a condição de Souza, rode o dispositivo de cabeça para baixo e, com a parte traseira (Figura 1A) do dispositivo voltada para a direção rostral, alinhe os orifícios no dispositivo com os orifícios da headpost. Nota: É recomendável que essa etapa ser feito por dois operadores, um segurando o mouse com um apoio de uma mão do mouse, enquanto o outro fixar o dispositivo para o headpost. Se a fixação é feita por um único operador, o dispositivo pode ser colocado, enquanto o mouse está sob anestesia de gás.</li>
		<li>Verifique se o dispositivo está bem preservado e não pode ser removido pelo animal e que o dispositivo não se aplica pressão diretamente no nariz do rato, que poderia potencialmente causar dor, dificuldade para respirar, ou lesão de pele. Nota: Também é importante assegurar que o dispositivo é inserido simetricamente na face do mouse, para que os olhos são completamente cobertos pelo dispositivo de cabeça. Verifica que o animal não mostra sinais de dor anormal ou aflição.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deixe o dispositivo do mouse durante 14 dias.</li>
</ol>4. animais cuidados e vigilância
<ol><li>Uma vez em suas gaiolas, ratos irão expor certas anomalias no comportamento. Em primeiro lugar, o animal pode ficar prostado e tente remover o dispositivo usando suas dianteiras, mas isto deve parar após a primeira hora. Durante as próximas horas seguintes, o animal geralmente exibirá dificuldades, orientando-se dentro da jaula e atingindo por comida e água. Portanto, durante a 48 h pós-implante, monitorar os ratos e acesso fácil a água e comida, colocando ambos diretamente sobre o chão da gaiola, por exemplo.</li>
	<li>Manter o controle de pesos de ratos durante a duração do protocolo. Os ratos logo após implantação de pesar e novamente cada 24 h. atenção especial deve ser dada aos animais usando o dispositivo de listrado, como normalmente experimentam a perda de peso corporal (1-2 g) durante as primeiras 48 horas, mas começar a ganhar peso novamente em um ritmo normal seguinte esse período inicial (ver Figura 2B11).</li>
	<li>Depois de 2 dias, os ratos são esperados para retornar para suas faculdades regulares. Dependendo do sistema utilizado nas instalações de animais, o dispositivo pode estar impedindo o acesso à comida e água. Garantir que o animal está à vontade ao mesmo tempo comendo e bebendo ou adaptar o sistema de distribuição em conformidade. Nota: A gama de movimentos da cabeça produzido pelos animais, depois de alguns dias com o dispositivo na não é modificada pelo dispositivo (consulte a Figura 2,11) (i. e., a gama de movimentos da cabeça produzida permanece semelhante ao naturais movimentos da cabeça).</li>
	<li>Para garantir ainda mais o bem-estar do ratos, assegurar a vigilância diária e aplicar a escala qualitativa (tabela 1) de bem-estar durante toda a duração do protocolo.</li>
	<li>Remova um mouse de protocolo em curso se aplicarem um ou mais dos seguintes critérios:<ol>
<li>Ratos que têm um total pontuação maior do que 4 pontos na escala qualitativa acima imediatamente devem ser excluídos do experimento (ver tabela 1). Independentemente da pontuação, se o mouse não recuperar seu peso inicial após 6 dias, o procedimento deve ser interrompido.</li>
		<li>O dispositivo corretamente não é fixo para o headpost se, por exemplo, o headpost treme quando tocado, ou uma parte começa a sair. Isto faz com que o headpost vir a cabeça do rato e, consequentemente, interrompe a aprendizagem, o que explica porque vigilâncias diárias são necessárias.</li>
