Um ensaio de alta produtividade para avaliar e quantificar a formação de neutrófilos extracelular armadilha

Desenvolvemos um ensaio de alto rendimento para medir armadilhas extracelulares de neutrófilos, ou NETs. NeTs são estruturas de DNA imunogênicos que são expostas por neutrófilos. Os NETs podem capturar e matar microrganismos e, portanto, são um importante mecanismo anti-infeccioso, mas também desempenham um papel patogênico em doenças autoimunes.

Com esta técnica, os NETs são quantificados por microscopia confocal de imunofluorescência tridimensional, resultando em um método altamente sensível e de alta produtividade para estudar a formação e degradação da NET. Essa técnica nos permite quantificar a formação líquida de pacientes com doenças autoimunes. A formação ex vivo NET de pacientes com vasculite associada à ANCA ou lúpus eritmatose sistêmica poderia ser monitorada com este ensaio.

Além disso, potenciais terapêuticas voltadas para a formação de NET poderiam ser testadas com este ensaio in vitro. O isolamento de neutrófilos pode ser uma luta para pessoas que nunca realizaram essa técnica antes. Para iniciar este procedimento, obtenha 20 mililitros de sangue periférico de um doador saudável em dois tubos codificados por EDTA de 10 mililitros.

Transfira 10 mililitros de sangue em um tubo estéril de 50 mililitros e PBS para um volume total final de 32,5 mililitros. Usando um controlador de pipeta e pipeta de 10 mililitros, pegue 14 mililitros de gradiente de densidade. Coloque a pipeta na parte inferior do tubo de 50 mililitros.

Em seguida, tire o controlador de pipeta da pipeta, permitindo que o gradiente de densidade flua por gravidade até que o máximo seja atingido pelo efeito capilar. Coloque um polegar em cima da pipeta para evitar que o gradiente de densidade restante vaze e, em seguida, remova a pipeta do tubo. Centrifugar o tubo a 912 vezes g à temperatura ambiente por 20 minutos sem aceleração ou freio.

Remova cuidadosamente o anel branco contendo as células mononucleares de sangue periféricos primeiro, seguido o plasma diluído pbs. Por último, remova a camada de gradiente de densidade o máximo possível. Em seguida, recupere uma garrafa de água destilada estéril fria e um frasco de PBS concentrado de 10x de uma geladeira.

Trabalhando rapidamente, adicione 36 mililitros da água diretamente em cima da pelota e misture cuidadosamente uma vez. Após 20 segundos contados desde o início, adicione quatro mililitros de PBS de 10x para fazer uma solução isotônica. E, novamente, misture uma vez com cuidado.

Centrifugar o tubo a 739 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernasce, certificando-se de ser extremamente cuidadoso, pois a pelota não é sólida, e repita rapidamente o processo de adição da água destilada estéril fria e concentrada pbs como descrito anteriormente. Centrifugar a 328 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.

Remova cuidadosamente o supernasce e suspenda a pelota em cinco mililitros de PBS. Conte os neutrófilos e mantenha-os no gelo. Primeiro, faça uma suspensão de neutrófilo contendo aproximadamente 10 a 20 milhões de neutrófilos em dois mililitros de PBS em um tubo de 15 mililitros.

Em um tubo diferente de 15 mililitros, misture dois mililitros PBS com quatro microliters de linker de célula fluorescente vermelha de dois micromolar. Adicione suavemente a solução de ligador de células fluorescentes vermelhas à suspensão de neutrófilo e misture cuidadosamente. Enrole o tubo em papel alumínio para proteger a mistura da luz e incubar por exatamente 25 minutos a 37 graus Celsius para rotular os neutrófilos com o linker de célula fluorescente vermelha.

Inative a rotulagem adicionando RPMI 1640 médio contendo FCS inativado de 10% a temperatura ambiente a um volume final de 15 mililitros e misture uma vez cuidadosamente. Se depois disso uma pelota tiver se formado, suspenda cuidadosamente a mistura. Centrifugar o tubo a 328 vezes g à temperatura ambiente por cinco minutos.

