Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume
19 de março de 2019
Aqui nós apresentamos um protocolo para a combinação de duas técnicas de processamento de amostra, de alta pressão congelamento e processamento de amostra assistida por microondas, seguido por resina mínima incorporação para a aquisição de dados com um íon focalizado feixe microscópio eletrônico (FIB-SEM). Isso é demonstrado usando uma amostra do nervo tibial de rato e Caenorhabditis elegans.
Esta técnica de preparação de amostras foi projetada para combinar a melhor qualidade de preservação da ultraestrutura com o contraste mais adequado para a modalidade de imagem em um microscópio eletrônico de varredura de feixe de íons focado. Este protocolo é especialmente útil para amostras que requerem preparação por congelamento de alta pressão para uma preservação confiável da ultraestrutura, mas não obter contraste suficiente durante a substituição de congelamento por imagens de volume. Para a incorporação mínima de resina, é essencial remover o máximo de resina possível para permitir o direcionamento adequado mais tarde no microscópio eletrônico de varredura de feixe de íons focalizado.
Para começar, use a pipeta para gotejar uma gota de PBS PVP de 20% no tapete de corte. Mergulhe o nervus tibialis dissecado na gota. Use o bisturi para cortar o comprimento de dois milímetros da amostra.
Use fórceps finos para colocar a amostra em um porta-amostras metálicas tipo A de 0,2 milímetros de profundidade. Transfira o porta-aviões para a placa do meio do cartucho. Coloque o portador tipo B revestido de hexadecano na parte superior como uma tampa.
Feche o conjunto baixando a metade superior do cartucho. Feche o cartucho de três peças na estação de carregamento do congelador de alta pressão. Pressione o botão do processo e proceda de acordo com as instruções de funcionamento do fabricante.
Em um banho de nitrogênio líquido, coloque os portadores de amostras em frascos criográficos contendo dois mililitros de ácido tânnico congelado e acetona e feche as tampas. Coloque os frascos criográficos na unidade de substituição de congelamento fixada a menos 90 graus Celsius. Inicie o programa e mantenha as amostras lá por 100 horas.
Na unidade de substituição congelante, lave as amostras com dois mililitros de acetona três vezes por 30 minutos. Coloque 2%de tetroxida de mossmium em acetato de urânyl de 0,1% na unidade de substituição de congelamento para resfriamento e adicione-o às amostras para uma coloração contínua de sete horas a menos 90 graus Celsius. Quando a temperatura do programa na unidade de substituição de congelamento atingir menos 20 graus Celsius, mantenha as amostras lá por mais 16 horas.
Quando a temperatura subir para 4 graus Celsius, descarte o líquido nos frascos e preencha a acetona pura. Remova os frascos criográficos da unidade de substituição de congelamento. O manuseio da amostra antes de congelar e depois da osmoficação é fundamental, uma vez que a amostra pode ser severamente danificada.
Em um capô de fumaça, use fórceps finos para remover os carregadores de metal dos frascos criogenos e transfira as amostras dos portadores para submerse-as em um prato de vidro de relógio de 150 milímetros cheio de acetona. Use fórceps finos para transferir as amostras em dois tubos de reação mililitros cheios de acetona. Coloque o micro-ondas em 250 watts por 40 segundos e inicie o micro-ondas para lavar as amostras e repita quatro vezes.
Pipeta um mililitro de solução de 1%thiocarbohydrazida no tubo de reação e colocá-lo no micro-ondas. Ligue a função de vácuo com dois minutos de funcionamento e dois minutos de folga, iterando por um total de 14 minutos e coloque-a em 150 watts. Ligue o micro-ondas.
Lave a amostra quatro vezes em acetona como anteriormente. Pipeta um mililitro de solução de tetroxida de 2%de ósmio no tubo de reação. Coloque a amostra no micro-ondas e use as mesmas configurações de micro-ondas que com o tiocarbohydrazida.
Lave a amostra quatro vezes em acetona como anteriormente. Pipeta um mililitro de 25% de resina em acetona no tubo de reação e colocá-lo no micro-ondas. Ligue a função de vácuo por três minutos e coloque-a em 250 watts.
Ligue o micro-ondas. Use um palito para remover o nervus tibialis do tubo de reação e colocá-los em um pedaço de filme plástico. Coloque uma lâmpada halógena perto das amostras para aquecer a resina.
Usando um palito, empurre suavemente a amostra ao redor do filme plástico até que nenhuma resina restante seja detectada. Coloque o filme plástico com a amostra em cima no forno e coloque a temperatura em 60 graus Celsius para polimerizar as amostras por pelo menos 48 horas. Use uma lâmina de barbear para cortar as amostras polimerizadas juntamente com a filme de plástico em um tamanho que se encaixa no stub SEM.
Use um palito para adicionar resina de prata condutiva nos stubs SEM e anexar as amostras cortadas a ele. E então adicionar resina ao redor das amostras. Coloque os stubs SEM no forno para polimerizar a 60 graus Celsius por pelo menos 4 horas ou durante a noite.
Após a polimerização, posicione os stubs SEM em um revestimento de sputter. Coloque o cabador de sputter em 35 miliamperes e aplique 10 nanômetros de revestimento dourado ou casaco por um minuto. Após o revestimento, coloque os stubs SEM dentro do microscópio eletrônico de varredura de feixe de íons focado.
Neste estudo, foi realizado um protocolo aprimorado para nervus tibialis do camundongo, bem como C.elegans para ilustrar a preservação ideal e contraste para realizar imagens de volume 3D com um microscópio eletrônico de varredura de feixe de íons focalizado. Protocolos padrão muitas vezes sofrem de falta de contraste de membrana, enquanto o protocolo aprimorado fornece um forte contraste de membrana. As imagens de seção transversal de C.elegans com protocolo aprimorado e protocolo padrão mostram uma diferença distinta.