		<li>Quando um rato tem seu headpost arrancado durante qualquer parte do protocolo. Devido o crânio sangramento associado a este descolamento, a cirurgia de reimplante tem uma taxa de sucesso de baixo e não vale a tentativa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. remoção do dispositivo
<ol><li>Após o período de aprendizagem (no presente protocolo 14 dias), retire o dispositivo seguindo as mesmas instruções quanto à sua fixação (secção 3). Assim que o dispositivo é removido, teste os ratos com experiências tais como testes de vídeo-eculografia, ou, por exemplo, em vitro eletrofisiologia conforme descrito anteriormente,11. Nota: quando o dispositivo é retirado, ratos são expostos para o ambiente padrão, visualmente desobstruído. Portanto, realizar experimentos que visam testar os efeitos de aprendizagem deste dispositivo diretamente após a sua remoção.</li>
</ol>6. sessões de vídeo-eculografia
Nota: Para gravar os movimentos oculares gerado enquanto o animal está sendo rodado no escuro (-cefálico, VOR) ou girando entorno do animal enquanto o animal é ainda (reflexo optocinético, OKR), são realizados experimentos de vídeo-eculografia. Cada rato foi testado para ambos estes reflexos antes e após o protocolo de adaptação. Para mais detalhes sobre a configuração de vídeo-eculografia, consulte relatórios anteriormente publicados12,13. Para se habituar os ratos a gravação contida condições, o dia antes do início da gravação, colocar o animal no tubo no centro do prato giratório para 10 minutos sem executar qualquer teste.
<ol><li>Prenda o mouse no gira-discos, cabeça-corrigi-lo com a ajuda dos parafusos inseridos no headpost. Coloque uma cúpula de tela em torno do animal e desligar todas as luzes na sala, exceto o projetor optocinético. Nota: As gravações de vídeo-eculografia exigem o animal ser ainda e com seus olhos abertos. Interromper a sessão de gravação e coloque o animal de volta na sua jaula no caso do mouse não voluntariamente manter seus olhos abertos, ou se a aparência do olho se deteriora durante a sessão de gravação. Outra tentativa pode ser feita após um período de repouso de pelo menos 12h.</li>
	<li>Começa a estimulação de campo integral OKR (projeção de ponto branco padrão) e registro em várias velocidades diferentes direções no sentido horário e contador no sentido horário. Logo que as gravações terminaram, retire a cúpula.</li>
	<li>Para ser capaz de gravar o VOR no escuro como breu, aplica uma gota de pilocarpina 2% para os olhos de14. Espere pelo menos 5 min para ele agir e removê-lo suavemente com um cotonete. A pilocarpina manterá o aluno constrangido com um tamanho constante durante as medições, permitindo a adequada quantificação dos movimentos no escuro.</li>
	<li>Desligue todas as luzes na sala e adicionar uma caixa em cima da plataforma giratória para manter o animal em tom escuro. Inicie o VOR horizontal usando rotações angulares sinusoidais em torno de um eixo vertical com frequências diferentes e/ou velocidades diferentes.</li>
	<li>Finalizada a sessão de gravação, retorne o mouse para uma gaiola adequadamente iluminada com uma lâmpada infravermelha. O calor irá evitar hipotermia causada pelos efeitos vasodilatador secundários da pilocarpina sobre o corpo do mouse. Nota: Devido o animal sendo contido, as sessões de gravação não podem durar mais de 90 min. Quando as sessões de teste adicionais são necessários, deixar o animal descansar por 24h entre as sessões.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