Antes de remover o supernasce, certifique-se de que uma pelota se formou. Depois disso, suspenda a pelota em cinco mililitros de meio RPMI 1640 sem vermelho contendo 2% de FCS à temperatura ambiente. Então, conte os neutrófilos.

Faça uma suspensão celular a uma densidade de 420.000 células por mililitro em RPMI 1640 sem fenol, contendo 2% de FCS. Adicione 37.500 neutrófilos em 90 microliters a cada poço de uma placa preta de 96 poços e fundo plano. Em seguida, adicione 10 microliters do estímulo escolhido em triplicado para atingir uma concentração de 10% em cada poço.

Inclua sempre um controle negativo em triplicado. Incubar no escuro a 37 graus Celsius pelo tempo desejado, variando de 30 minutos a dois, quatro ou seis horas. Em seguida, prepare o volume de corante de DNA impermeável necessário para adicionar 25 microliters de corante de DNA impermeável de cinco micromolar para alcançar uma concentração final de um micromolar em cada poço.

15 minutos antes do fim do tempo de incubação, adicione 25 microliters de corante de DNA impermeável de cinco micromolars a cada poço. Continue a incubação para os 15 minutos finais a 37 graus Celsius no escuro. Depois disso, remova o supernatante com muito cuidado e armazene se necessário.

Adicione 100 microliters de 4%paraformaldeído. Mantenha a placa no escuro e prossiga imediatamente para a próxima seção. Depois de configurar as configurações, selecione Série Z.

Selecione 10 como o número de etapas. Selecione três micrômetros como o tamanho da etapa. Coloque a placa no microscópio confocal de imunofluorescência.

Clique na guia Executar. Preencha o nome e a descrição da placa e escolha o local de armazenamento. Selecione os poços que precisam ser adquiridos.

Escolha o tempo de exposição para Texas Red e FITC. Em seguida, clique em Placa de Aquisição e inicie a aquisição, que levará aproximadamente uma hora por placa. Depois disso, selecione Análise Macro.

Em seguida, selecione w1 e escolha o valor de limiar. Em seguida, selecione o valor do pixel desejado. E finalmente, em uma segunda janela Imagem J, selecione w2 e escolha o valor limiar com o valor de pixel desejado.

Selecione um destino para o arquivo da planilha, execute a análise e salve o arquivo de registro posteriormente. Apresentado aqui é um ensaio altamente sensível amplamente aplicável para a quantificação semi-automatizada da formação de armadilha extracelular de neutrófilo para a avaliação da indução ex vivo de armadilhas extracelulares de neutrófilos sobre diferentes estímulos. A formação LÍQUIDA é quantificada de forma tridimensional quantificando DNA extracelular manchado em pilhas de 10 Z com distância de três micrômetros começando no plano focal em cada poço.

Ao medir a área cumulativa, a sensibilidade do ensaio aumenta. A área total de neutrófilos manchados são quantificadas apenas no plano focal em cada poço que se correlaciona significativamente com a contagem total de neutrófilos em cada poço com um coeficiente de correlação de Pearson de 0,99. O resultado representativo da quantificação da formação líquida em neutrófilos é expresso como área de DNA extracelular manchado cumulativo sobre 10 Z-stacks por neutrófilo imagem.

Os instantâneos são então tirados do ensaio de quantificação da rede. Imagens representativas de neutrófilos não estimulados e de NETs em neutrófilos estimulados pela AAV são mostradas aqui com os neutrófilos rotulados por fluorescentes em vermelho e o DNA extracelular manchado em verde. Os neutrófilos devem ser tratados com cuidado, e a rotulagem PKH deve ser realizada exatamente de acordo com o protocolo.

Este ensaio pode ser usado para estudar morfologia, cinética e composição de NETs. Essa técnica é outro método que proporciona a possibilidade de estudar NETs em saúde e doença. Tripano azul, PKH e PFA devem ser manuseados com luvas e não devem ser respirados diretamente.