Assim como para as imagens de seção transversal de nervus tibialis, o protocolo aprimorado ajuda a mostrar um contraste de membrana mais forte em comparação com o protocolo padrão. Após o pós-processamento, os dados do microscópio eletrônico são visualizados usando iMOD, um programa de processamento e modelagem de imagens. A área de destaque azul mostra axônios segmentados.
A área de destaque vermelho mostra os pacotes Remak. As áreas de destaque amarelo e laranja mostram baias de mielina. E a área de destaque para turquesa mostra mitocôndrias.
A relicção virtual e o modelo tridimensional ilustram a arquitetura de tecido fino e ajudam a entender sua função. Outros métodos de microscopia eletrônica de varredura de volume podem ser usados, bem como microscopia eletrônica de varredura em bloco serial e tomografia de matriz. Este protocolo também pode ser usado para a microscopia eletrônica de transmissão e outros tipos de amostra, como amostras do sistema nervoso central.
Tetroxida de ósmio, tiocarbohidrozida e acetato de urânyl são produtos químicos tóxicos e devem ser usados cuidadosamente. A resina também é prejudicial e deve ser usada com cuidado. Equipamentos de proteção individual, como luvas e jaleco devem ser usados para o protocolo completo.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo aprimorado de preparação de amostras que combina congelamento sob alta pressão e processamento assistido por micro-ondas para melhorar a preservação da ultraestrutura e o contraste na imagem. Utilizando o nervo tibial de camundongo e Caenorhabditis elegans como sistemas modelo, a técnica demonstra vantagens significativas em relação aos protocolos padrão quanto ao contraste de membrana e às capacidades de imagem 3D.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Microscopia
- Técnicas de imagem
- Preparação de amostras
Contexto
- A preservação da ultraestrutura é essencial para uma imagem eficaz.
- Protocolos padrão frequentemente não fornecem contraste adequado para tecidos específicos.
- A combinação de múltiplas técnicas pode melhorar os resultados de imagem.
Métodos Utilizados
- Congelação por alta pressão e processamento de amostras com assistência de micro-ondas
- Nervo tibial de camundongo e Caenorhabditis elegans
- Microscopia eletrônica de varredura com feixe de íons focalizados (FIB-SEM)
Resultados Principais
- O protocolo aprimorado proporciona um contraste de membrana superior em comparação com os métodos padrão.
- As imagens de seção transversal ilustram diferenças distintas na visualização estrutural.
- Os resultados apoiam a eficácia do protocolo para imagens detalhadas de volume 3D.
Conclusões
- Este estudo demonstra que a combinação de técnicas específicas de processamento melhora significativamente a qualidade da imagem.
- O protocolo é relevante para diversas amostras biológicas e pode auxiliar na compreensão da arquitetura tecidual.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo aborda uma lacuna crítica na imagem ultraestrutural onde a congelação padrão por alta pressão não fornece contraste suficiente para a imagem volumétrica em FIB-SEM. Ao aumentar o contraste da membrana por meio de coloração assistida por micro-ondas e inclusão mínima em resina, permite a reconstrução tridimensional confiável de tecidos neurais. Isso apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas em pipelines de descoberta em neurociência, fornecendo dados estruturais preditivos e de alta fidelidade.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da preservação da ultraestrutura e do contraste de membrana aprimorado em tecidos neurais.
- Valor Operacional: Reduz a ambiguidade em estudos de engajamento de alvo ao fornecer visualização clara das arquiteturas axonal e da mielina.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados com saídas ultraestruturais quantitativas para triagem de compostos posteriores.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio de realce de contraste consistente e inclusão mínima em resina.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem relevante para doenças ao preservar a arquitetura fina dos tecidos em amostras do sistema nervoso central.
- Valor Operacional: Permite a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica por meio da geração reprodutível de dados tridimensionais de volume.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a identificação do alvo até a avaliação pré-clínica, especialmente para programas voltados para neurociência que exigem validação estrutural.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao resolver estruturas subcelulares essenciais para a função neural.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios por meio de amostras reprodutíveis e de alto contraste, adequadas para fluxos de trabalho automatizados de imagem por FIB-SEM.
- Análises: Gera dados morfométricos quantitativos (por exemplo, diâmetro do axônio, espessura da bainha de mielina) que permitem análise comparativa entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar a arquitetura tecidual relevante para mecanismos de doenças em neuropatias.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para validação ultraestrutural em diversos programas com alvos neurais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da redução da ambiguidade mecanicista na ultraestrutura neural.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade do preparo de amostras para campanhas de imagem de alto volume.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar/não avançar melhoradas por meio de biomarcadores estruturais confiáveis, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados em programas do SNC.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de alvos neurais com base em fenótipos ultraestruturais validados.
Considerações de Implementação
- É necessária experiência em congelação sob alta pressão, processamento assistido por micro-ondas e microscopia eletrônica.
- É essencial o acesso a congeladores sob alta pressão, processadores de micro-ondas, FIB-SEM e sputter coaters.
- A padronização entre equipes envolvendo unidades de histologia, imagem e análise de dados é necessária para resultados consistentes.
- A adaptação entre sistemas modelo (por exemplo, camundongo, C. elegans, tecido humano) requer otimização dos tempos de coloração e inclusão.
- As limitações práticas incluem o manuseio de reagentes tóxicos (tetróxido de ósmio, acetato de uranila) e tempos prolongados de processamento para substituição por congelação e polimerização.