A perturbação sensorial a longo prazo descrita aqui é composto por uma incompatibilidade de visão-vestibular produzida em camundongos livremente-comportar-se. Para implantar o dispositivo que ratos usam durante 14 dias, é realizada uma cirurgia simples e curta, usando um kit cirúrgico disponível comercialmente. Camundongos recuperar em menos de 1 h, a partir deste procedimento de implantação de headpost e não apresentem associados sinais de aflição dele. Posteriormente, no exemplo dado da aplicação do presente protocolo, VOR e OKR são medidos usando a técnica de vídeo-eculografia. No entanto, este protocolo de aprendizagem a longo prazo induzidas pelo dispositivo pode ser usado em uma variedade de experiências como in vitro de eletrofisiologia1, imagem neuronal e vários ensaios comportamentais. A lógica por trás do desenvolvimento desta técnica foi inspirada a metodologia baseada em prisma usada em humanos e macacos. Esta técnica, no entanto, é diferente porque isso prejudica ao invés de modifica a visão. Assim, um caso extremo de incompatibilidade de visão-vestibular constitui (em sua forma atual). Os autores acreditam que as informações técnicas fornecidas podem ser úteis para projetar uma versão prisma do dispositivo ou desenvolver dispositivos de restrição da característica específica16.
Feito de um poli de luz (0,9 g) (ácido lático) plástico, o dispositivo de cabeça foi projetado para caber a cabeça de um rato adulto jovem, permitindo que a proteção do focinho e deixando espaço suficiente lateralmente para permitir que o noivo animal. A parte dianteira deste dispositivo expõe o fim do focinho para permitir a alimentação e grooming comportamentos. O dispositivo é ligeiramente opaco, para que o animal é privado de uma visão precisa do entorno, mas ainda recebe estimulação de luminância. As listrado e sham implantações são testadas para garantir que os efeitos medidos são devidos principalmente para a visão-vestibular incompatibilidade causada pelo sinal visual durante os movimentos auto-gerada do dispositivo listrado alto contraste e não pela proprioceptiva modificação (ou seja,, o peso do dispositivo aplicado em mouse´s de cabeça e pescoço).
Experimentalmente, os ratos que usava o dispositivo listrado mostrou um significativo VOR ganham redução de 50% após o período de aprendizagem; Ainda assim, pode haver uma variabilidade inter-individual para valores de ganho absoluto. Ratos de Souza mostraram nenhum significativo VOR ganhar alterações, demonstrando assim que a redução de VOR é causada pelo conflito sensorial e não por deficiência motora. Além disso, os ratos jovens (< P26) mostrou para VOR e OKR ganham valores inferiores de animais mais velhos17. Por esse motivo, idade do animal tem que ser tidos em conta ao planejar o experimento. Finalmente, os critérios de exclusão de ratos acima mencionadas (seção 4.5) são uma etapa crucial que deve ser seguida para garantir o bem-estar, bem como estabelecer resultados fiáveis.
Uma das vantagens deste protocolo é o tempo que poupa experimentadores durante o período de aprendizagem, em comparação com outros tipos de protocolos de adaptação de VOR/OKR. Até agora, adaptação de VOR em ratos tem sido estudada por cabeça-fixação e treinamento do animal em uma rotação gira-discos6,8,18,19, que é demorada, especialmente quando um monte de animais deve ser treinados. O protocolo apresentado permite o treinamento de vários animais de uma só vez e economiza tempo. Além disso, nesses experimentos clássicos os treinamentos são normalmente limitados a 1 h por dia, deixando a longos períodos de desaprender putativo que causam adaptação ser uma alternância iterada de aprendizagem/desaprender com diferentes dinâmicas20. Aqui, a cabeça-fixação do dispositivo permite a aprendizagem ininterrupta. Outra vantagem é que, desde o período de aprendizagem é gerado em uma situação de cabeça-livre comportamento livremente, ratos são capazes de aprender através de uma gama de movimentos da cabeça naturais ativamente gerados. Nos protocolos clássicos, o animal é cabeça-corrigido enquanto passivamente sendo girado no gira-discos, para que a aprendizagem ocorre em um determinado estímulo (uma frequência, uma velocidade)21 que não reflete a variedade natural de movimentos da cabeça. É importante notar que o sistema vestibular codifica os movimentos de forma diferente quando eles são ativamente gerados pelo sujeito ou quando externamente aplicado10; assim, os mecanismos celulares desencadeados em ambas as situações também podem ser diferentes.
Em geral, a metodologia descrita é adequada para estudos in vivo/in vitro/combinada sobre adaptações sensoriais a longo prazo, ocorrendo após um conflito visual e/ou incompatibilidade de visão-vestibular em livremente se comportando ratos. Conflitos sensoriais são uma causa reconhecida de doença de movimento, que é um campo que tem atraído recentemente o uso de ratos22,23. Recentemente foi demonstrado que a adaptação de ganho, causada pelo uso deste dispositivo oferece proteção contra a doença de movimento, quando os ratos estão expostos a um estímulo provocador de15. Portanto, este protocolo pode ser usado para identificar os mecanismos celulares subjacentes a adaptação a um conflito sensorial também desenvolver tratamentos antienjôo.

Conflitos sensoriais, tais como os visuais, estão presentes no cotidiano, por exemplo, quando um usa óculos ou durante uma vida inteira (crescimento do desenvolvimento, alterações na acuidade sensorial, etc.). Devido a um olhar de anatomia, facilmente controladas entradas sensoriais, saídas motor quantificáveis e de métodos de quantificação precisa1, circuito bem-descrito reflexos de estabilização têm sido usados como modelos de motor de aprendizagem em muitas espécies. Nos seres humanos e macacos, a adaptação de (VOR) reflexa vestíbulo-ocular é estudada através do uso de prismas que o assunto usa-se por vários dias,2,3,4,5. Desde que o modelo de roedor permite a combinação de experimentos comportamentais e celulares, desenvolvemos um novo método para criar conflito sensorial a longo prazo em livremente, comportando-se ratos com um capacete como um dispositivo. Inspirado pela metodologia utilizada em seres humanos e macacos, o protocolo gera uma incompatibilidade entre as vestibulares e visuais entradas (ou seja, de visão-vestibular incompatibilidade, VVM) que leva a uma diminuição no ganho de VOR.
Protocolos clássicos, desencadeando uma adaptação de baixo ganho VOR em roedores consistem em girar o animal cabeça-fixo em uma plataforma giratória enquanto roda o campo visual na fase. Este paradigma cria um conflito visão-vestibular, o que torna o VOR contraproducente. Protocolos de adaptação a longo prazo consistem em uma iteração deste procedimento ao longo de vários dias consecutivos6,7,8. Como resultado, quando um grande grupo de animais precisa ser testado, metodologia clássica requer uma grande quantidade de tempo. Além disso, porque o animal é cabeça-fixo, a aprendizagem principalmente é limitada a uma frequência/velocidade discreta e consistem em treinamentos descontínuos interrompidos por intertrial intervalos de duração variável de6. Finalmente, protocolos clássicos usam aprendizagem passiva, como a estimulação vestibular não é ativamente gerada por movimentos de voluntariado do animal, uma situação que molda muito processamento vestibular9,10.
As restrições acima mencionadas experimentais são superadas pela metodologia inovadora apresentada. A abordagem cirúrgica necessária é simples, e os materiais utilizados estão prontamente disponíveis comercialmente. A única parte que se baseia em material mais caro é a quantificação do comportamento; no entanto, os fundamentos do protocolo podem ser utilizados para qualquer experiência, de investigações em vitro para outros estudos comportamentais da aprendizagem. Em geral, gerando uma deficiência visual temporária e um conflito de visão-vestibular durante vários dias, esta metodologia pode facilmente ser transposta para qualquer estudo em causa com perturbação sensorial ou aprendizagem motora.

<table><tbody><tr><td>Impressora 3D</td><td>Ulimaker, EUA</td><td>Tesoura Blunt S5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FST</td><td>14079-10</td><td></td></tr><tr><td>Catalyst V</td><td>Sun Medical, Japão</td><td>LX22</td><td>Parkell bio-materiais, Kit n&deg; S380</td></tr><tr><td>Dentalon Plus</td><td>Heraeus</td><td>37041</td><td></td></tr><tr><td>Sistema e software de rastreamento ocular</td><td>Iscan</td><td>ETN200</td><td></td></tr><tr><td>Ativador verde</td><td>Sun Medical, Japão</td><td>VE-1</td><td>Parkell bio-materiais, Kit n&deg; S380</td></tr><tr><td>Monomer</td><td>Sun Medical, Japão</td><td>MF-1</td><td>Parkell bio-materiais, Kit n&deg; S380</td></tr><tr><td>Ocrygel</td><td>TvmLab</td><td>10779</td><td>Pomada veterinária oftálmica</td></tr><tr><td>Polímero L-type clear (cimento)</td> <td>Sun Medical, Japão</td><td>TT12F</td><td>Parkell bio-materials, Kit n&deg; S380</td></tr><tr><td>Sketchup</td><td>Software</td><td>de modelagem 3D Trimble usado para o arquivo de design pronto para impressão do dispositivo</td>Toca-discos Não disponível comercialmente <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a longo prazo conflito sensorial em livremente, comportando-se ratos

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Protocolos de conflito sensorial a longo prazo são um valioso meio de aprendizagem motora a estudar. O protocolo apresentado produz um persistente conflito sensorial para experimentos vista estudar aprendizagem a longo prazo em ratos. Permanentemente usando um dispositivo fixado em suas cabeças, ratos são continuamente expostos à incompatibilidade sensorial entre visuais e vestibulares entradas ao mover-se livremente em jaulas em casa. Portanto, este protocolo permite facilmente o estudo do sistema visual e interações multisensorial ao longo de um período prolongado que caso contrário, não seria acessível. Além de abaixar os custos experimentais de aprendizagem sensorial a longo prazo em naturalmente, comportando-se ratos, esta abordagem acomoda a combinação de experimentos in vivo e in vitro . O exemplo relatado, vídeo-eculografia é realizada para quantificar o reflexo vestíbulo-ocular (VOR) e o reflexo optocinético (OKR) antes e depois da aprendizagem. Ratos expostos a este conflito sensorial a longo prazo entre visuais e vestibulares entradas apresentada uma forte diminuição de ganho VOR, mas exibiram poucas mudanças OKR. Passos de montagem do dispositivo, cuidado animal, detalhados e reflexas medições são relatadas por este meio.

As figuras a seguir ilustram os resultados obtidos com ratos que foram submetidos a protocolo de adaptação de 2 semana vestindo também um dispositivo listrado ou sham. A Figura 3 mostra um exemplo de vestígios crus visto durante as sessões de gravação. Como mostrado, comparando os traços, a resposta VOR diminui após o protocolo VVM (Figura 3A, antes vs depois listrado). O VOR de ratos de Souza permaneceu inalterada após a adaptação (Figura 3A, antes vs depois da farsa). A OKR de ratos usando o dispositivo listrado (Figura 3B) é comparável ao período antes do protocolo VVM e sham a ratos. Figura 4 mostra um exemplo de quantificação dos ganhos médios VOR em uma frequência fixa de 0,5 Hz e em 40 graus por segundo, antes e após o protocolo VVM, para dispositivos listrados e sham. Há uma diminuição forte ganho depois de ratos usavam o dispositivo listrado, enquanto que os ratos de Souza não apresentaram alterações de ganho significativo. Efeitos da diminuição VOR testado em diferentes velocidades/frequências foram relatados por Carcaud et al.11 e Idoux et al.15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig1.jpg"> Figura 1 : Dispositivo de cabeça representado com dimensões em milímetros. Exibições: (A) de volta, lado (B), inferior (C) e (D) aéreo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig2.jpg"> Figura 2 : Headpost retratado com dimensões em milímetros. Fixo na implantação cirurgia, esta luz (0,2 g) headpost plástico poli (ácido láctico) permite o travamento do dispositivo adaptação para o rato e o cabeça-fixação do animal no prato durante as sessões de vídeo-eculografia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig3v2.jpg"> Figura 3 : Traços crus de exemplo de movimentos oculares durante estimulações VOR e OKR. (, À esquerda) Esquerda: VOR apresentou a 0,5 Hz no 40 ° /s e estimulação de optocinético (B, direita) a uma velocidade constante de 10 ° /s (linha preta), em sentido horário, antes (linhas verdes) e depois (amarelo) usando o dispositivo (roxo) listrado ou sham. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59135/59135fig4v2.jpg"> Figura 4 : Exemplo média VOR e OKR ganham valores após adaptação ao dispositivo ou listrado ou sham. Os ganhos foram plotados de acordo com o tempo (dias) para o listrado (n = 10) e sham (n = 6) dispositivos em estímulos de 40 ° /s e 0,5 Hz para o VOR (à esquerda) e 10 ° /s ponteiros para o OKR (à direita). Na escala de tempo, "antes de" dia representa o dia imediatamente anterior a adaptação e "dia 0" representa o dia quando o dispositivo é removido. Barras de erro representam o desvio padrão, * * * p &lt; 0,001, não significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/59135fig4v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Pontos</td>
			<td>Alterações de peso de corpo</td>
			<td>Aparência física</td>
			<td>Comportamento</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>nenhum ou ganho de peso</td>
			<td>padrão</td>
			<td>Não há sinais de socorro e locomoção normal</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>perda de peso &lt; 10%</td>
			<td>nenhum corpo de aliciamento</td>
			<td>orientação deficiente de locomoção ou gaiola</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>perda de peso entre 10-20%</td>
			<td>desidratação</td>
			<td>--</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>perda de peso &gt; 20%</td>
			<td>feridas</td>
			<td>tiques nervosos (por exemplo, arranhar, morder)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: escala qualitativa para a avaliação do bem-estar. Estão listados os parâmetros qualitativos que devem ser avaliados durante a duração do protocolo. As alterações de peso soma, aparência física e golo de comportamento não deve ser superior a quatro pontos.
Arquivo suplementar 1. Device.STL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/Device.stl" target="_blank">por favor clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 2. Headpost.STL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59135/Headpost.stl" target="_blank">por favor clique aqui para baixar este arquivo.</a>

O protocolo apresentado produz um persistente conflito sensorial para experimentos vista estudar aprendizagem a longo prazo. Permanentemente usando um dispositivo fixo em suas cabeças, ratos são continuamente expostos à incompatibilidade sensorial entre visuais e vestibulares entradas ao mover-se livremente em jaulas em casa.

A longo prazo conflito sensorial em livremente, comportando-se ratos

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

O objetivo geral deste protocolo é produzir um conflito sensorial persistente para o estudo da aprendizagem de longo prazo em camundongos que se comportam livremente. Diminuindo o custo experimental e o tempo de aprendizado sensorial, essa abordagem acomoda a combinação de experimentos in vivo e in vitro. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um rato sedado, use um par de fórceps contundentes para agarrar a pele na parte de trás da cabeça e usar uma tesoura para fazer uma incisão longitudinal de um cm e meio para expor o crânio.Coce suavemente o periosteum com um bisturi e aplique uma gota de ativador verde no meio do crânio para aumentar a permeabilidade óssea. Em seguida, misture uma colher cheia de polímero do kit de implantação com cinco gotas de monômero e uma gota de catalisador e escove uma generosa mistura de cimento entre os marcos do crânio de lambda e bregma. Usando um movimento de deslizar de lambda para bregma, coloque rapidamente o headpost sobre o cimento e reaplique cimento adicional ao redor da parte inferior do poste para garantir que o poste grude firmemente no crânio.Enquanto o cimento estiver secando, misture o pó de resina com líquido de resina a uma consistência suave e aplique a mistura de resina resultante no cimento seco e ao redor do poste. Depois de permitir que a resina seque por três minutos, use uma sutura Vicryl 4-0 para fechar a pele na parte de trás das orelhas e use um cotonete para aplicar uma solução de 10 a 20% de iodo à incisão. Em seguida, coloque o animal sob uma luz vermelha com monitoramento até a recuperação completa.Quarenta e oito horas após a cirurgia alinham os orifícios no dispositivo listrado com os orifícios no poste e usam uma chave de fenda hexais de 1,3 mm e dois parafusos de 1,2 mm para fixar o dispositivo no poste. Recomendamos fixar o dispositivo no poste com a ajuda de um segundo operador para evitar o risco de arrancar o poste ou ferir o animal com a chave de fenda. Para corrigir a condição falsa, gire o dispositivo de cabeça para baixo e com a parte traseira do dispositivo voltada para a direção rostral alinhe os orifícios no dispositivo com os orifícios no poste.Confirme que o dispositivo está bem protegido e não pode ser removido pelo animal e que o dispositivo não aplica pressão diretamente no nariz, o que pode causar dor, dificuldades respiratórias ou lesões na pele. Como os camundongos podem apresentar algumas anormalidades comportamentais durante as primeiras 48 horas de uso do dispositivo, monitore os animais de perto durante este tempo e forneça fácil acesso à comida e água até que os animais se aclimatem. Pesar os camundongos imediatamente após a implantação e novamente a cada 24 horas depois até o final do experimento, dando atenção especial aos ratos que usam o dispositivo listrado.Para registrar a resposta sensorial dos animais adaptados ao dispositivo, fixe o primeiro mouse na mesa giratória com os parafusos inseridos no poste e coloque uma cúpula de tela ao redor do animal. Desligue todas as luzes da sala, exceto o projetor optokinetic e inicie a gravação de estimulação de campo completa do reflexo optokinetic em várias velocidades diferentes nas direções no sentido horário e anti-horário. Assim que as gravações acabarem, remova a cúpula e acenda as luzes.Para registrar o reflexo vestibulo-ocular no escuro do tom, aplique uma gota de 2% de pilocarpina nos olhos do animal e espere pelo menos cinco minutos antes de remover suavemente a pomada com um cotonete. Desligue todas as luzes novamente e coloque uma caixa sobre o toca-discos para manter o animal no escuro. Antes de iniciar o teste de reflexo vestibulo-ocular horizontal usando rotações angulares sinusoidais em torno de um eixo vertical com diferentes frequências e/ou velocidades diferentes.Quando a segunda sessão de gravação estiver concluída, devolva o rato à sua gaiola sob uma lâmpada infravermelha com monitoramento até que o animal seja totalmente recuperado dos efeitos vasodilatadores secundários da pilocarpina. Depois de duas semanas usando uma farsa ou um dispositivo listrado, as respostas reflexais vestibulo-oculares dos ratos falsos permanecem sem mudança após a adaptação, enquanto os animais listrados adaptados ao dispositivo demonstram uma resposta reflexo drasticamente comprometida. A quantificação do reflexo vestibulo-ocular médio ganha em uma frequência fixa de 0,5 hertz e a 40 graus por segundo antes e depois do protocolo de incompatibilidade visual-vestibular revela uma forte diminuição do ganho nos camundongos que usavam o dispositivo listrado, enquanto os ratos falsos não apresentaram mudanças significativas de ganho.No entanto, o reflexo optokinetic de camundongos usando o dispositivo listrado é comparável ao observado para o período anterior ao protocolo visual-vestibular e ao demonstrado pelos animais falsos. Certifique-se de monitorar os ratos diariamente e garantir que o dispositivo esteja corretamente posicionado nos ratos e que isso não impeça suas rotinas. Seguindo este procedimento, pode-se realizar eletrofisiologia in vitro ou imagem neuronal para identificação de mecanismos de adaptação sellar ou ensaios comportamentais para o estudo de diferentes saídas de reflexo.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este artigo apresenta o protocolo de T-maze testes utilizando um aparelho modificado automatizado para avaliar as funções de aprendizagem e memória em camundongos.

T-maze Alternância forçado e Tarefas esquerda-direita para a Avaliação da Discriminação de Trabalho e Memória de Referência em Ratos

Este protocolo descreve um ensaio comportamental, com base no teste de labirinto de Barnes, para estudar como instintiva defensiva ações são modificadas pelo conhecimento do ambiente espacial.

Um ensaio comportamental para investigar o papel da memória espacial durante uma defesa instintiva em ratos

Este protocolo mede aprendizagem espacial e memória usando o labirinto de Barnes. Um novo paradigma de donzela em apuros é usado para avaliar a atividade locomotora e comportamento pró-social em camundongos.

Analisando a aprendizagem espacial e comportamento pró-social nos ratos usando o labirinto de Barnes e paradigmas de donzela em apuros

Aqui apresentamos dois protocolos passo a passo fáceis de colocar paradigmas de preferência usando optogenética em camundongos. Usando essas duas configurações diferentes, comportamentos de preferência e evasão podem ser solidamente avaliados dentro do mesmo aparelho com alta seletividade espacial e temporal, e de forma direta.

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A tarefa da barreira do labirinto Y é um teste de comportamento que examina a motivação para gastar esforço para recompensa. Aqui, discutimos o teste de múltiplos estressores crônicos bem validados, incluindo corticosterona crônica e estresse de derrota social com esse comportamento, bem como o novo estresse crônico de derrota social não discriminatória (CNSDS), que é eficaz nas mulheres.

Estresse crônico muda comportamento de escolha relacionado ao esforço em uma tarefa de barreira y-maze em camundongos

Roedores não são capazes de relatar sintomas de enxaqueca. Aqui, descrevemos um paradigma de teste gerenciável (ensaios de campo claro/escuro e aberto) para medir a aversão à luz, um dos sintomas mais comuns e incômodos em pacientes com enxaquecas.

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Este artigo fornece uma descrição detalhada de um novo protocolo de viés de julgamento do mouse. Evidências da sensibilidade dessa tarefa olfativa de escavação ao estado afetivo também são demonstradas e sua utilidade em diversos campos de pesquisa é discutida.

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O ensaio mecânico de prevenção de conflitos é usado como uma leitura não reflexiva da sensibilidade à dor em camundongos que podem ser usados para entender melhor as respostas afetivas-motivacionais em uma variedade de modelos de dor de rato.

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A maioria dos experimentos de comportamento para roedores foi originalmente concebida para ratos. Devido às diferenças comportamentais entre ratos e camundongos, às vezes são necessárias modificações para camundongos. Apresentamos um método para testar a memória de trabalho espacial em camundongos, minimizando o estresse durante a tarefa de memória de trabalho.

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Ao integrar quatro estressores sociais diários, o presente estudo descreve um modelo de estresse social integrado múltiplo (MISS) para transtornos psiquiátricos em camundongos C57BL / 6J fêmeas. Após dez dias de exposição repetida ao MISS, os camundongos desenvolveram fenótipos depressivos e ansiosos, fornecendo assim um modelo animal natural baseado em etiologia para estudar transtornos psiquiátricos em mulheres.

Um modelo de estresse social integrado múltiplo para transtornos psiquiátricos em camundongos C57BL / 6J fêmeas

O paradigma do medo observacional avalia o congelamento vicário em roedores como um modelo de empatia afetiva. Este procedimento envolve a exposição de roedores observadores a demonstradores coespecíficos que recebem choques aversivos nas patas para provocar respostas empáticas de congelamento. Ao empregar ensaios observacionais de medo, os pesquisadores podem investigar os mecanismos neurais subjacentes à empatia afetiva.

Medo observacional como modelo de empatia afetiva em camundongos

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A longo prazo conflito sensorial em livremente, comportando-se ratos

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